植物细胞壁降解酶之间的融合蛋白及其用途的制作方法

专利名称：：植物细胞壁降解酶之间的融合蛋白及其用途的制作方法植物细胞壁降解酶之间的融合蛋白及其用途本发明涉及构建并超量生产经遗传加工的多功能的植物细胞壁降解酶，以及它们作为用于回收再利用农业副产品的改良的酶工具的用途。农业废物是用于木质纤维生物转化的巨大的可再生资源。食品工业的生产每天都生成了大量的这些被当作需废弃的污染性废物的副产品。在生物
技术领域：
，己经对这些副产品的回收再利用做了很多研究。在可回收再利用的组分中，阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基-肉桂酸)是非常吸引人的酚化合物，已知它是植物界中最为丰富的羟基肉桂酸。例如，阿魏酸可以用作抗氧化剂(23)或者可以通过微生物转化被转化成"天然的"香草醛，这是一种用于食品、化妆品和制药工业中的昂贵的香料(4,26)。在农业副产物中，玉米和小麦麸皮都是潜在的底物，因为它们的植物细胞壁内都有着高含量的阿魏酸，分别为3%和l%(w/w)(43)。在植物生理学中，阿魏酸是一种有着重要理化性能的植物细胞壁的重要结构组分。事实上，它可以作为木质素和碳水化合物之间或碳水化合物本身之间的交联剂(16)，影响着细胞壁的完整性，并因此降低微生物酶造成的生物可降解性的程度(6)。微生物进化出能够水解将阿魏酸连接于植物细胞壁多糖上的酯键的酶，例如阿魏酸酯酶(EC3.1丄73)。这些酶为其他的木质纤维素裂解酶提供了对多糖骨架的更为有利的可接近性(综述见于12)。先前的研究证实阿魏酸酯酶与主链降解酶例如p-(l,4)-内切木聚糖酶(p-(l,4)-endoxylanase)协同作用，以便增加植物细胞壁释放阿魏酸，并生成应用所必需的足够量的阿魏酸(2,15,50)。丝状真菌例如黑曲霉G4^^^7/usw/ger)是公知的植物细胞壁降解酶的生产者。己经从黑曲霉中克隆出两个不同的编码阿魏酸酯酶的基因(10,11)，并在巴斯德毕赤氏酵母CP/c/^poston》和黑曲霉中超量生成了相应的重组蛋白(24,30,41)。己经纯化并表征出一些真菌的阿魏酸酯酶(18,47)，但是还没有克隆出基因。先前研究报道从绳状青霉(PemW///"m/w"/cw/w謂)中分离出了第一个具有与碳水化合物结合分子(CBM)家族l非常相似的C末端区的真菌的肉桂酸酯酶(B型)(27)。许多来自厌氧和需氧微生物的糖基水解酶都有着模块(modular)结构。除了催化区外，一个或多个非催化的CBM可以位于N末端或C末端或者位于两端。CBM已经被分成具有相似的氨基酸序列和3D结构的家族(http:〃afinb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html)。CBM在不可溶性底物的降解方面有着重要作用(45)。例如，它们负责保持催化核心区接近于底物，增加接触的作用时间和亲密性。此夕卜，在一些情况中，CBM也可以通过削弱簇集纤维素链的氢键来变更纤维素的微纤维结构(13,14,33)。本发明涉及关于真菌例如黑曲霉的游离的和融合的细胞壁降解酶之间的协同作用的想法。在最近一个基于经遗传加工的细菌纤维素体的研究中，两个催化组分的物理接近容许观察到增加了对顽强底物的协同作用(17)。本发明者据此设计出了连接真菌的阿魏酸酯酶和梭状芽孢杆菌的停靠蛋白(Dockerin)区的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白与第二种酶一起被植入到细菌的含CBM的骨架蛋白内(31)。但是，重组蛋白的产量不足以进行工业规模的试验性应用，还需要新的策略。在本研究中，发明者融合了经高糖基化连接肽分离开的两个真菌酶黑曲霉的阿魏酸酯酶(FAEA)和木聚糖酶(XYNB)，获得了具有增加了的阿魏酸释放效率的双功能酶(FLX)。此外，发明者在第二个构建体中还在该双功能酶的C末端添加了来自黑曲霉纤维二糖水解酶B(CBHB)的真菌CBM(FLXLC)。在黑曲霉中成功地生成了两个杂交酶，并在生物化学和动力学方面进行了充分表征，最终将其用于释放天然底物(玉米和小麦麸皮)中的阿魏酸。本研究的目的是通过使用游离的或融合的酶来比较阿魏酸释放效率，以便研究通过真菌酶的物理接近所生成的酶的协同作用。此外，在FLXLC构建体中还研究了在双功能酶的C末端添加CBM的作用。本发明基于如下发现，即与应用游离的植物细胞壁降解酶相比较，在植物细胞壁降解酶(所述酶是那些本身不含CBM的斷的一种嵌合蛋白中，融合体产生了协同作用。本发明的主要目的因此是提供植物的不含CBM的细胞壁降解酶之间的新的融合蛋白。本发明的另一个目的是提供用于通过将所述融合蛋白应用于作为底物的植物以及优选地农业副产品来制备与植物细胞的细胞壁相连的感兴趣的化合物的新方法。本发明涉及至少两个植物细胞壁降解酶(所述酶是那些不含C末端的碳水化合物结合分子(CBM)的酶)和任选地CBM之间的融合蛋白(所述酶和CBM是对应于真菌的天然蛋白或其突变形式的重组蛋白)用于在从植物或植物性副产品中制备位于植物细胞壁中的感兴趣的化合物的过程中或者在漂白纸浆和纸的过程中进行植物细胞壁降解的用途。术语"植物细胞壁降解酶"指的是能够执行细胞壁组分例如纤维素、半纤维素和木质素的消化的酶。所述融合蛋白中的植物细胞壁降解酶彼此是相同的或不同的酶。术语"C末端的碳水化合物结合分子"指的是对纤维素具有亲和力的分子，所述分子能够将与其相连的酶靶向于纤维素。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中不含CBM的植物细胞壁降解酶是选自如下的水解酶-纤维素酶，例如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶、或(3-葡糖苷酶；-半纤维素酶，例如木聚糖酶；-能够降解木质素的木质酶，例如漆酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶(versatileperoxidase),或辅助酶例如纤维二糖脱氢酶、和芳香醇氧化酶；-能够释放肉桂酸例如阿魏酸并能够水解半纤维素链之间的二阿魏酸交联的肉桂酸酯水解酶，例如阿魏酸酯酶、肉桂酸酯酶、和绿原酸水解酶。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中不含CBM的植物细胞壁降解酶选自阿魏酸酯酶和木聚糖酶。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中不含CBM的植物细胞壁降解酶对应于来自选自如下所述真菌的天然的酶或其突变形式-子囊菌纲，例如曲霉属，更具体的是黑曲霉；-担子菌纲，例如密孔菌属或i/"/oo^/z/"a属，更具体的是朱红密孔菌(尸yc"o/omsc/""afZflr/"Mj)、血红密孑L菌(/^c"o/orwjsa"gw/"e—、或//a/oc>p/'"aW〃osa;本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中不含CBM的植物细胞壁降解酶对应于来自曲霉属例如黑曲霉的天然的酶或其突变形式。