马铃薯原生质体的高效分离、转化及再生的方法及其专用培养基与流程

本发明涉及转基因工程领域，具体涉及马铃薯原生质体的高效分离、转化及再生的方法及其专用培养基。

背景技术：

马铃薯是全球第四大主粮，能够为中国、印度、欧盟等国家粮食安全做出重要贡献。2015年，在美国批准转基因马铃薯的同时，中国(600万公顷)这个全球最大的马铃薯生产国宣布计划将马铃薯的种植面积翻番，并将马铃薯指定为继水稻、玉米和小麦之后的第四大主粮。

植物原生质体是研究遗传理论的良好反应器，也是遗传转化的理想受体。同时原生质体变异植株也为植物育种提供了大量可供选择和利用的材料。时下，基因组编辑技术为功能基因组学研究打开了一个新的领域，与其结合的原生质体转化体系将成为作物改良的有力工具(Voytas and Gao,2104；Jones,2015)。

早在1977年，Shepard和Totten已进行了马铃薯原生质体的分离和培养并成功再生出完整植株。上世纪80年代后期，国内陆续有了几篇马铃薯原生质体培养成功的报道(Binding et al.,1978；李耿光,1988；Hunt et al.,1989；李世君,1989；Xu et al.,1991)。这些研究涉及到马铃薯供试材料包括根段、块茎、叶肉细胞及悬浮细胞等，其中以叶肉细胞居多，以悬浮细胞为材料的仅有1篇(祁新等,2000)。而采用悬浮细胞进行原生质体转化及再生的研究尚未报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种马铃薯原生质体的高效分离、转化及再生的方法及其专用培养基，获得大量高纯度的原生质体和大量高表达的转基因植株，为亚细胞定位、启动子表达等功能基因组学研究以及植物体细胞融合、遗传转化、基因组编辑等品种改良技术的拓展提供了可能。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于马铃薯原生质体的高效分离、转化及再生的专用培养基，包括以下培养基,所有配方中，水为溶剂：

1)诱导培养基：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

2)继代培养基：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

3)悬浮培养基：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

4)酶解液：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

5)细胞洗液：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

CPW盐 1.85g

甘露醇 60g

6)FDA染液：5mg FDA溶于1mL丙酮中；

7)转化液：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

甘露醇 91g

氯化镁 14.25g

乙磺酸 1.0g

8)含有聚乙二醇PEG的溶液：pH值为8.0，每1L中含有以下组分：

聚乙二醇PEG 40g

甘露醇 72.9g

硝酸钙 16.4g

9)原生质体培养基：

液体原生质体培养基：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

VKM培养基：

固体原生质体培养基：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

VKM培养基：

10)固体分化培养基：pH值为5.2-6.0，每1L中含有以下组分：

优选，包括以下培养基，所有配方中，水为溶剂：

1)诱导培养基：pH值为5.8，每1L中含有以下组分：

2)继代培养基：pH值为5.8，每1L中含有以下组分：

3)悬浮培养基：pH值为5.8，每1L中含有以下组分：

4)酶解液：pH值为5.6，每1L中含有以下组分：

5)细胞洗液：pH值为5.6，每1L中含有以下组分：

CPW盐 1.85g

甘露醇 60g

7)转化液：pH值为5.6，每1L中含有以下组分：

甘露醇 91g

氯化镁 14.25g

乙磺酸 1.0g

9)原生质体培养基：

液体原生质体培养基：pH值为5.8，每1L中含有以下组分：

VKM培养基：

固体原生质体培养基：pH值为5.8，每1L中含有以下组分：

VKM培养基：

10)固体分化培养基：pH值为5.8，每1L中含有以下组分：

所述培养基的制备方法如下：

1)诱导培养基：

终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及终浓度为30g/L的蔗糖，水为溶剂，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃时添加终浓度为2.0mg/L的萘乙酸和终浓度为2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，制成固体培养基；

2)继代培养基：

终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为0.25g/L的水解酪蛋白，终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及终浓度为30g/L的蔗糖，水为溶剂，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃时添加终浓度为1.0mg/L的萘乙酸，制成固体培养基；

