一株分离自SPF鸡嗉囊的产植酸酶卷曲乳杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一株卷曲乳杆菌菌株，具体说是一株分离自SPF鸡嗉囊的分泌植酸酶的卷曲乳杆菌菌株及其应用。属于功能性益生菌及其应用技术领域。

背景技术：

近年来我国畜牧业发展迅速，抗生素滥用现象普遍，食用动物的抗生素滥用容易导致抗生素在动物体内积累，产生抗药性细菌，严重威胁人类健康。目前，欧盟等国家已严格限制甚至禁止抗生素作为促生长剂的使用，推动动物使用益生菌解决这些问题。传统意义的益生菌往往功能泛泛，没有明确和显著的效果。

植酸即肌醇六磷酸，是谷物、豆类等作物中磷的主要贮存形式，但单胃动物和人缺乏分解植酸的酶而难以利用该种形式的磷。为了满足正常生长、代谢的需要，需要在动物饲料中添加无机磷如磷酸氢钙，不仅造成了磷资源的浪费，不能消化吸收的随动物粪便排出体外的植酸容易造成环境污染；同时，植酸在动物胃肠道消化吸收过程中会与多种金属离子如Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺及蛋白质等营养因子螯合成不容性复合物，降低了营养因子的利用率，被称为是抗营养因子。由于磷矿石资源有限，相关原辅材料涨价以及环保要求的提高，磷酸氢钙的生产成本大大提高。植酸酶即肌醇六磷酸酶，可以将植酸分解为肌醇和无机磷，可以增加磷的利用率，降低磷污染并解除植酸的抗营养作用。

在单胃动物的饲料中添加植酸酶的效果已经被证实，植酸酶成为一种取代磷酸氢钙的新型饲料添加剂，然而植酸酶在天然植物中含量较低，提取成本昂贵；构建毕赤酵母工程菌株，发酵生产、提取运输和使用也成本高，污染和浪费严重，并且该酶的生物学特性如热稳定性、抗蛋白酶特性低，无法抵抗颗粒饲料加工过程的高温高压，对贮藏条件有较高要求。

禽类嗉囊的生理功能是暂时储存和软化食物，以利于禽类对食物充分消化和吸收。嗉囊是良好的内源益生菌栖息场所，定殖着大量益生菌，分子生态学分析表明乳杆菌科细菌在嗉囊粘膜样品中占99.74％，在嗉囊和盲肠内容物中分别占62.75％和3.09％，而在粪便中则占23.51％，其中唾液乳杆菌和卷曲乳杆菌最为普遍，对于维持动物肠道微生态平衡具有重要作用。

如果能从嗉囊中分离到产植酸酶益生菌，在嗉囊中天然定殖，大量、持续、原位发酵，可以直接降解植酸，释放无机磷，克服体外表达植酸酶的一些不足。作为新型的微生态添加剂，将从根本上改观饲料酶的格局，节约成本，减少污染和浪费，是饲料行业的福音。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一株新的分泌植酸酶的卷曲乳杆菌菌株，该菌株分离自无特定病原(简称SPF)鸡嗉囊，具有产植酸酶的特性，可以用于研制开发动物用益生菌制剂。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明卷曲乳杆菌菌株，分离自SPF鸡嗉囊内容物，经MRS固体培养基划线培养，分离纯化后获得一株卷曲乳杆菌菌株(Lactobacillus crispatus)MSY，于2016年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12928。

本发明通过以下方法从SPF鸡嗉囊内容物中分离得到上述卷曲乳杆菌菌株：将无菌蒸馏水稀释的取自SPF鸡的嗉囊内容物在MRS固体培养基上划线，挑取特征明显的菌落反复划线分离，直至分离出形态、大小一致的菌落，进行革兰氏染色，对菌体形态进行显微观察。反复接种纯化后获得。

该菌株在MRS平板上的菌落为白色，边缘不整齐，片状，中央凸起半球形，革兰氏染色观察，该菌株为典型革兰氏阳性，染色较深，显微镜下呈细长杆状，微弯成链出现，无鞭毛，无芽孢。在MRS液体培养基中生长良好，呈均匀浑浊生长，12小时在试管底部出现白色沉淀。最适生长温度为37℃。

经16s rDNA序列分析法对菌种进行鉴定，本发明所分离得到的卷曲乳杆菌菌株MSY的分类地位属于：乳杆菌属卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。