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中至少一种不含CBM的植物细胞壁降解酶是选自如下的阿魏酸酯酶-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A，由SEQIDNO:l表示的核酸编码；-或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B，由SEQIDNO:3表示的核酸编码。本发明更具体地涉及如上定义的用途,其中至少一种不含CBM的植物细胞壁降解酶是如上定义的木聚糖酶，例如以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B，由SEQIDNO:5表示的核酸编码。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中的CBM蛋白选自来自真菌的天然酶中或其突变形式中的CBM，所述真菌选自子囊菌纲例如曲霉属以及更具体的黑曲霉。可以用于本发明的CBM是家族1中的那些CBM。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中CBM是黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的CBM，以SEQIDNO:8表示，由以SEQIDNO:7表示的核酸编码。本发明也涉及融合蛋白的如上定义的用途，所述融合蛋白在所述融合蛋白所包含的至少两个蛋白之间包含连接物，所述连接物是10到100个氨基酸长度的多肽，有利地是约为50个氨基酸的多肽。本发明更具体地涉及融合蛋白的如上定义的用途，其中在所述融合蛋白所包含的各个蛋白之间都含有连接物。本发明更具体地涉及如上定义的用途，其中连接物是高糖基化的多肽，例如黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的以SEQIDNO:10表示的序列，由以SEQIDNO:9表示的核酸编码。本发明也更具体地涉及阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任选地CBM之间的融合蛋白的如上定义的用途。本发明更具体地涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白的如上定义的用途。本发明更具体地涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白的如上定义的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:10表示的作为前述两个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示。本发明也涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的CBM之间的融合蛋白的如上定义的用途。本发明更具体地涉及以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白的如上定义的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:IO表示的作为前述三个蛋白中各个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示。本发明更具体地涉及以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白的如上定义的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:10表示的作为前述两个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示。本发明更具体地涉及以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的CBM之间的融合蛋白的如上定义的用途。本发明更具体地涉及以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白的如上定义的用途，所述融合蛋白包含以SEQIDNO:IO表示的作为前述三个蛋白中各个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。本发明也涉及如上定义的用途，其用于在制备以下感兴趣的化合物的过程中或在漂白纸浆和纸的过程中实现植物细胞壁降解过程-生物乙醇；-抗氧化剂，例如阿魏酸或咖啡酸，其是肉桂酸、和羟基酪醇(hydroxytyrosol)、或没食子酸；-香料，例如分别通过阿魏酸或对香豆酸的生物转化而获得的香草醛或对羟基苯甲醛。本发明也涉及如上定义的用途，其中所述融合蛋白被直接加入到作为底物的植物或植物性副产品中，或者所述融合蛋白是由经编码所述融合蛋白的核酸转化的真菌细胞所分泌的，所述真菌是例如如上提及的真菌以及更具体的是黑曲霉和朱红密孔菌，所述真菌与作为底物的所述植物或植物性副产品接触。本发明也涉及用于从植物或植物性副产品中制备位于植物细胞壁的感兴趣的化合物的植物细胞壁降解的方法，其中所述方法包括以下步骤-用如上定义的融合蛋白或如上定义的转化的真菌细胞酶性处理植物或植物性副产品或工业废物；-任选地，用蒸汽闪爆(steamexplosion)对植物或植物性副产品进行物理性处理并联合融合蛋白的作用；-任选地，用合适的微生物或酶对在上面的酶性处理期间从细胞壁中释放出的化合物进行生物转化；-对在上面的酶性处理期间从细胞壁中释放出的或在上面的生物转化步骤中获得的感兴趣的化合物的回收，以及必要时的纯化。优选地，在本发明的方法中，经融合蛋白处理的植物选自甜菜、小麦、玉米、水稻、或所有用于造纸工业的树木。优选地，在本发明的方法中，经融合蛋白处理的植物性副产品或工业废物选自麦秆、玉米麸皮、小麦麸皮、水稻麸皮、苹果渣、咖啡渣、咖啡副产品、橄榄压榨废液。本发明更具体地涉及如上定义的用于制备作为感兴趣的化合物的抗氧化剂的方法，所述方法包括-用包含至少两种如下的不含CBM的细胞壁降解酶的融合蛋白处理植物或植物性副产品阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、绿原酸水解酶、木聚糖酶，其中融合蛋白优选地选自阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、绿原酸水解酶-木聚糖酶；-对从所述植物或植物性副产品中释放出的抗氧化剂的回收以及必要时的纯化。本发明更具体地涉及如上定义的用于制备作为感兴趣的抗氧化剂的肉桂酸例如阿魏酸的方法，其中所用的融合蛋白含有如上定义的阿魏酸酯酶和木聚糖酶、以及任选地CBM,且更优选地选自SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16和SEQIDNO:18。有利地，在制备抗氧化剂例如阿魏酸的过程中，经如上定义的融合蛋白处理的植物选自以下植物甜菜、小麦、玉米、水稻；或者经如上定义的融合蛋白处理的植物副产品或工业废物选自以下副产品或废物小麦麦秆、玉米麸皮、小麦麸皮、水稻麸皮、苹果渣、咖啡渣、咖啡副产品、橄榄压榨废液。