3)悬浮培养基：

终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为0.25g/L的水解酪蛋白，终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及终浓度为30g/L的蔗糖，水为溶剂，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃时添加终浓度为1.0mg/L的萘乙酸，制成液体培养基；

4)酶解液：

终浓度为1.85g/L的CPW盐，终浓度为20g/L的纤维素酶，终浓度为5g/L的果胶酶，终浓度为2.5g/L的离析酶，终浓度为0.64g/L的乙磺酸，终浓度为20g/L的聚乙烯吡咯烷酮，终浓度为20g/L的牛血清蛋白以及终浓度为102g/L的蔗糖，水为溶剂，用NaOH调pH至5.6，过滤灭菌，分装后保存于-20℃条件下；

5)细胞洗液：

终浓度为1.85g/L的CPW盐，终浓度为60g/L的甘露醇，水为溶剂，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min；

6)FDA染液：

5mg FDA溶于1mL丙酮中，4℃避光保存；

7)转化液：

终浓度为91g/L的甘露醇，终浓度为14.25g/L的氯化镁以及终浓度为1.0g/L的乙磺酸，水为溶剂，调pH至5.6，过滤灭菌；

8)含有聚乙二醇PEG的溶液：

终浓度为40g/L的PEG，终浓度为72.9g/L的甘露醇以及终浓度为16.4g/L的硝酸钙，水为溶剂，调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，分装后保存于-20℃条件下。

9)原生质体培养基：

液体原生质体培养基：终浓度为79.49g/L的VKM培养基的固体组分，终浓度为20mL/L的VKM培养基的椰子汁，终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，水为溶剂，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃时添加终浓度为0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤，制成液体培养基；

固体原生质体培养基：终浓度为79.49g/L的VKM培养基的固体组分，终浓度为20mL/L的VKM培养基的椰子汁，终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，终浓度为8g/L的琼脂，水为溶剂，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃时添加终浓度为0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤，制成固体培养基；

10)分化培养基

终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为10g/L的甘露醇，终浓度为30g/L的蔗糖，水为溶剂，调pH至5.8，添加终浓度为8g/L的琼脂，终浓度为2g/L的活性炭，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃时添加终浓度为0.1mg/L的萘乙酸，终浓度为1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，终浓度为1.0mg/L的玉米素制成固体培养基。

上述的专用培养基用于马铃薯原生质体的高效分离、转化及再生的方法，包括以下步骤：

(1)无菌苗的培养

马铃薯无菌试管苗为四倍体普通栽培种，将其以单节切段接于普通的MS培养基上，于24±1℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000lx条件的生长室中进行培养21d；

(2)愈伤组织的诱导

剪取马铃薯试管苗的幼嫩茎段接种于诱导培养基上，置于24±1℃，2000～2500lx，光周期为16h光照/8h黑暗的生长室中培养；当愈伤组织长到直径为1mm时，将其转移到继代培养基中进行继代培养，每隔7d更换一次培养基，所有愈伤组织置于24±1℃，光周期为16h光照/8h黑暗的生长室中；

(3)悬浮细胞系的建立

取连续继代培养20d，结构蓬松、色泽鲜艳透明且生长速度快的愈伤组织，接入到液体的悬浮培养基中；每隔4d继代一次，继代2～3个周期后，收集直径<900μm小细胞团继续培养，再次继代培养2次后，获得大小均匀、生长迅速、颜色鲜亮透明的悬浮细胞系；

(4)悬浮细胞原生质体的分离

取2-5g对数生长期的悬浮细胞，常温下500rpm，离心3min，放入含有10mL酶解液于6cm的培养皿中进行酶解，酶解温度为26℃，摇床转速80rpm，解离14～16h；

(5)悬浮细胞原生质体的纯化

解离完成后，酶解液过300目网筛，1000rpm离心6min，弃上清，沉淀用8mL细胞洗液重悬后，于800rpm离心6min，弃上清以除去残留的解离酶，经2～3次离心漂洗后所得的原生质体即为纯化的原生质体；