本发明分离获得的MSY菌株可以分泌植酸酶，植酸酶活性约为0.21U/ml。能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，表明本发明菌株MSY可以用于制备抗菌剂。该菌株在pH＝3.0的培养液中仍有一定的生长，具有较强的抗酸能力，还具有一定的耐胆盐能力。MSY菌剂饲喂动物，能提高钙磷利用率，改善生产性能、肠道微生态平衡。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明MSY菌株，经16s rDNA序列分析法鉴定为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，该菌株能够分泌植酸酶，植酸酶活性约为0.21U/ml。为首次分离得到的能够分泌植酸酶的卷曲乳杆菌。

(2)本发明MSY菌株是嗉囊优势定殖菌株，具有耐酸、耐胆盐特性。通过牛津杯法体外抑菌试验表明，该菌株对革兰氏阴性菌大肠杆菌及革兰氏阳性菌均具有较强的抑菌作用，呈现广谱抗菌效果，该菌株可以用于研制开发动物用益生菌制剂。

(3)本发明MSY菌株可以用于调节动物肠道菌群，将该菌剂饲喂动物(包括鸡、鸭、猪等单胃动物)具有促进生长作用，可以保持动物肠道内微生态平衡。提高动物对饲料中钙磷的吸收率，降低日粮中的钙磷添加量和减少动物粪便中钙磷排放量，保护生态环境。

(4)本发明MSY菌株与产植酸酶的工程菌株和饲喂芽孢杆菌相比，作为饲料添加剂饲喂雏鸡有很好优势：其本身是嗉囊优势定殖菌株，原位发酵，不需要工厂的各种成本；一次饲喂定殖后，可以源源不断增殖和分泌植酸酶，不需要持续地从饲料添加；天然优势菌株，安全方便。

植酸酶作为一种优良的食品和饲料添加剂，受到越来越多的重视。由于天然来源的植酸酶或者提取困难，或者分泌量太低，或者成本太高，难以满足生产需要。目前一般通过构建能高效表达植酸酶的菌株——如，毕赤酵母植酸酶工程菌来生产植酸酶。然而在利用该工程菌来发酵生产、提取运输和使用过程中也存在成本高，污染和浪费严重的问题。并且该酶的生物学特性如热稳定性、抗蛋白酶特性低，无法抵抗颗粒饲料加工过程的高温高压，对贮藏条件有较高要求。而饲喂产植酸酶的芽孢杆菌的方法，同样存在需要持续不断往饲料中添加芽孢杆菌才能满足动物需要的问题。由此，通过比较可以看出，本发明MSY菌株具有显而易见的优势。

附图说明

图1为本发明卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)MSY革兰氏染色图。

图2为本发明卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)MSY抗病原菌试验结果；

其中，A为MSY抑制大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)生长结果；

B为MSY抑制金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25913)生长结果。

图3为本发明卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)MSY耐酸试验结果；

图4为本发明卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)MSY的16s rDNA基因V3区，PCR扩增产物电泳图。

具体实施方式

下面结合具体试验方法和附图对本发明的技术方案及其所产生的技术效果进行进一步的阐述，下述说明仅是为了解释本发明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：SPF鸡嗉囊中乳酸菌的分离

试验材料：

SPF鸡：无特定病原鸡(SPF)，中国山东省农业科学院家禽所SPF研究中心。

培养基的配制：

MRS固体培养基：为一种培养乳酸菌所用的选择性培养基，每L含蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.1g，醋酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温1.0g，琼脂15g。

试验方法：

(1)样品的采集

宰杀120日龄SPF鸡，无菌打开鸡的嗉囊,用无菌手术刀取鸡嗉囊内容物放入无菌的离心管中，用无菌生理盐水稀释。

(2)鸡嗉囊中乳酸菌的分离培养

从无菌生理盐水稀释液中取3～4接种环，分别划线于MRS固体选择培养基上，然后置于37℃烛缸中培养12～24h后，分别挑取特征明显的菌落反复划线分离，直至分离出形态、大小一致的菌落，将所分离菌株进行革兰氏染色，对菌体形态进行显微观察。所得菌株命名为MSY。

试验结果：在MRS平板上的菌落为白色，边缘不整齐，片状，中央凸起半球形，革兰氏染色观察，该菌株为典型革兰氏阳性，染色较深，显微镜下呈细长杆状，微弯成链出现，无鞭毛，无芽孢，结果见图1。