本发明也涉及如上定义的用于制备作为感兴趣的化合物的香料的方法，所述方法包括-用在如上定义的制备抗氧化剂过程中使用的融合蛋白处理植物或植物性副产品；.-通过用选自子囊菌或担子菌例如分别为黑曲霉或朱红密孔菌的微生物产生的非限定的酶接触所述化合物对在前述步骤期间从细胞壁中释放出的化合物进行生物转化；-对在前述的生物转化步骤中获得的香料的回收以及必要时的纯化。本发明更具体地涉及如上定义的用于制备作为感兴趣的香料的香草醛的方法，其中所用的融合蛋白选自那些用于制备如上定义的阿魏酸的融合蛋白，以及通过用由子囊菌或担子菌例如分别为黑曲霉或朱红密孔菌产生的非限定的酶接触从植物细胞壁中释放出的阿魏酸来实施生物转化步骤。有利地，在制备香料例如香草醛的过程中所用的植物和植物性副产品或工业废物选自上面提及的那些用于制备抗氧化剂的植物和植物性副产品或工业废物。本发明也涉及如上定义的用于制备作为感兴趣的化合物的生物乙醇的方法，所述方法包括-用包含至少两种如下的不含CBM的植物细胞壁降解酶的融合蛋白处理植物或植物性副产品纤维素酶、半纤维素酶、酯酶、漆酶、过氧化物酶、芳香醇氧化酶，其中融合蛋白优选地选自内切葡聚糖酶-外切葡聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、木聚糖酶-纤维素酶(内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶)，所述处理有利地可以联合对所述植物或植物性副产品的物理性处理；-通过使用上述的融合蛋白或分泌融合蛋白的转化的真菌，并联合选自纤维素酶、半纤维素酶或酯酶的酶、或选自子囊菌的微生物例如黑曲霉或里氏木霉(7Hc/^Armawwez')，将从前述步骤中获得的处理过的植物或植物性副产品生物转化为可发酵糖；-用酵母将可发酵糖生物转化成生物乙醇。本发明更具体地涉及如上定义的用于制备用于后继的生物乙醇生产的可发酵糖的方法，其中融合蛋白选自内切葡聚糖酶-外切葡聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、木聚糖酶-纤维素酶(内切葡聚糖酶或外切葡聚糖酶)。有利地，用于生物乙醇制备过程中的植物或植物性副产品或工业废物选自木材、一年生植物、或农业副产品。本发明也涉及用于漂白纸浆和纸的方法，所述方法包括-对植物或植物性副产品进行化学和物理处理并联合包含至少两种如下的不含CBM的植物细胞壁降解酶的融合蛋白处理阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、木聚糖酶、漆酶、芳香醇氧化酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶或纤维二糖脱氢酶；-任选地，用分泌包含至少两个如下的不含CBM的植物细胞壁降解酶的融合蛋白的转化的真菌对在前述步骤中获得的处理过的植物或植物性副产品进行生物制桨阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、木聚糖酶、漆酶、芳香醇氧化酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶或纤维二糖脱氢酶；-用包含至少两个如下的不含CBM的植物细胞壁降解酶的融合蛋白对在前述步骤中获得的处理过的植物或植物性副产品进行生物漂白阿魏酸酯酶A、阿魏酸酯酶B、木聚糖酶、漆酶、芳香醇氧化酶、锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、通用过氧化物酶或纤维二糖脱氢酶。本发明更具体地涉及如上定义的用于漂白纸浆和纸的方法，其中在处理植物和植物性副产品的第一个步骤中所用的融合蛋白选自阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、芳香醇氧化酶-锰过氧化物酶；在生物制浆步骤中所用的转化的真菌所分泌的融合蛋白选自朱红密孔菌或黑曲霉过量产生的阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、芳香醇氧化酶-锰过氧化物酶；以及生物漂白步骤所用的融合蛋白选自阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶A-木聚糖酶、阿魏酸酯酶A-阿魏酸酯酶B-木聚糖酶、漆酶-木聚糖酶、芳香醇氧化酶-锰过氧化物酶。本发明也涉及至少两种不含C末端的碳水化合物结合分子(CBM)的植物细胞壁降解酶和任选地CBM之间的融合蛋白，所述酶和CBM是如上定义的对应于真菌中的天然蛋白或其突变形式的重组蛋白。本发明更具体地涉及如上定义的融合蛋白，其在所述融合蛋白所包含的蛋白中的至少两种蛋白之间包含连接物，所述连接物是如上定义的连接物。本发明更具体地涉及如上定义的阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任选地CBM之间的融合蛋白。本发明更具体地涉及如上定义的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白。本发明更具体地涉及如上定义的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的作为前述两个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示。本发明更具体地涉及如上定义的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的CBM之间的融合蛋白。本发明更具体地涉及如上定义的以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的作为前述三个蛋白中各个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示。本发明更具体地涉及如上定义的以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的作为前述两个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示。本发明也涉及如上定义的以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:8表示的黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的CBM之间的融合蛋白。本发明更具体地涉及如上定义的以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的木聚糖酶B和以SEQIDNO:6表示的CBM之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的作为前述三个蛋白中各个蛋白之间的高糖基化连接物的序列，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。本发明也涉及编码如上定义的融合蛋白的核酸。本发明更具体地涉及编码以SEQIDNO:12、14、16和18表示的融合蛋白的核酸，分别以SEQIDNO:ll、13、15和17表示。