(6)原生质体产量及活力测定

取收集到的原生质体悬浮液0.5mL置于2mL的离心管中并加入FDA染液，按原生质悬浮液和FDA染液100:1的体积比例混匀，于荧光显微镜下观察原生质体的活力，室温下静置5min后，于显微镜下计数未染色的活细胞率以及原生质体的产量；

(7)原生质体的转化

1)将质粒DNA pCambia1300GFP在无水乙醇中析出并消毒后，用无菌超纯水溶解至终浓度最低为0.7μg/μL；

2)原生质体计数完成后，将步骤(5)得到的纯化的原生质体于400rpm离心5min，去除上清液，按比例加入转化液，使重悬原生质体得浓度达到1.6×10⁶个/mL；

3)向新的14mL离心管中加入300μL步骤2)原生质体悬浮液，加入30μL步骤1)质粒DNA，边旋转离心管边缓慢从管壁四周加入300μL含有PEG的溶液，测向轻柔来回晃动离心管使之充分混匀，室温条件下静止15min，每隔3min晃动一次；

4)按照1mL、2mL、3mL的次序分别向离心管中细胞洗液，每次间隔2min并充分混匀，于400rpm离心5min；

5)去上清液后，最后加入6mL细胞洗液充分混匀，离心5min；

6)最后加入1ml液体原生质体培养液，放置于冰上；

(7)原生质体培养

调整纯化后的悬浮细胞原生质体密度至2.5×10⁵个/mL，将纯化后的1mL原生质体悬浮液和2mL液体原生质体培养基加入直径3cm的培养皿中形成一浅层，Parafilm密封，在24±1℃的生长室中黑暗静置培养；

(8)原生质体培养获得的愈伤组织再分化与植株再生

当原生质体培养中出现肉眼可见小愈伤组织后，需将其转移到添加了终浓度为25mg/L潮霉素的悬浮细胞固体培养基上继代培养，待愈伤组织长到5mm时，再次转移到添加了终浓度为25mg/L潮霉素的分化培养基中诱导分化；50～60d可再生完整植株，培养条件：温度25℃，光强2000lx，光周期16h光照/8h黑暗。

所述步骤(4)为解离12h后于倒置显微镜下观察悬浮细胞去壁情况，细胞去壁完全终止解离。

本发明的有益效果是：获得大量高纯度的原生质体和大量高表达的转基因植株，为亚细胞定位、启动子表达等功能基因组学研究以及植物体细胞融合、遗传转化、基因组编辑等品种改良技术的拓展提供了可能。

附图说明

图1是马铃薯原生质体分离、转化和再生的流程图(A)纯化后的悬浮细胞原生质体；B)FDA荧光染色(示原生质体活性)；C)培养2d后膨大的原生质体(箭头标示)；D)液体浅层培养3～4d的原生质体第一次分裂(箭头标示)；E)培养10～15d的原生质体二次分裂(箭头标示)；F)培养15～20d出现小细胞团；G)低熔点琼脂糖培养形成的细胞团(箭头标示为活性炭)；H)小细胞团培养20～30d后形成的愈伤颗粒；I)由H中挑取的紫色和白色愈伤组织；J)原生质体培养获得的不同颜色的愈伤组织细胞系；K-L)马铃薯“GSAP-H”悬浮细胞原生质体再生植株)。

图2马铃薯茎段愈伤组织诱导状况。

图3 PEG法转化DNA的演示图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

一、制备愈伤组织诱导及继代培养的母液和培养基

1)诱导培养基：

添加具有如下各组分：终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为0.5mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及终浓度为30g/L的蔗糖，用水补足体积，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为2.0mg/L的萘乙酸和终浓度为2.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，制成固体培养基。

2)继代培养基：

添加具有如下各组分：终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为0.25g/L的水解酪蛋白，终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及终浓度为30g/L的蔗糖，用水补足体积，调pH至5.8，添加终浓度为3g/L的植物凝胶，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为1.0mg/L的萘乙酸，制成固体培养基。

3)悬浮培养基：

添加具有如下各组分：终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为0.25g/L的水解酪蛋白，终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及终浓度为30g/L的蔗糖，用水补足体积，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为1.0mg/L的萘乙酸，制成液体培养基。