实施例2：产植酸酶菌株的筛选

试验材料：

植酸钠：购自Sigma公司。

培养基配制：

MRS液体培养基：MRS液体培养基为一种培养乳酸菌所用的培养基，每L含蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.1g，醋酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温1.0g。

试验方法：

(1)菌株培养

将实施例1分离得到的菌株按MRS液体培养基体积的10％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃培养48h。

(2)测定胞外分泌的植酸酶酶活

采用以分光光度法测定植酸酶活性，其基本原理是植酸酶在一定温度和pH条件下，水解底物植酸钠，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用钒钼酸铵处理会生成黄色的[(NH4)₃PO₄NH₄VO₃·16MoO₃]复合物，在波长415nm下进行比色测定。

收集MSY菌株的菌液，离心取200μL上清，与2mL植酸酶专一性底物植酸钠(pH5.0，乙酸钠缓冲液配制，终浓度为5.0mM)混匀，于37℃温浴30min后，用2mL钒钼酸铵终止液终止反应，于415nm处测定吸光值，测定胞外植酸酶酶活。样品在植酸钠浓度为5.0mM、温度为37℃、pH为5.0的条件下，每分钟从植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活力单位，以U表示。

试验结果：实施例1分离获得的MSY菌株可以分泌植酸酶，植酸酶活性约为0.21U/ml。

实施例3：MSY菌株的生化鉴定

试验材料：

指示菌：大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 25913)。

猪胆盐试剂：购自北京奥博星生物技术有限公司。

培养基配制：

肉汤固体培养基：每L含牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g。

试验方法：

(1)MSY菌株的抗病原菌试验：

指示菌菌悬液：取待指示菌大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25913)保存液于肉汤固体培养基上进行划线(使其出现单菌落为准)，放于37℃恒温培养16h，挑取0.8mm-1.0mm单菌落于1ml无菌生理盐水中，用漩涡振荡器振荡1-2min，此时的菌液浓度约10⁷CFU/ml。

检测平板的制备：将肉汤培养基加入琼脂溶解均匀，高压灭菌，冷却到50℃左右，准确量取20ml该培养基加入内径一致并预先水平放置的培养皿内，凝固后并使培养皿中水份干燥透。

指示菌菌悬液的涂布：取20μl新鲜培养的指示菌大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25913)菌悬液(10⁷CFU/ml)在平板上均匀涂布，并用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，在水平放置的平皿中均匀地放置牛津杯。

④加入MSY菌悬液：在牛津杯中分别加入80μl分离菌株MSY培养液，另一个牛津杯中加入80μl无菌的MRS液体培养基作对照，37℃培养24h。

试验结果：分离菌株MSY能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，结果见图2。表明本发明菌株MSY可以用于制备抗菌剂。

(2)菌株的耐酸试验：将分离MSY菌株按MRS液体培养基体积的1％的接种量分别接种于pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和6.5的MRS液体培养基中，37℃培养24h，测定OD_600nm值。

试验结果：本发明菌株在pH＝3.0的培养液中仍有一定的生长，具有较强的抗酸能力，结果见图3。

(3)菌株的耐胆盐试验：将分离MSY菌株按MRS液体培养基体积的1％的接种量接种于猪胆盐含量分别为0.03％、0.1％、0.2％、0.3％、的MRS培养基中，37℃培养24h后，稀释10倍，取0.1ml涂MRS固体平板，进行活菌平板菌落计数。平板计数法计算活菌数。

试验结果：本发明菌株具有一定的耐胆盐能力结果见表1。

表1卷曲乳杆菌MSY在不同胆盐浓度的存活情况

实施例4：MSY菌株的16S rDNA的种属鉴定

试验材料：PCR试剂购于TaKaRa生物公司；细菌基因组DNA提取试剂盒(Bacterial DNAKit)购于Omega公司；引物合成及测序由上海生工完成。

试验方法：利用试剂盒提取细菌基因组DNA，以基因组DNA作为模板，利用细菌16s rDNA通用引物27F(引物序列：SEQ ID NO.2)和1492R(引物序列：SEQ ID NO.3)，扩增长度为1500bp的16s rDNA可变区V3区序列，PCR扩增产物由上海生工测序，所得序列与NCBI的GeneBank中的已知序列进行比对分析。

PCR扩增体系为50μL：

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性45s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃终延伸10min；4℃保存。