本发明也涉及以SEQIDNO:19和21表示的对应于SEQIDNO:ll和13的核酸，其中用编码对应于SEQIDNO:24的阿魏酸酯酶A前体的序列SEQIDNO:23取代序列SEQIDNO:l，所述核酸SEQIDNO:19和21编码对应于序列SEQIDNO:20和22的融合蛋白的前体蛋白。本发明也涉及以SEQIDNO:25和27表示的对应于SEQIDNO:15和17的核酸，其中用编码对应于SEQIDNO:30的阿魏酸酯酶B前体的序列SEQIDNO:29取代序列SEQIDNO:3，所述核酸SEQIDNO:25和27编码对应于序列SEQIDNO:20和22的融合蛋白的前体蛋白。本发明也涉及经如上定义的核酸转化的载体例如pAN52.3。本发明也涉及通过使用上面提及的载体经如上定义的核酸转化的宿主细胞例如子囊菌或担子菌，以及更具体地是黑曲霉或朱红密孔菌。本发明也涉及用于制备如上定义的融合蛋白的方法，包括体外培养如上定义的宿主细胞，回收以及必要时纯化经培养所述宿主细胞生成的融合蛋白。通过对嵌合酶FLX(SEQIDNO:12)和FLXLC(SEQIDNO:14)的制备和性能的详细描述进一步地阐述了本发明。设计并在黑曲霉中成功地超量产生了两种嵌合酶FLX和FLXLC。FLX构建体是由编码与黑曲霉的内切木聚糖酶B(XYNB)相融合的阿魏酸酯酶A(FAEA)的序列组成的。将C末端的碳水化合物结合分子(家族ICBM)植入到FLX，生成了第二个杂交酶FLXLC。在各个伴侣之间都包括高糖基化连接物，以便稳定构建体。将杂交蛋白纯化到均质，估计FLX和FLXLC的分子量分别是72kDa和97kDa。用免疫检测法检査杂交酶的完整性，所述方法使用针对FAEA所产生的抗体和针对多His标签所产生的抗体，结果显示出单一的形式。双功能酶的各个催化模块的理化性能对应于那些游离酶的性能。另外，我们检查发现FLXLC表现出对微晶体纤维素(Avicel)的强亲和力，结合参数相当于解离常数为Kd9.910_8M而结合力为0.98nmol/gAvicd。研究了两个双功能酶从天然底物玉米和小麦麸皮中释放出阿魏酸的能力。与游离酶FAEA和XYNB相比较，通过使用FLX和FLXLC在两个底物中都得到了更高的协同作用。此外，对于利用玉米作为底物的阿魏酸释放而言，与FLX相比，FLXLC的协同作用是增加的，确认了CBM的积极作用。总而言之，这些结果说明黑曲霉的天然游离细胞壁水解酶的双功能酶和CBM的融合能够增加对降解复杂底物的协同作用。材科和方法茵抹和培养基大肠杆菌JM109(Promega)被用于构建和繁殖载体，黑曲霉株D15弁26(22)被用于生产重组蛋白。在用分别含有p,G基因和表达盒FLX或FLXLC的载体共转染之后(图1)，在固体基本培养基(无尿嘧啶核苷)生长黑曲霉进行选择，所述培养基含有70mMNaNO3、7mMKCl、11mMKH2HP04、2mMMgS04、1%葡萄糖(w/v)和微量元素[1000x母液76mMZnS04、25mMMnCl2、18mMFeS04、7.1mMCoCl2、6.4mMCuS04、6.2mMNa2Mo04、174mM乙二胺四乙酸(EDTA)]。为了在液体培养基中筛选出用于重组蛋白生产的转化体，在500mL带挡板的烧瓶中，用lxlO6ml"个孢子接种100ml含有70mMNaN03、7mMKCl、200mMNa2HP04、2mMMgS04、6%葡萄糖(w/v)和微量元素的培养基。用黑曲霉BRFM131(BanquedeRessourcesFongiquesdeMarseille)进《亍基因组DNA提取，并将所得到的DNA用作用于连接物-cbm序列的PCR扩增策略中的模板。泉达我体的构建和真菌祐化用重叠延伸PCR法(25)进行来自黑曲霉的编码FAEA(SEQIDNO:19;Y09330)、XYNB(SEQIDNO:5;AYl26481)和CBM(SEQIDNO:7;AF156269)的序列的融合。禾U用正向引物5'-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCAAAATAC-3,(fepM)和反向引物5'-扩增出黑曲霉的FAEA编码区。用正向引物5'-AGCGGAGCTTGTACTTGGGGCTCGACTTACTCCAGT曙3'和反向引物5'-GGTCGAGCTCGGGGTCGACGCCGCCGATGTCGAACT-3'从黑曲霉BRFM131中扩增出编码CBHB的连接物区的基因组DNA(SEQIDNO:9;AF156269)。最后，用正向引物5'-AGTTCGACATCGGCGGCGTCGACCCCGAGCTCGACC-3'和反向引物5'-GGCTAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGAACAGTGATGGACGAAG-3'(W"dl1)(在所有序列中都用点下划线显示出His标签)从cDNA(29)中扩增出^"5基因。混合所形成的重叠片段，并通过使用两个外引物在一步反应中合成融合序列。将构建体克隆到pGEM-T载体(Promega)内，通过测序检查所克隆的PCR产物。将所融合的片段克隆到经M^I-77/mffll线性化的和去磷酸化的pAN52.3内，以获得pFLX质粒(图1A)。利用pFLX作为模板，用于经正向引物5'-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCAAAATAC-3'(&piTI)和反向引物5'-ACTGGAGTAAGTCGAGCCCTGAACAGTGATGGACGA-3'扩增编码重组体FAEA-连接物-XYNB的序列，构建出FLXLC质粒。将黑曲霉BRFM131的基因组DNA用作PCR扩增连接物-CBM序列的模板，使用从已有的c6/^序列(AF15269)中设计出的两个特异引物正向引物5'-TCGTCCATCACTGTTCAGGGCTCGACTTACTCCAGT-3'和反向引物5'-ATGCAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCAAACACTGCGAGTAGTAC-3'(//z'^mi)。通过利用两个外引物的重叠延伸PCR法合成融合片段，通过测序对照融合片段，并将其克隆到pAN52.3内，以获得pFLXLC载体(图1B)。在两个表达载体中，黑曲霉的甘油醛-3磷酸脱氢酶基因(gpd^启动子、mRNA的5'非翻译区、和黑曲霉的fr;C终止子都被用于驱动重组序列的表达。另夕卜，FAEA的信号肽(21个氨基酸)被用于耙向两种重组蛋白的分泌。如Punt和vandenHondel所述的那样(39),通过分别使用pFLX或pFLXLC表达载体与含/,(选择标记物的pAB4-l(48)(比例为10:1)进行两个真菌共转化。此外，使用基因而非上述表达载体转化黑曲霉D15#26，用于对照试验。在选择性基础培养基板(无尿喷瞎核苷)上选择出尿嘧啶核苷原养型的共转化体，并在30°C下温育8天。为了筛选转化体，培养并每天检查每种构建体的40个单个克隆。阿魏睃酯酶和木聚錄酶活性的辟逸在30。C的震荡培养箱(130rpm)中监测培养物14天。每天都用1M柠檬酸溶液将pH值调整为5.5。每个培养条件都一式两份进行。