专利名称：一种诊断马泰勒虫的检测试剂盒及制备与使用方法
技术领域：
本发明涉及一种动物寄生虫的检测鉴别技术，确切讲本发明提供一种快速鉴别诊 断被检马属动物是否感染马泰勒虫病的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。
背景技术：
马泰勒虫(Theileriaequi Mehlhorn et Schein, 1998)(旧名纳氏焦虫) 是原生生物界(Protista)、顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoea)、梨形虫亚 纲(Piroplasmia)、梨形虫目(Piroplasmida)的泰勒科(Theileriidae)、泰勒虫属 (Theileria)的一个新成员(旧名马巴贝斯虫(Babesia equi Laveran，1901)，原来属于 梨形虫目、巴贝斯科(Babesiidae)、巴贝斯属(Babesia)的一个成员)，该原虫是引起马 梨形虫病的两个病原之一 (Mehlhorn, H.，Schein, Ε. , 1998. Redescription of Babesia equi Laveran. 1901 as Theileria equi. Parasitol. Res. 84,467-475.)。马泰勒虫弓丨起 马属动物的疾病通称为马泰勒虫病，是经节肢动物——蜱作为媒介所传播的寄生于马属 动物(包括马、驴、骡和斑马)的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，引起动物高热、贫血、 黄疸、出血、呼吸困难、消瘦和体表淋巴结肿胀为特征的的一类血液原虫性疾病。国际兽 疫局(Office International Des Epizooties, ΟΙΕ)将其列为 B 类疫病(ΟΙΕ. Equine piroplasmosis. 2008)，我国将其列为二类疫病(1999-02-1 。在我国，马泰勒虫病主要流 行于新疆、内蒙古西部及南方各省，已证实的主要传播媒介是革蜱属和扇头蜱属的蜱，包括 草原革蜱、森林革蜱、银盾革蜱、镰形扇头蜱等(汪明主编.兽医寄生虫学[M].北京中国 农业出版社，2008 :366-369)。本病的季节流行性很强，多呈急性经过，发病率和死亡率均很 高，尤其对外来引进的马属动物、纯种马以及杂交马的危害更大，是制约发展中国家马属动 物养殖产业和发展的主要疾病之一。目前，马泰勒虫病的诊断主要有下列几种手段(1)血涂片染色显微镜检测、淋 巴结穿刺试验、体外培养、临床诊断和动物接种试验等。( 血清学方法，如补体结合试 验(CFT)、间接荧光抗体试验(IFAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和竞争酶联免疫吸附试 验(C-ELISA)等，但这些方法常会出现假阳性或漏检，参见D0nnelly，J.，Phipps, L. P.， Watkins,K. L,1982. Evidence of maternal antibodies to Babesia equi and B.cabalIi in foals of seropositive mares. Equine Vet. J. 14,126-128. ；ffeiland, G. , Aicher, B. Μ. , Boch, J. ,1984. Serodiagnosis and therapy control of equine piroplasmosis by CFT and IFAT. Berl. Munch. Tierarztl. ffochenschr. 97, 34134-34139. ；Knowles Jr., D. P. , Perryman, L. Ε. , Goff, W. L. , Miller, C. D. , Harrington, R. D. , Gorham, J. R. , 1991. A monoclonal antibody defines a geographically conserved surface protein epitope of Babesia equi merozoites. Infect. Immun. 59, 2412-2417. ；Bose, R. , Jorgensen, W. K., Dalgliesh,R. J. ,Friedhoff,K. T. ,de Vos,A. J. ,1995. Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis. Vet. Parasitol. 57,61-74. ；Briining, A. , Phipps, P.,Posnett,E. ,CanningiE. U. ,1997. Monoclonal antibodies against Babesia cabalIi and Babesia equi and their application in serodiagnosis. Vet. Parasitol. 68，11-26.； Kappmeyer, L S.，Perryman，L. Ε.，Hines，S. Α.，Baszler, Τ. V.，Katz, J. B.，Hennager, S. G.