试验结果：经比对，所得序列与卷曲乳杆菌同源性在99％以上，序列分析结果表明，本发明菌株MSY为卷曲乳杆菌。16s rDNA凝胶电泳图，见图4；16s rDNA核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

实施例5：MSY菌株的饲喂试验

试验材料：

在大型肉鸡场随机选择3栋鸡舍，各单独饲养肉鸡500只，常规饲养。

饲喂六和肉鸡饲料，基础饲料配方见表2，保留基础的无机钙磷含量。对照组1饲喂基础饲料，对照组2以基础饲料添加KDN植酸酶600U/KG，试验组通过饮水添加MSY菌液10⁷cfu/ml，饲喂基础饲料。

试验方法：

(1)生产性能试验：饲喂周期为6周，早晚各喂一次料，自由采食和饮水；每天观察鸡的精神状态、粪便情况，42日龄时，统计死亡鸡数量，计算成活率；统计三组各自饲料总消耗量和总体重，计算料重比。

试验结果：对照组1、2成活率为97.5％、96.8％，料重比为2.04:1、2.03:1；试验组成活率为97.3％，料重比为2.03:1。表明接种MSY对肉鸡性能的影响方面，可以达到直接添加植酸酶的生产效果，见表3。

表2基础饲料配方和营养水平、钙磷含量

营养水平

表3肉鸡生产性能

(2)钙磷代谢试验：

分别于7、14、21日龄采集粪样，用EDTA络合法测定粪排放钙含量；用钼酸铵法测定磷的含量。

①样品的分解：称取2～5g样品(准确至0.0002g),在电炉上低温炭化至无烟为止。再将其放入高温炉于(550±20℃)下灼烧3h。在盛有灰分的坩埚中加入1:3盐酸溶液10mL和浓硝酸数滴，小心煮沸。将此溶液转入100mL容量瓶，并以热蒸馏水洗涤坩埚及漏斗中的滤纸，冷却至室温后，定容，摇匀，为试样分解液。

②样品钙测定：准确分取10～20mL试样分解液(含钙2～25mg)于150mL三角瓶中，蒸馏水50mL，10g/L淀粉溶液10mL，三乙醇胺溶液2mL，乙二胺溶液1mL，每加完一种试剂要充分摇匀，然后加孔雀石指示剂1滴，摇匀，滴加200g/L氢氧化钾溶液至无色，再加氢氧化钾溶液2mL，加入0.1g盐酸羟胺，摇匀溶解后，加钙黄指示剂少许，使颜色呈墨绿色，在黑色背景下，立即用0.01mol/L EDTA标准溶液滴定至绿色荧光消失，呈紫红色为滴定终点。同时做试剂空白试验。

③样品磷测定：准确移取试样分解液1-10mL(含磷量50-70μg)于50mL容量瓶中，加钒钼酸铵显色试剂10mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置10min以上。以空白为参比，用10mL比色池在420nm波长下，用分光光度计测定试样分解液的吸光度。用标准曲线查得试样分解液的含磷量。

试验结果：试验组与添加植酸酶的对照组2相近，无显著差异，钙磷排放较少；与对照组1差异显著。

表4肉鸡粪排放的钙磷含量(％)

(3)对肠道菌群影响试验：

分别于14日龄采集盲肠，用无菌剪刀剪掉盲肠开口端，小心挤出内容物到离心管，用无菌生理盐水连续进行10倍稀释至10-8，选择合适范围稀释度，用表5培养基培养，菌落计数。

试验结果：三组绝大多数菌株差异显著，试验组需氧菌、肠杆菌、肠球菌与添加植酸酶对照组相近，与对照组1差异显著；乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌、总厌氧菌的含量依次为试验组、对照组2(植酸酶)、对照组1(空白)，且差异显著。

表5盲肠菌群测定培养基

表6 MSY对14日龄肉鸡盲肠菌群影响(lgcfu/g粪便)

综上研究结果表明：接种少量MSY达到了添加KDN植酸酶600U/KG的生产效果，对肉鸡生产性能提高明显；且钙磷排放较少，提高了饲料中钙磷的吸收利用率；提高肠道中益生菌：乳酸杆菌、双歧杆菌、类杆菌、总厌氧菌的含量。可以看出本发明MSY菌株具有包括但不限于以下方面的用途：MSY菌剂饲喂鸡、鸭、猪，能提高钙磷利用率，改善生产性能、肠道微生态平衡。