每天从液体培养基中收集到一部分培养基(1ml)，并通过离心去除菌丝。如先前所述的利用甲基阿魏酸(MFA)作为底物测定出酯酶活性(40)以及根据Bailey等的方法(1)通过测定从l%(w/v)白桦树木聚糖中释放出的木糖的量可以计算出木聚糖酶活性。酶与木聚糖溶液(1%(W)白桦树木聚糖，50mM柠檬酸钠缓冲液，pH5.5)在45。C下温育5分钟。以木糖作为标准物，用DNS法测定出所释放出的还原糖(35)。所有的检测均使用了空白，以便纠正酶和底物样品中的任何背景。用纳开特(nkatal，nkat)表示活性，1nkat被定义为在给定的条件下每秒钟催化释放出1nmol阿魏酸或1nmol还原糖的酶的量。每个实验都一式两份进行，一式三份进行测定，酯酶活性的标准差小于平均值的2%，木聚糖酶活性的标准差小于平均值的5%。重組蛋^/的純化在与筛选步骤中相同的条件下接种每种构建体的最好的分离株。在生长8天后收集培养物，过滤(0.7pm)并通过聚醚砜膜(分子量截断值为30kDa)(Millipore)的超滤进行浓縮。用30mMTrisHC1(pH值7.0)、结合缓冲液对浓縮部分进行透析处理，并在螯合琼脂糖快速流动柱(13x15cm)(AmershamBiosciences)(38)上进行His标记的蛋白质的纯化。考虑到游离蛋白，也在如先前所述的(29)的螯合琼脂糖快速流动柱上纯化含His-标签序列的重组木聚糖酶B。最后，如先前所述(41)用苯基琼脂糖柱一步法纯化重组FAEA。重組蚤47的表征蛋白分析和N末端氨基酸序列测定:根据Lowry等的方法(34)用牛血清白蛋白作为标准物测定出蛋白浓度。用经考马斯蓝染色的SDS-PAGE(11%聚丙烯酰胺)平板凝胶检查的蛋白产生和纯化。根据Edman降解作用，从被电印迹到聚偏氟乙烯膜(Millipore)上的FLX和FLXLC样品(IOO吗)中测定出N末端序列。在AppliedBiosystem470A上进行分析。Western印迹分析:根据Laemmli的方法(28)在11%SDS/聚丙烯酰胺凝胶中进行总蛋白和纯化蛋白的电泳，并将其在室温下电印迹到BA85硝基纤维素膜(Schleicher和Schuell)上45分钟。将膜在封闭液(50mMTris、150mMNaCl和2%(v/v)牛奶，pH7.5)中4。C温育过夜。用TBS-0.2%Tween洗涤膜，并用含按1/8000稀释的抗FAEA血清或含抗聚组氨酸过氧化物酶血清(Sigma)的封闭液处理膜。对于抗FAEA抗体，随后用缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗兔免疫球蛋白G(Promega)温育膜。根据产品说明书，用化学发光法Western印迹试剂盒(Roche)检测信号。重组蛋白的温度和PH稳定性:在30°C到70°C的范围内测试纯化的重组蛋白的热稳定性。将等分样品在给定温度下预温育，在冷却到0。C之后，然后在先前所述的标准条件下测试酯酶和木聚糖酶活性。在温育之后用SDS-PAGE分析样品，以便验证双功能蛋白的完整性。通过在拧檬酸-磷酸缓冲液(pH2.5-7.0)和磷酸钠(pH7.0-8.0)中温育纯化的重组蛋白来研究pH值对蛋白稳定性的影响。所有温育都进行90分钟，然后将等分样品转移到标准反应混合物中，以测定出剩余活性的量。在预温育之前测定出的活性作为100%。温度和PH值对酯酶和木聚糖酶活性的作用:为了测定出在所用条件下的最佳温度，在不同温度下(30。C到70。C)温育等分的纯化重组蛋白，并检测酯酶和木聚糖酶活性。用柠檬酸-磷酸缓冲液(pH2.5-7.0)和磷酸钠(PH7.0-8.0)作为标准条件测定出最佳pH值。纤维素结合能力和解离常数的测定:将纯化的FLX和FLXLC样品加入到2ml含有25mM磷酸钾缓冲液(pH7)中的纤维素的微量离心管内，终体积为lml。通过使用各种量的重组蛋白(30吗和170)Lig之间)和恒量的纤维素(2mg)测定出FLX(对照)和FLXLC结合AvicelPH101(Fluka)的能力。两种重组蛋白都在轻微搅拌下、4°C与纤维素温育lh。在离心(4000g下10分钟)之后，测定出上清液中的残余蛋白(游离的酶)的量。通过用所加入的总量减去游离FLX或游离FLXLC的量计算出与纤维素结合的酶的量。通过绘制1/结合酶对1/游离酶的双倒数曲线分析数据。解离常数被定义为1/B=(Kd/Bmaxx1/F)+1/Bmax，其中B为结合酶的浓度以及F是游离酶的浓度(21,37)。应用测式酶水解:使小麦麸皮(WB)和玉米麸皮(MB)脱桨。将这些提取物在130°C下加热处理10分钟。在恒温控制的摇晃培养箱、40。C下，在0.1M含0.0P/。叠氮化钠的3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液(pH值6.0)中进行酶水解。将WB或MB(200mg)分别和纯化的FAEA(SEQIDNO:2)、XYNB(SEQIDNO:6)、FLX和FLXLC—起温育，终体积为5ml。游离酶和双功能酶的纯化的酶浓度是每个测试均为每200mg干麸皮11纳开特酯酶活性和6496纳开特木聚糖酶活性。该比例对应于在纯化的双功能酶中所见的摩尔对摩尔条件。每个测试都一式两份进行，WB和MB的标准误都小于平均值的5%。碱可萃取的羟基肉桂酸的制备:通过在2NNaOH中加入20mgWB或MB并在暗处35°C下温育30分钟测定出碱可萃取的羟基肉桂酸的总含量。用2NHCl将pH值调整到2。用3ml醚萃取酚酸3次。将有机相转移到试管内，并在40。C下干燥。向干燥的萃取物中加入lml甲醇/1120(50:50)(v/v)，并如下一部分所述的将样品注射到HPLC系统内。将总的碱可萃取的阿魏酸含量当作100%酶水解。阿魏酸测定:用100%甲醇将酶水解物稀释到1/2，并在12,000xg离心5分f中，经0.2fim尼龙滤器(GelmanSciences,Acrodisc13,AnnArbor,MI)过滤上清液。用HPLC分析过滤液(注射液为25|il)。在装配有可调的UV/VIS检测仪、100位自动取样器-自动注射器的HP1100模块(Hewlett-PackardRockville，MD)上、280nm和30°C下进行HPLC分析。在MerckRP-18反相柱(Chromolith3.5|im,4.6*100mm，Merck)上实现分离。流速为L4ml/分钟。所用的流动相是1%乙酸和10%乙腈水溶液(A)对100%乙腈(B)，总运行时间为20分钟，梯度如下变化溶剂B开始于0。/。持续2分钟，然后在10分钟内增加到50%，3分钟内增加到100%，直到运行结束。用HP3365ChemStation处理数据，以及用外标准校准进行定量。结果;又，力能酶,品的4殳计和研免通过在两个伴侣之间加入来自编码高糖基化连接物的纤维二糖水解酶B基因(cM5)的序列遗传学融合编码阿魏酸酯酶(FAEA)和木聚糖酶B(XYNB)的黑曲霉序列(图1A)。对于第二个构建体FLXLC，将相应的融合物FLX与编码连接物-CBM的黑曲霉基因的部分序列相融合(图1B)。两个翻译融合物都被放置于强的组成型g/^4启动子和^C终止子的控制之下，具有内源性/a"信号序列，以靶向分泌。用表达载体pFLX或pFLXLC和含pyK的质粒pAB4-l的混合物共转化黑曲霉D15#26原生质体。