本发明涉及一种何首乌叶原生质体的制备方法。
背景技术：
何首乌为双子叶蓼科多年生草本植物，分布在我国广东、四川、湖南等省区，生长于灌木丛中、山脚阴处或石隙中。茎缠绕，基部中空，多分枝，基部木质化。叶心形，两面光滑，有膜质短筒状的托叶鞘，圆锥状花序。瘦果椭圆形，光滑，黑色。块茎供药用，有滋补强壮作用，茎藤可治失眠症。野生何首乌的块茎生长缓慢，不能满足人类对药物的开发利用。
植物原生质体培育和融合是植物育种的重要技术之一。目前分离原生质体的方法有机械法和酶法，常用的方法是酶法。笔者用机械法制备何首乌叶片的原生质体，用PEG结合高pH诱导融合法来融合其原生质体，以期为何首乌多倍体植株的培育奠定基础。
技术实现要素：
本发明提出一种何首乌叶原生质体的制备方法。
本发明所述方法制备的何首乌叶原生质体，活性强，融合效率高，可工业化生产，实用性强。
具体实施方式
实施例1。
一种何首乌叶原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）何首乌叶片经过质壁分离后切成0．5厘米宽的长条，转入到25％蔗糖溶液中放置8min，在35℃水浴锅中处理何首乌叶片30win，过滤后得到原生质体溶液；
（2）原生质体经过27％蔗糖溶液洗涤一次，再用13％甘露醇CPW溶液悬浮；
（3）悬浮液原生质体可用牛氏记数板记数和细胞融合；
（4）原生质体得率=记数室大方格原生质体的平均个数×104个(Fw)；
（5）经过质壁分离法获得的原生质体溶液，l500r／rain下离心8win，沉淀用少量13％甘露醇CPW溶液悬浮，为原生质体溶液；
（6）用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上，静置几分钟，使原生质体在载玻片上产生一薄层；
（7）取PEG融合液两滴，缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中，再静置一定时间，观察载玻片原生质体问的粘连；
（8）每隔5min，用吸管向原生质体液中滴两滴高Ca2+高pH溶液，共3次；
（9）盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片后即可。
实施例2。
一种何首乌叶原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）何首乌叶片经过质壁分离后切成0．5厘米宽的长条，转入到25％蔗糖溶液中放置8min，在35℃水浴锅中处理何首乌叶片30win，过滤后得到原生质体溶液；
（2）原生质体经过27％蔗糖溶液洗涤一次，再用13％甘露醇CPW溶液悬浮；
（3）悬浮液原生质体可用牛氏记数板记数和细胞融合；
（4）原生质体得率=记数室大方格原生质体的平均个数×104个(Fw)；
（5）经过质壁分离法获得的原生质体溶液，l500r／rain下离心8win，沉淀用少量13％甘露醇CPW溶液悬浮，为原生质体溶液；
（6）用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上，静置几分钟，使原生质体在载玻片上产生一薄层；
（7）取PEG融合液两滴，缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中，再静置一定时间，观察载玻片原生质体问的粘连；
（8）每隔5min，用吸管向原生质体液中滴两滴高Ca2+高pH溶液，共3次；
（9）盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片后即可；
（10）所述渗透剂为0．9mol／LNaCI、6％KN03和5％蔗糖溶液的混合液；
（11）原生质体质壁分离的蔗糖浓度为25％、30％、35％、40％、45％。
实施例3。
一种何首乌叶原生质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）何首乌叶片经过质壁分离后切成0．5厘米宽的长条，转入到25％蔗糖溶液中放置8min，在35℃水浴锅中处理何首乌叶片30win，过滤后得到原生质体溶液；
（2）原生质体经过27％蔗糖溶液洗涤一次，再用13％甘露醇CPW溶液悬浮；
（3）悬浮液原生质体可用牛氏记数板记数和细胞融合；
（4）原生质体得率=记数室大方格原生质体的平均个数×104个(Fw)；
（5）经过质壁分离法获得的原生质体溶液，l500r／rain下离心8win，沉淀用少量13％甘露醇CPW溶液悬浮，为原生质体溶液；
（6）用吸管取原生质体悬浮液滴两滴在载玻片上，静置几分钟，使原生质体在载玻片上产生一薄层；
（7）取PEG融合液两滴，缓慢滴加到载玻片上的原生质体溶液中，再静置一定时间，观察载玻片原生质体问的粘连；
（8）每隔5min，用吸管向原生质体液中滴两滴高Ca2+高pH溶液，共3次；
（9）盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的溶液即成临时装片后即可；
（10）所述渗透剂为0．9mol／LNaCI、6％KN03和5％蔗糖溶液的混合液；
（11）原生质体质壁分离的蔗糖浓度为25％、30％、35％、40％、45％。