4)酶解液：

在CPW盐溶液中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为20g/L的纤维素酶，终浓度为5g/L的果胶酶，终浓度为2.5g/L的离析酶，终浓度为0.64g/L的乙磺酸，终浓度为20g/L的聚乙烯吡咯烷酮，终浓度为20g/L的牛血清蛋白以及终浓度为102g/L的蔗糖，用水补足体积，用NaOH调pH至5.6，过滤灭菌，分装后保存于-20℃条件下。

5)细胞洗液：

在CPW盐溶液中添加终浓度为60g/L的甘露醇，用水补足体积，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min。

6)FDA染液：

5mg FDA溶于1mL丙酮中，4℃避光保存。

7)转化液：

添加具有如下各组分：终浓度为91g/L的甘露醇，终浓度为14.25g/L的氯化镁以及终浓度为1.0g/L的乙磺酸，用水补足体积，调pH至5.6，过滤灭菌。

8)含有聚乙二醇(PEG)的溶液：

添加具有如下各组分：终浓度为40g/L的PEG，终浓度为72.9g/L的甘露醇以及终浓度为16.4g/L的硝酸钙，用水补足体积，调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，分装后保存于-20℃条件下。

9)原生质体培养基：

在VKM培养基中添加具有如下终浓度的各组分：终浓度为2.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸，(添加终浓度为8g/L的琼脂)，用水补足体积，调pH至5.8，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤，制成液体(或固体)培养基。

10)分化培养基

添加具有如下各组分：终浓度为4.4g/L的MS培养基，终浓度为10g/L的甘露醇，终浓度为30g/L的蔗糖，用水补足体积，调pH至5.8，添加终浓度为8g/L的琼脂，终浓度为2g/L的活性炭，121℃高压灭菌20min，待培养基温度降至60℃左右时添加终浓度为0.1mg/L的萘乙酸，终浓度为1.0mg/L的6-苄氨基嘌呤，终浓度为1.0mg/L的玉米素制成固体培养基。

二、马铃薯原生质体的分离、转化和再生

1、无菌苗的培养

紫色马铃薯“GSAP-H”无菌试管苗为四倍体普通栽培种(Solanum tuberosum L.)。将“GH”以单节切段接于普通的MS培养基上，于24±1℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为2000lx条件的生长室中进行培养，21d后用作本次实验的起始材料。

2、愈伤组织的诱导

剪取“GH”马铃薯试管苗的幼嫩茎段(约0.5cm)接种于愈伤组织诱导培养基上。置于24±1℃，2000～2500lx，光周期为16h光照/8h黑暗的生长室中培养。当愈伤组织长到直径约为1mm左右时，将其转移到继代培养基中进行继代培养。每隔7d更换一次培养基，所有愈伤组织置于24±1℃，光周期为16h光照/8h黑暗的生长室中。(见图2)

3、悬浮细胞系的建立

取连续继代培养20d，结构蓬松、色泽鲜艳透明且生长速度快的“GH”愈伤组织，接入到液体悬浮培养基中。培养初期，大多数细胞呈不规则形状，内含物较少且液泡大。每隔4d继代一次，继代2～3个周期后，滤去较大的愈伤组织块，收集小细胞团(直径<900μm)继续培养，而收集的小细胞团再次继代培养2次后，可获得大小均匀、生长迅速、颜色鲜亮透明的悬浮细胞系。

4、悬浮细胞原生质体的分离

取2g左右对数生长期的悬浮细胞，常温下离心3min(500rpm)，放入含有10mL酶解液于6cm的培养皿中进行酶解。酶解温度为26℃，摇床转速80rpm，解离约需14～16h，解离12h后于倒置显微镜下观察悬浮细胞去壁情况，适时终止解离。

5、悬浮细胞原生质体的纯化

解离完成后，酶解液过300目网筛，1000rpm离心6min，弃上清，沉淀用8mL细胞洗液重悬后，于800rpm离心6min，弃上清以除去残留的解离酶，经2～3次离心漂洗后所得的原生质体即为纯化的原生质体。(见图1A)