根据其在无尿嘧啶核苷的基本培养基上生长的能力选择转化体。将每种构建体的40个转化体接种到抑制内源性和;qv"^基因表达的葡萄糖基本培养基内。对于经pAB4-l转化的对照宿主，没有检测到酯酶或木聚糖酶活性。对于两个构建体，在生长两天后的转化体的细胞外培养基中都检测到了酯酶和木聚糖酶活性(图2)。在培养期间，以同步的方式检测阿魏酸酯酶和木聚糖酶活性。最好的FLXLC和FLX转化体的活性分别从第10天和第11天开始增加，到第14天达到基本上稳定的水平。FLX和FLXLC转化体的最大酯酶活性分别达到13.0nkat/ml和9.8nkat/ml。对于木聚糖酶活性而言，所获得的FLX和FLXLC的最大活性分别是2870nkat/ml和2038nkat/ml。考虑到被结合于双功能酶中的FAEA伴侣的比活性，估计FLX和FLXLC转化体的产量分别是1.4g/L和1.5g/L。;又劝能酶的生化和动力学泉4正SDS-PAGE和Western印迹分析:在两种情况中，都用SDS/聚丙烯酰胺凝胶电泳检查所产生的蛋白(图3，泳道1和3)。在分别来自FLX和FLXLC转化体的总细胞外蛋白中观察到了72kDa和97kDa附近的主要条带。所观察到的FLX和FLXLC的分子量与理论分子量之间的差异说明分别约为12%(w/w)和26%(w/w)的糖基化。用螯合琼脂糖快流柱纯化出重组蛋白，并用SDS-PAGE对照组分的均质性(泳道2和4)。通过使用所生成的抗FAEA的抗体可以免疫检测出来自总蛋白上清液和纯化部分中的两种嵌合酶(图4A)。在FLX和FLXLC转化体的总蛋白提取物(泳道1和3)以及纯化样品(泳道2、4)中分别都显示出单一条带。也用所生成的抗C末端His标签的抗体进行免疫检测，以便对照重组蛋白的完整性，因为不能得到抗木聚糖酶或CBM的抗体(图4B)。在FLX和FLXLC中都检测到了单一条带，证实产生了作为没有任何降解形式的完整蛋白的双功能酶(泳道5到8)。阴性对照(C)证实两种抗体都是表位特异性抗体，在这些培养条件下都没有产生内源性FAEA。N末端测序:测序出FLX和FLXLC的头5个氨基酸(ASTQG)，并与天然FAEA进行排列比较。排列比较发现重组蛋白和天然FAEA之间的相同性为100%。这些结果证实FLX和FLXLC都受到了正确的加工处理。双功能酶-纤维素亲和力和结合力的分析:与FLX不同的是，FLXLC在其C末端含有来自黑曲霉纤维二糖水解酶B的CBM。进行了FLXLC与纤维素之间的相互作用检测，以便确定出CBM的结合参数。测定出FLXLC针对微晶体纤维素即AvicdPH101的纤维素结合亲和力和结合能力。所测定到的解离常数(Kd)和结合力的数值分别是9.910—8M和0.98pmol/gAvicel。如所预期的那样，没有发现嵌合酶FLX(无CBM)与纤维素之间的相互作用。生化和动力学参数为了对照有或没有CBM的两种酶伴侣的融合物是否具有每种酶的改良的特征，根据酯酶和木聚糖酶活性，对FLX和FLXLC与游离重组物FAEA和XYNB的生化和动力学参数进行比较(表1)。在pH优化和稳定性方面，在两种双功能酶和游离FAEA或XYNB之间没有发现显著差异。在温度优化和稳定性方面，只在木聚糖酶活性方面测定到了轻微改变的差异。另外，在不同的温度下温育之后，用SDS-PAGE对照FLX和FLXLC的完整性，两种双功能酶最高到45。C都是十分稳定的，在50。C发生部分裂解。测序出裂解形式的头几个氨基酸，并被鉴定为GSGSS。该序列与FLX和FLXLC的比对发现其与在连接物中发现的序列有着100%相同性。这些结果表明高糖基化连接物在最高到45°C时都是稳定的，在50°C下在GSGSS序列之前出现裂解。只在C末端裂解物(XYNB和CBM)之间裂解含有两个连接物序列的嵌合FLXLC蛋白。用肽切割器工具(19)检査两个杂合蛋白的氨基酸序列上的潜在的蛋白酶的裂解位点，在GSGSS附近没有发现裂解位点。对于动力学性能，通过用MFA和白桦树木聚糖作为底物从Lineweaver-Burk曲线中计算出了FLX和FLXLC的Michaelis常数。发现FLX和FLXLC的这些数值与游离的重组物FAEA和XYNB的数值相一致(表l)。依据阿魏酸酯酶和木聚糖酶活性测定出双功能酶的比活性，并与游离的FAEA和XYNB进行比较(表1)。双功能酶的数值接近游离FAE和XYNB的那些数值。总之，这些结果证实融合的酶模块(FAEA和XYNB)的生化和动力学参数大部分都被转化到了双功能复合物FLX和FLXLC内。小支和玉米拔支的阿魏睃的酶性幹玫为了研究双功能蛋白内的两种酶的物理接近性所生成的协同作用以及添加CBM的影响，比较了FLX和FLXLC与游离酶FAEA和XYNB的FA释放效率。所有酶都被纯化到均质，并与WB和MB相温育，因为WB和MB的细胞壁都天然地含有大量的FA。通过使用游离FAEA4禾Q16个小时之后，分别从WB中释放出4ie/。和5ie/。的总碱可提取性FA(图5A)。加入游离的XYNB使得这些百分比轻微地增加到了51%(4h)和54%(16h)。对于FLX或FLXLC的作用，我们只观察了4h温育后的总FA释放。用MB作为底物(图5B)，游离FAEA在4h和16h之后分别释放出4.2%和4.8%FA，加入XYNB不增加这些百分比。但是，FLX和FLXLC在4h水解之后分别能够释放出6.2%和7.2%。测定出协同系数(synergyfactor),并在游离(FAEA+XYNB)和融合酶(FLC禾BFLXLC)之间进行比较。如在表2中所计算出的那样，如果所计算出的比例大于l，双功能酶对于两种底物的协同作用要优于相应的游离酶。对于4h和16h后的MB的FA释放,FLXLC(1.8和1.62)的协同作用要高于FLX(1.53和1.30)。总之，这些结果显示对于两种底物的FA释放而言，双功能酶FLX和FLXLC都要比相应的游离酶(FAEA+XYNB)更为有效。此外，这些结果似乎显示出FLXLC更适用于MB作为底物的FA释放，说明了CBM生成的正面作用。结论由于其组成和结构的异质性，植物细胞壁的生物降解需要多种酶。不同的主链和辅助水解酶之间的一些组合显示出了导致有效降解细胞壁的重要的协同作用(9，12)。在本研究中，融合了黑曲霉的两种细胞壁降解酶和碳水化合物结合模块，以研究对天然底物降解的协同作用。这种杂合蛋白的构建是蛋白遗传加工的起始部分，提供了大量潜在的应用。在此，本发明的构思在于使用两种功能单元以产生改良的双功能蛋白(3，36)。常常可以在自然界找到这种多模块的结构，造成了具有一种以上酶活性或蛋白功能的酶生成。在生物
技术领域：
