一种杉木原生质体的制备及纯化方法与流程

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种杉木原生质体的制备及纯化方法。

背景技术：

杉木(Cunninghamia lanceolata)为杉科杉木属乔木，是我国华南地区的重要速生用材树种之一。然而，杉木在遗传转化方面一直没有突破与进展。研究表明，原生质体由于没有细胞壁，可相对容易摄取外源遗传物质，是进行遗传转化的理想受体。

木本植物中，柑橘最先获得原生质体。目前，已有一些木本植物的原生质体分离及纯化获得成功，但绝大多数尚未建立系统、完整、成熟的原生质体分离及纯化技术体系。杉木组培苗叶片或茎段原生质体的分离方法目前尚未有见报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种杉木原生质体制备及纯化方法，其包括如下步骤：

1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片或幼嫩茎段；将叶片或茎段切断，放入酶解液中，抽真空，置于水平摇床上黑暗酶解2-4h；

2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中，用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片或茎段，用70μm的细胞筛进行过滤，滤液合并至同一离心管中，离心去上清；向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体，离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次，收集的沉淀用原生质体重悬液重悬，再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀，得到纯化的杉木原生质体。

其中，步骤1)将叶片或茎段优选切成0.5-1.5mm*0.5-1.5mm的小片或小块。

其中，摇床转速优选为100-180rpm。

其中，所述酶解液按如下方式制备：将1.5％纤维素酶，0.4％果胶酶，1％离析酶，0.5M甘露醇，20mM KCl溶于20mM MES，水浴10min，冷却后加入10mM CaCl₂，0.1-0.2％BSA。

其中，所述叶片或茎段放入酶解液中抽真空(150mbar)，时间为30-60min。

其中，优选酶解温度为25～27℃，优选的酶解时间为2h。

其中，所述原生质体清洗液优选为：150mM NaCl，120mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES，pH 5.7。

其中，所述原生质体重悬液优选为：0.5M甘露醇，4mM MES，15mM MgCl₂，pH 5.7。

本发明的有益效果是：(1)利用组培苗的叶片或茎段制备原生质体，不需对材料消毒而且材料容易获得；(2)针对杉木叶片的特性建立了相应的酶解体系和处理方法，获得的原生质体产量大、活力高；(3)纯化方法简单、易于操作且可减少细胞碎片等杂质，获得了较高纯度的原生质体；(4)本发明对木本植物提取原生质体具有一定的借鉴意义。

附图说明

图1A为50mm下杉木叶片分离得到的原生质体。

图1B为50mm下杉木叶片经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。

图1C为100mm下杉木叶片分离得到的原生质体。

图1D为100mm下杉木叶片经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。

图2A为50mm下杉木茎段分离得到的原生质体。

图2B为50mm下杉木茎段经FDA染色后的发绿色荧光的原生质体。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本发明涉及一种杉木原生质体的制备及纯化方法，所述方法包括以下步骤：

原生质体的制备

A、选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片和幼嫩茎段；

B、用酶解液酶解步骤A中选取的叶片或茎段，抽真空40min，黑暗放入水平摇床上，所述的酶解液为0.5M甘露醇，20mM KCl，20mM MES，水浴10min，冷却后加入10mM CaCl₂，0.2％BSA(茎段为0.1％BSA)；酶组合及浓度为：1.5％纤维素酶R-10、0.4％果胶酶Y-23、1％离析酶R-10；所述酶解液的pH为5.6-5.8；

C、将步骤B酶解结束后的酶液经70um网筛过滤到离心管中，用3ml预冷的W5溶液清洗酶解后的叶片或茎段，用70um的网筛将酶解液过滤至同一离心管中，300g离心3min，吸去上清；所述预冷的W5溶液，溶质为终浓度150mM NaCl，120mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES(pH 5.8)，置于4℃冰箱；

D、向步骤C中的沉淀再加入3ml预冷的W5洗液清洗原生质体，300g离心3min，移去上清后再用3ml预冷的W5溶液重复洗一次，收集的沉淀用MMG重悬；所述MMG溶液为如下终浓度的物质：0.5M甘露醇，4mM MES(pH 5.7)，15mM MgCl₂。

E、将步骤D中的细胞悬浮液再用70um网筛过滤，即得到纯化的杉木原生质体。

F、针对步骤B中对酶组合及浓度的筛选，本发明共设置了4个 不同的酶组合，均为将0.17～0.2g叶片或茎段横切放入含0.5M甘露醇的酶解液中，水平摇床上黑暗酶解3h；具体如下：

酶液浓度对原生质体产量和活性的影响：

在原生质体分离过程中，不同浓度的酶组合对原生质体产量和活性都有较大的影响。结果如表1所示，随着酶浓度的增加，原生质体的产量和活性均增加，当纤维素酶、离析酶浓度均为1％，果胶酶浓度增加到0.4％时，原生质体的产量和活性达到最高，之后随着酶浓度的增加，原生质体的产量和活性均降低，而且杂质增多。

表1不同酶组合、杉木不同组培苗材料对原生质体的影响

针对步骤B中的甘露醇浓度，本发明共设置了0.3、0.4、0.5、0.6mol/L共4个浓度的处理。结果表明，综合原生质体产量和活性来看，甘露醇浓度为0.5mol/L时，分离杉木叶片或茎段获得的原生质体最好。具体如下：