6、原生质体产量及活力测定

取收集到的原生质体悬浮液0.5mL置于2mL的离心管中并加入FDA溶液，按悬浮液和FDA100:1的比例混匀，于荧光显微镜下观察原生质体的活力(激发光的滤光片为QB24型，压制光的滤光片为JB8型)(见图1B)。室温下静置5min后，于显微镜下计数未染色的活细胞率超过90％，以及原生质体的产量为7.1×10⁵个/g·FW。

7、原生质体的转化

1)将质粒DNA(pGenovo-2)在无水乙醇中析出并消毒后，用无菌超纯水溶解至终浓度最低为0.7μg/μL。

2)原生质体计数完成后，于400rpm离心5min，去除上清液，按比例加入转化液，使重悬原生质体得浓度达到1.6×10⁶个/mL。

3)向新的14mL离心管中加入300μL(原生质体数为5×10⁵)原生质体悬浮液，加入30μL质粒DNA，边旋转离心管边缓慢从管壁四周加入300μL含有PEG的溶液(如图3)，测向轻柔来回晃动离心管使之充分混匀，室温条件下静止15min，每隔3min晃动一次。

4)按照1mL、2mL、3mL的次序分别向离心管中细胞洗液，每次间隔2min并充分混匀，于400rpm离心5min。

5)去上清液后，最后加入6mL细胞洗液充分混匀，离心5min

5)最后加入1ml原生质体培养液，放置于冰上。

8、原生质体培养

调整纯化后的悬浮细胞原生质体密度至2.5×10⁵个/mL，将纯化后的1mL原生质体悬浮液和2mL液体培养基加入直径3cm的培养皿中形成一浅层，Parafi lm密封，在24±1℃的生长室中黑暗静置培养。培养2～3d原生质体开始第一次分裂(见图1C-D)，10d左右进行第二次分裂(见图1E)，30～40d形成肉眼可见的细胞团(见图1F-G)。“GSAP-H”的细胞分裂频率和植板率最高可达76.72％和31.46％。

9、原生质体培养获得的愈伤组织再分化与植株再生

当原生质体培养中出现肉眼可见小愈伤组织后(见图1H-J)，需将其转移到添加了终浓度为25mg/L潮霉素的悬浮细胞固体培养基上继代培养，待愈伤组织长到5mm左右时，再次转移到添加了终浓度为25mg/L潮霉素的分化培养基中诱导分化(见图1K-L)。大约50～60d可再生完整植株。培养条件：温度25℃，光强2000lx，光周期16h光照/8h黑暗。

10、移栽即壮苗

待生根的抗性马铃薯地上部分长至10cm左右且诱导出2条以上强壮根系时，移栽至12×12cm的花盆中，于光照强度2000lx、光周期14/10h、苗期昼夜温度为20/15℃、孕穗及灌浆期昼夜温度为30/20℃的生长室中壮苗扩繁，长成健壮植株。

实施例2

用二倍体马铃薯原始栽培种“NDK47-33”、“NDK5-19”，按实施例1中的方法进行培养，均获得了马铃薯转基因植株。

本发明紫色马铃薯(Solanum tuberosum L.)原生质体的高效分离、转化和再生体系及专用培养基。本发明以马铃薯试管苗茎段为为起始材料，经过诱导及3次继代培养获得生长旺盛、结构疏松的胚性愈伤组织进行悬浮培养，采用纤维素酶、果胶酶和离析酶，对马铃薯悬浮细胞进行消化并利用密度梯度沉降的方法分离原生质体，获得了高纯度的原生质体。通过聚二乙醇介导将目的基因导入马铃薯原生质体基因组中，经液体浅层培养以及后续分化再生，培育出了大量马铃薯转基因植株。本发明一方面可分离出大量高纯度的原生质体，另一方面能将质粒DNA成功高效地转入原生质体中，同时原生质体可成功被培养成又能获得大量高表达的转基因植株。为后续马铃薯良种培育的批量生产奠定了基础。

本发明可为亚细胞定位、启动子表达等功能基因组学研究以及植物体细胞融合、遗传转化、基因组编辑等品种改良提供了可能。本发明成功了应用在了中国紫色马铃薯品种上，并等同适用于二倍体马铃薯原始栽培种，为马铃薯品种的改良和遗传学研究做了初步探索。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。