，已经研究了一些双功能蛋白，包括例如a-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的杂合体(44)。这个研究的结果显示与游离酶相比较，增加了在消化生淀粉方面的酶效率。在另一个研究中，构建出嵌合的木聚糖酶/内切葡聚糖酶(XynCenA)和内在CBM，但是结果显示与游离酶相比，杂合酶没有显著地影响对均质的木聚糖或纤维素底物的水解作用，但是没有研究过对天然底物的应用性测试(46)。为了评价两者细胞壁水解酶的物理接近性所形成的作用，融合了FAEA和XYNB(构建体FLX)。在第二个构建体(FLXLC)的C末端远端融合了来自黑曲霉CBHB的真菌CBM，使得双功能酶靶向于纤维素。对于两种构建体，在各个模块(FAEA、XYNB或CBM)之间都融合了高糖基化连接物肽，这基于三个主要理由。首先，已知连接物能够保留模块自由折叠以及保存彼此相对的构象自由度的能力(36)。在本研究中，两种阿魏酸酯酶和木聚糖酶都能够采用这种构象，以及遗传加工的双功能蛋白是有活性的且具有对应于游离酶的生化和动力学性能。其次，连接物的高度糖基化容许通过保护连接物避免蛋白酶活性以及最终通过避免所融合的模块之间的频繁的裂解问题(8,36)来增加蛋白序列的稳定性。观察到了这种作用，因为SDS-PAGE和Western印迹分析都显示出两种双功能酶都是稳定的。但是，杂合酶的稳定性在热处理方面显示出一些局限性。事实上，热处理对FLX和FLXLC完整性的影响显示出它们在最高到45°C都是稳定的，然后在50。C发生连接物序列的裂解。最后，如黑曲霉葡萄糖淀粉酶的高糖基化连接物所显示的那样(32)，高糖基化连接物可能对分泌有着正面作用，增加了产品产率。事实上，由于FLX和FLXLC分别存在的一个或两个连接物所形成的糖基化位点可以延长重组蛋白在内质网中的停留，据此提供附加的正确折叠所需的时间，并造成产量的增加(42)。后一理论可以解释两种双功能酶的产率都要高于相应的游离重组酶所获得的产率(29,41)的原因。为了研究协同作用是由两个酶模块的接近性所形成的，而不是在折叠期间由于蛋白构象改变所造成的酶性能的修饰形成的增益的结果，仔细地对照了各个模块的生化和动力学特征。两种双功能蛋白FLX和FLXLC的所有主要的生化和动力学性能即温度和pH稳定性、最优温度和pH,Km和比活性都处于与游离酶相同的范围之内。对于源自黑曲霉CBHB的CBM，用纤维素进行了结合检测，这种检测在过去没有被表征过(20)。Avicd纤维素有着重要的100-250个吡喃葡萄糖单位的聚合度，以及结晶相的50-60%结晶形式主要是由高等植物特征性的Ip型组成的(49)。结果显示FLXLC具有针对Avicel的亲和力，证实了CBM的结构没有受到干扰，并且CBM将其功能保留到了杂合酶内。最后测试了两种双功能蛋白FLX和FLXLC，以便研究两种互补的真菌酶的物理接近性对酶协同作用的作用以及加入CBM的影响。应用测试是基于两种天然和典型底物WB和MB的FA释放，已知WB和MB的植物细胞壁有着高含量的FA，分别接近1%和3%(w/w)(43)。两种底物都可以来自农业，并且可以回收再利用于农业-食品、化妆品和制药领域(4,26)。游离酶能够分别从WB和MB中释放出54%和4.8%的FA含量。相反的，双功能酶能够有效地释放出WB中的所有FA，以及释放出MB中最高6.3%或7.9。/。的FA，这取决于是否存在CBM。至今为止，已经用绿色木霉木聚糖酶和来自黑曲霉的FAEA获得了先前已知的WB的FA释放的结果，其中释放出了最高95。/。(w/w)总阿魏酸(15)。对于MB而言，用来自7/"脂'co/fl/rao/ms的商品化制剂Novozym342释放出了较多的FA量(最高为13.6%)(5)。但是，我们应当认识到这种商品化制剂含有不同类型的酶活性。在本研究中，用双功能酶处理释放出了WB中的所有FA，而用MB获得了不到8%的FA。尽管玉米麸皮中的阿魏酸含量要高于小麦麸皮中的含量，但是玉米麸皮中的木聚糖更多地是被木糖、阿拉伯糖和半乳糖残基(7,15)所取代。因此，用玉米的异木聚糖骨架中的取代数目、侧链存在高度分支的木糖、以及在邻近FA基团的阿拉伯糖和木糖之间存在着连接物(这严重地限制了酶的可接近性)都可以解释这种差异。最后，如果我们认为在FLXLC对MB的水解作用中CBM对FA释放显示出正面作用，那么可能是因为(i)纤维素靶向作用增加了接近于底物的酶浓度和/或(ii)纤维素结构的去稳定性使得底物是更可接近的。因此，应用测试的结论是通过使用FLX或FLXLC获得了比游离酶FAEA和XYNB更好的针对两种底物的FA释放的协同作用。普遍增强的协同作用可能是双功能酶内的各个酶伴侣的物理接近性造成的，因为杂合蛋白内的各个伴侣的所有主要生化和动力学性能都没有改变。在FLXLC中，加入C末端的CBM正面地影响着协同作用。此外，也可认为是融合模块之间的活性位点的空间定位没有受到干扰。综上所示，将互补性细胞壁水解酶例如辅助酶(FAEA)与主链裂解酶(XYNB)相结合来构建用于植物细胞壁降解的新的酶工具显示出是一种增加酶伴侣的协同作用的感兴趣的策略。对于生物技术应用而言，这种杂合蛋白的应用是对昂贵的和有污染的化学处理的替代方案或者能够提高现有的用于植物性副产品在纸浆和造纸、农业和生物燃料生产领域的回收再利用的酶方法。参者丈坎1.Bailey,M.J.，P.Biely，andK.Poutanen.1992.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J.Biotechnol.23:257-270.2.Bartobme,B.,C.B.Faulds，P.A.Kroon,K.Waldron，H.J.Gilbert,G.Hazlewood，andG.Williamson.1997.AnJ印ergi〃wsm'geresterase(feralicacidesteraseIII)andarecombinant尸sei/(io/nowas^/7即wsce/wsubsp.cellulosaesterase(XyID)releasea5-5'ferulicdehydrodimer(diferulicacid)frombarleyandwheatcellwalls.Appl.Environ.Microbiol.63:208-12.3.Beguin,P.1999.Hybridenzymes.Curr.Opin.Biotechnol.10:336-340.4.Bonnin,E.,L.Lesage-Meesen,C.Stentelaire，M.Asther，andJ.F.Thibault.1999.MethodforobtainingAw/gerculturesandtheirusesforproducingferulicacidandvanillicacid.PatentN°99/04644.5.Bonnin,E.,L.Saulnier,M.Brunei,C.Marot,L.Lesage-Meessen，M.AstherandJ.F.Thibault.2002.Releaseofferulicacidfromagroindustrialby-productsbythecellwall-degradingenzymesproducedby^戸^gz7/zwm'ger1-1472.EnzymeMicrob.Technol.31:1000-1005.6.Bunzel,M.，J.Ralph,J.M.Marita，R.D.Hatfield,andH.Steinhart.2001.Diferulatesasstructuralcomponentsinsolubleandinsolublecerealdietaryfibre.J.Sci.FoodAgric.81:653-660.7.ChanliaudE.，L.Saulnier,andJ.F.Thibault.1995.Alkalineextractionandcharacterisationofheteroxyl咖frommaizebran.J.CerealSci"21:195-203.8.Conesa，A.