，Knowles, D. P.，1999.Detection of equine antibodies to Babesia cabalIi by recombinant B. cabalIi rhoptry-associated protein 1 in a competitive-inhibition enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol. 37，2285-2290。(3)分子检测 技术，如PCR、巢氏PCR技术、多重PCR和反向线状印迹杂交技术(RLB)等，与常规的方法相 比具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点，参见BASHIRUDDIN J. B.，CAMMA C. & REBELO Ε. (1999). Molecular detection of Babesia equi and Babesia cabalIi in horse blood by PCR amplification of part of the 16S rRNA gene. Vet. Parasitol.，84，75—83 ； SAHAGUN-RUIZ Α.，WAGNELA S. D.，HOLMAN P. J.，CHIEVES L P. & WAGNER G. G. (1997). Biotin-Iabeled DNA probe in a PCR—based assay increases detection sensitivity for the equine hemoparasite Babesia caballi· Vet· Parasitol·，73，53_630但是以上两 类方法都具有同一个不可避免的缺点一需要先进、昂贵的仪器和专业培训的技术人员， 而且检测中耗时较多，故需要研究出一种简单、方便、实用的方法来鉴别诊断马泰勒虫病， 这在临床诊断、治疗和研究中有着重要的特殊意义。
发明内容
本发明提供一种可快速鉴别诊断马泰勒虫的检测试剂盒，同时提供这种试剂盒的 使用方法。本发明的试剂盒及使用方法可克服现有技术的不足，无需复杂的仪器，且检测敏 感性较高，同时操作技术相对简单快速，不需要复杂的操作系统，可以在普通实验室条件下 实施全部检测过程。本发明的诊断马泰勒虫的检测试剂盒内至少有四条马泰勒虫特异性引物TeF3、 TeB3, TeFIP ^P TeBIP，具体序列见表 1。表1马泰勒虫特异性引物具体序列
权利要求
1.诊断马泰勒虫的检测试剂盒，其特征在于试剂盒内至少有四条马泰勒虫特异性引物 TeF3、TeB3、TeFIP 和 TeBIP,具体序列如下TeF3 :5’ -TTAGACCTAAAACCTCCCCG-3，； TeB3 :5’ -TTCCTTAGATGTGGTAGCCG-3’ ；TeFIP :5’ -CATCGCCAGCAAAGCCATGCGAATTCTTTTGCGGTGTTTCGGTG-3’ ； TeBIP :5’ -TGACCTATCAGCTTTGGACGGTGAATTCTCTCCGGAATCGAACCCT-3，。
2.根据权利要求1所述的鉴别诊断马泰勒虫的LAMP试剂盒，其特征是试剂盒内有a)标准马泰勒虫基因组DNA；b)标准驽巴贝斯虫基因组DNA；c)标准马梨形虫阴性(即，马泰勒虫和驽巴贝斯虫检测呈双阴性)的马基因组DNA;d)标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA；e)标准马梨形虫阴性的骡基因组DNA;f)灭菌超纯水；g)LAMP反应缓冲液；h)DNA聚合酶；i)由40pmol的TeFIP和TeBIP，5pmol的TeF3和TeB3组成的马泰勒虫特异引物混合物。
3.权利要求1至2所述的试剂盒的使用方法，其特征是提取待测马属动物的血液的基 因组DNA，将此基因组DNA与DNA聚合酶、缓冲液、灭菌超纯水以及试剂盒中的马泰勒虫特异 引物混合物按比例混合均勻后进行环介导的恒温扩增，扩增后立刻灭活DNA聚合酶，取扩 增产物以TAE为缓冲液，再置于含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中，进行电泳，在紫外灯下观察， 根据特定泳道是否出现特异性电泳带型确定被检动物是否患有马泰勒虫病。
全文摘要
本发明公开一种快速鉴别诊断被检马属动物是否感染马泰勒虫病的检测试剂盒，以及这种试剂盒的制备方法和使用方法。本发明的诊断马泰勒虫的检测试剂盒内至少有四条马泰勒虫特异性引物TeF3、TeB3、TeFIP和TeBIP，为方便鉴别区分工作，本发明的试剂盒内还可以有标准马泰勒虫阳性的基因组DNA；标准驽巴贝斯虫阳性的基因组DNA；标准马梨形虫阴性的马基因组DNA；标准马梨形虫阴性的驴基因组DNA；标准马梨形虫阴性的骡基因组DNA，及相关的酶、试剂等。
文档编号C12R1/90GK102146445SQ20111000353
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月6日 优先权日2011年1月6日
发明者刘光远, 田占成, 谢俊仁 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所