本发明设置了0.3、0.4、0.5、0.6mol/L共4个甘露醇浓度的处理，杉木叶片或茎段原生质体均在1.5％纤维素酶R-10+0.4％果胶酶Y-23+1％离析酶R-10的酶液组合下黑暗酶解3h。通过测定分离出原生质体的产量和活力，确定适宜的甘露醇浓度，见表2。

表2不同甘露醇浓度对原生质体的影响

甘露醇浓度对原生质体产量和活性的影响：

甘露醇在酶液中的主要作用是维持渗透压，当酶解液的渗透压与原生质体不能维持等渗时，原生质体会胀裂或者皱缩，适宜的渗透压是获得高产量的必要条件。甘露醇的浓度很大程度上决定了原生质体的产量和活力。

针对步骤B中对叶片(茎段)的不同处理，基于以上筛选出的最优酶组合及甘露醇浓度，酶解时间均为3h。本发明共设置了3个不同处理，即高渗处理(0.7mol/L甘露醇浸泡20-30min)、暗处理(将组培苗黑暗培养2周)和抽真空(150mbar)处理，其中暗处理和抽真空处理设置了不同的时间处理梯度，结果如表3，表明叶片放入酶液后抽真空40min对原生质体分离效果起到明显作用。

表3叶片不同处理对原生质体的影响

抽真空对原生质体产量和活性的影响：

在杉木原生质体分离过程中，由于杉木叶片表皮较厚，酶解液不容易渗入叶片进行细胞壁的酶解，而抽真空是为了使酶液能够充分渗入叶片中，更好、更快的获得原生质体。抽真空开始时，酶液中产生大量气泡，随着抽真空时间的增加，酶液中气泡逐渐减少， 当抽真空40min时，酶液不再冒泡，获得的原生质体产量和活性较好；当继续增加抽真空时间，原生质体的产量和活性下降。

针对杉木组培苗不同部位的叶片，再基于步骤A、B中筛选出的最优结果，本发明将组培苗叶片分为上部和下部，其中上部叶片为组培苗最上部未分轮的叶片，其他为下部叶片，酶解时间均为3h，通过测定分离出的原生质体产量、活性及杂质情况，确定最终结果，具体见表4。

表4组培苗不同部位叶片对原生质体质量的影响

针对酶液中BSA浓度，本发明将BSA浓度设置为0.1％、0.2％、0.5％共3个浓度梯度，其他条件均为已筛选出的最优结果，酶解3h后观察原生质体的产量和活性，确定最优的BSA浓度，结果表明：杉木组培苗叶片在0.2％BSA中原生质体产量和活力最高；茎段在0.1％BSA中原生质体产量和活力较高，具体见表5、表6。

表5不同浓度BSA对杉木幼嫩叶片原生质体的影响

表6不同浓度BSA对杉木茎段原生质体的影响

针对步骤B中的酶解时间，本发明共设置了5个酶解时间的处理。结果表明，酶解2h获得的杉木原生质体的产量和活力最高。具体如下：

酶解时间的选择：

本发明设置了1、2、3、4、5h共5个酶解时间。杉木组培苗叶片(茎段)原生质体均在甘露醇浓度0.5M、BSA浓度为0.5％时，1.5％纤维素酶R-10+0.4％果胶酶Y-23+1％离析酶R-10的酶液下进行酶解。通过测定原生质体产量和活性，确定最佳酶解时间。

酶解时间对原生质体的影响：

酶解时间是影响原生质体产量和活性的重要因素之一(表7)。实验结果表明，在酶解前期，原生质体的产量随着酶解时间的增加而逐渐升高，在2h-3h达到最高；超过3h后，原生质体产量随着酶解时间的增加而降低，同时细胞碎片逐渐增多。但酶解3h原生质体的活力比酶解2h的低，因此综合考虑，2h为分离杉木叶片或茎段原生质体的最佳时间。

表7酶解时间对杉木组培苗叶片原生质体的影响

原生质体的纯化

利用上述选择的最优分离体系充分酶解材料后酶解后，酶液用70μm网筛过滤至离心管中，用3ml预冷的W5溶液清洗酶解后的叶片或茎段，用70μm的网筛将酶解液过滤至同一离心管中，300g离心3min，吸去上清；向沉淀中加入3ml预冷的W5洗液清洗原生质体，300g离心3min，移去上清后再用3ml预冷的W5溶液重复洗一次，收集的沉淀用MMG重悬，再用70μm网筛过滤重悬的沉淀，得到纯化的杉木原生质体。

原生质体的计数

用MMG稀释原生质体，取10μl原生质体悬浮液滴加在0.1mm血球计数板上。当原生质体充满计数室后，用荧光显微镜在明场下观察，计算4个大格及中央大格(共5个大格)内的原生质体个数，然后按公式计算原生质体数，每个样品5个重复，最后计算出每克鲜重材料游离得到的原生质体产量(个/g FW)。

原生质体的活力检测

原生质体活力测定用0.01％二乙酸荧光素(FDA)染色，用荧光显微镜统计法绿色荧光的原生质体数和原生质体总数，选取5个有代表性的视野进行统计，取平均值。

原生质体活力＝(发绿色荧光的原生质体数/原生质体总数)×100％

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。