，P.J.Punt，N.vanLuijkandC.A.M.丄J.vandenHondel.2001.TheSecretionPathwayinFilamentousFungi:ABiotechnologicalView.FungalGenet.Biol.33:155-171.9.deVries,R.,H,C.M.Kester,C.H.Poulsen,J.A.E.Benen,andJ.Visser.2000.Synergybetweenenzymesftomv45/ergz7/iwinvolvedinthedegradationofplantcellwallpolysaccharides.Carbohydr.Res.327:401-410.10.deVriesR.P.,B.Michelsen，C.H,Poulsen,，P.A.Kroon，R,H.H.vandenHeuvel，C.B.Faulds，GWilliamson,J.P.T,W.vandenHombergh，andJ.Visser.1997,ThefaeAgenesfrom爿5^^7/w51w/gerand丄peA^7/w51ft/Z)/wge肌iencodeferulicacidesterasesinvolvedindegradationofcomplexcellwallpolysaccharides.Appl.Environ.MicrobioL63:4638-4644.11.deVriesR.P,，P.A.vanKuyk，H,C.Kester，andJ.Visser.2002.They^/erg7/wsw/g"faeBgeneencodesasecondferuloylesteraseinvolvedinpectinandxylandegradationandisspecificallyinducedinthepresenceofaromaticcompounds.BiochemJ.363:377-86.12.deVries，R.P"andJ.Visser.2001.Aperg/Z/wsenzymesinvolvedindegradationofplantcellwallpolysaccharides,Microbiol.Mol.Biol.Rev.65:497-522.13.Din,N.,Damude，H.G.,N.R.Gilkes,R.C.Jr,Miller,R.A.Warren，andD.GKilbum.1994.Cl-Cxrevisited:intramolecularsynergisminacellulase.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:11383-11387.14.Din,N.，N.R.Gilkes,B.Tekant,R.C.Jr.Miller,R.A.J.Warren,andD.GKilburn.1991.Non-hydrolyticdisruptionofcellulosefibresbythebindingdomainofabacterialcellulose.Biotechnology(N.Y.)9:1096-1099.15.Faulds,C.B.，andG.Williamson.1995.Releaseofferulicacidfromwheatbranbyaferulicacidesterase(FAE-III)from爿^/^7/wjw/ger.Appl，Microbiol.BiotechnoL463:1082-1087.16.Faulds,C.B.，andGWilliamson.1999.Effectofhydroxycinnamatesandbenzoatesontheprod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一项的融合蛋白，其是阿魏酸酯酶和木聚糖酶以及任选地CBM之间的融合蛋白，例如是-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、或以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO"0表示的序列作为前述两个蛋白之间的高糖基化连接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:12表示；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白；-以SEQIDNO:2表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶A、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的序列作为前述三个蛋白中各个蛋白之间的高糖基化连接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:14表示；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B和以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:IO表示的序列作为前述两个蛋白之间的高糖基化连接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:16表示；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和黑曲霉的纤维二糖水解酶B中的以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白；-以SEQIDNO:4表示的黑曲霉的阿魏酸酯酶B、以SEQIDNO:6表示的黑曲霉的木聚糖酶B、和以SEQIDNO:8表示的CBM之间的融合蛋白，所述融合蛋白包括以SEQIDNO:10表示的序列作为前述三个蛋白中各个蛋白之间的高糖基化连接物，所述融合蛋白以SEQIDNO:18表示。22.编码如权利要求18到21中任一项所定义的融合蛋白的核酸。23.经如权利要求22所定义的核酸所转化的载体。24.利用如权利要求23所定义的载体、以如权利要求22所定义的核酸转化的宿主细胞。25.用于制备如权利要求18到21中任一项所定义的融合蛋白的方法，包括体外培养权利要求24的宿主细胞，回收以及必要时纯化由培养物中的所述宿主细胞产生的融合蛋白。全文摘要本发明涉及至少两种植物细胞壁降解酶和任选地CBM之间的融合蛋白用于在从植物或植物性副产品中制备位于植物细胞壁内的感兴趣的化合物的过程中或纸浆和纸的漂白过程中进行植物细胞壁降解的用途，所述酶是不含C末端碳水化合物结合分子(CBM)的酶，所述酶和CBM是对应于真菌天然蛋白或其突变形式的重组蛋白。文档编号C12N15/62GK101283092SQ200680037689公开日2008年10月8日申请日期2006年7月26日优先权日2005年8月12日发明者A·勒瓦瑟,D·纳瓦罗,E·勒科尔,F·莫诺,J-P·贝莱什,M·艾瑟尔,P·蓬特申请人:国立农业研究所;法国石油研究院