1.一种杉木原生质体制备及纯化方法,其特征在于,其包括如下步骤:
1)选取杉木组培苗最上部未分轮的叶片和/或幼嫩茎段;将叶片或茎段切断,放入酶解液中,抽真空,置于水平摇床上黑暗酶解2-4h;
2)用孔径70μm的细胞筛将酶解液过滤至离心管中,用原生质体清洗液清洗酶解后的叶片和/或茎段,用70μm的细胞筛进行过滤,滤液合并至同一离心管中,离心去上清;向沉淀中加入预冷的所述原生质体清洗液清洗原生质体,离心去上清后再用预冷的所述原生质体清洗液重复洗一次,收集的沉淀用原生质体重悬液重悬,再用70μm细胞筛过滤重悬的沉淀,得到纯化的杉木原生质体。
2.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,步骤1)将叶片或茎段切成0.5-1.5mm*0.5-1.5mm的小片或小块。
3.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,摇床转速为100-180rpm。
4.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于:所述酶解液按如下方式制备:将1.5%纤维素酶,0.4%果胶酶,1%离析酶,0.5M甘露醇,20mM KCl溶于20mM MES,水浴10min,冷却后加入10mM CaCl2,0.1-0.2%BSA。
5.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,所述叶片或茎段放入酶解液中抽真空,时间为30-60min。
6.根据权利要求5所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于,酶解温度为25~27℃,酶解时间为2h。
7.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于:所述原生质体清洗液为:150mM NaCl,120mM CaCl2,5mM KCl,2mM MES,pH 5.7。
8.根据权利要求1所述的杉木原生质体的制备及纯化方法,其特征在于:所述原生质体重悬液为:0.5M甘露醇,4mM MES,15mM MgCl2,pH 5.7。