Rasamsonia转化体的制作方法
【专利说明】Rasamsonia转化体 发明领域
[0001] 本发明涉及在Rasamsonia细胞的革El位点实施重组的方法。本发明还涉及 Rasamsonia细胞，例如通过这种方法产生的Rasamsonia细胞。本发明进一步涉及使用这种 Rasamsonia细胞的工艺和产生的酶组合物。本发明进一步涉及核酸和氨基酸序列。
[0002] 发明背景
[0003] 碳水化合物组成地球上最丰量的有机化合物。然而，许多这类碳水化合物隐蔽在 复杂聚合物中，包括淀粉（种子和谷物中的主要储存碳水化合物）和被称为木质纤维素的 碳水化合物与木质素的集合。木质纤维素的主要碳水化合物组分是纤维素、半纤维素和果 胶。这些复杂的聚合物通常被统称为木质纤维素。
[0004] 从由于OPEC减少石油输出而导致石油危机爆发的70年代开始，可再生的木质纤 维素生物质生物转化为可发酵的糖吸引了研宄人员强烈的注意力，所述可发酵的糖随后被 发酵以产生作为液体燃料的替代品的醇（例如乙醇）。在过去二十年间，乙醇在美国作为与 汽油的10 %的掺合物或在巴西作为车辆的纯燃料已被广泛使用。更近期，实现了E85 (85 % 乙醇掺合物）的使用，特别是用于清洁城市应用。燃料生物乙醇的重要性将会随着油价的 提高及油来源的逐渐耗尽而提高。另外，可发酵的糖被用于生产塑料、聚合物和其他基于生 物的产品，并且预期这一工业将大幅增长，从而提高了对丰富低成本的可发酵糖的需求，所 述可发酵糖可以被用作原料来代替基于石油的原料。
[0005] 这类大量碳水化合物在植物生物质中的储集提供了糖（五碳糖以及六碳糖）形式 的大量潜在的能量来源，所述糖能够被用于大量工业和农业过程。然而，这些碳水化合物的 大量能源潜力目前利用不足，因为糖封闭在复杂聚合物中并因此不容易进行发酵。从植物 生物质产生糖的方法会提供大量的、经济上有竞争性的原料，用于发酵成化学品、塑料例如 琥珀酸和（生物）燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液体燃料和沼气。
[0006] 无论何种纤维素原料，酶的成本和水解效率是限制生物质生物转化方法商业化的 主要因素。微生物生产的酶的生产成本与产酶菌株的生产力和发酵液中最终活性产率密切 相关。
[0007] 尽管过去几十年为了理解酶促木质纤维素生物质降解和纤维素酶生产而进行了 持续的研宄，但是仍然期望发现或者改造新的有高度活性的纤维素酶和半纤维素酶。还高 度期望构建能够进行迅速和有效的木质纤维素材料生物降解的高效的酶组合物。
[0008] 此类酶组合物可被用来生产糖以用于发酵为化学品、塑料例如琥珀酸和（生物） 燃料包括乙醇、甲醇、丁醇、合成液体燃料和沼气；用于青贮；并在其他工业方法例如食品 或饲料、纺织、制浆或造纸或洗涤剂工业和其他工业中用作酶。
[0009] 已知生产用于酶促木质纤维素生物质降解的合适的酶的微生物的一个属是 Rasamsonia属。Rasamsonia是丝状真菌，它有时被称Talaromyces。
[0010]Jain，S.etal，MolGenGenet(1992)，234,489-493 公开了真菌Talaromycessp CL240的转化体系。没有公开多肽的表达。
[0011]Murray，F.R.etal，CurrGenet(1997)，32, 367-375 公开 了来自Talaromyces flavus的葡萄糖氧化酶基因在Talaromycesmacrosporus中的过表达。研宄了真菌分离株 对V.dahliae的生长抑制作用。
[0012] W0200170998公开了Talaromyces emersonii 0-葡聚糖酶。在16页，其描述了 0-葡聚糖酶的多核苷酸可在宿主例如酵母细胞中异源表达。
[0013] W0200224926 公开了Talaromycesemersonii木聚糖酶。在 24 页第 5 段，其描述 了可通过木聚糖酶DNA序列在合适的同源或异源宿主细胞中重组表达来实现多肽的生产。 在第7段，其讲述了宿主细胞可过表达多肽，用于工程制造过表达的技术是从W099/32617 中已知的。W099/32617涉及表达克隆，但没公开在Talaromyces宿主中的克隆。
[0014] W02007091231公开了热稳定的并编码热稳定酶的Talaromycesemersonii菌株， 还公开了由Talaromycesemersonii菌株生产的酶组合物。没有公开同源或异源多肽的重 组生产。在表1中显示了诱导性碳源被以0.2-6%的量添加。Solkafloe和葡萄糖（2%) 被包括用于比较目的。在78页28行，其讲述了"葡萄糖未完全抑制通过T.emersonii菌株 的葡糖苷外切酶生产"（表31A)。表31A示出了用葡萄糖作为碳源，頂1393751产生31.90IU 的e-葡糖苷酶活性，但没有其他纤维素酶活性例如葡聚糖酶或木糖酶活性。由于缺少此 类酶活性，菌株IMI393751不适于生产葡萄糖作为碳源时用于转化木质纤维素的纤维素 酶。
[0015] W02011054899公开了Talaromyces转化体和利用Talaromyces转化体生产多肽的 方法。利用选择标记（例如抗腐草霉素标记）选择感兴趣的多核苷酸被引入的转化体，其 中所述选择标记与感兴趣的多核苷酸被同时引入。
[0016] 额外的遗传工具是必需的以更有效地利用Rasamsonia生产酶或其它工业相关产 品。
[0017] 发明概沐
[0018] 本发明涉及在Rasamsonia细胞的靶位点（例如在靶基因组内）实施重组的方法。 本发明所述的重组方法导致靶位点的改变，例如在靶位点插入核酸序列。可实施所述的方 法以使在靶位点插入新的序列并伴随从靶位点除去现存的序列。也就是说，所述方法可被 用于将靶位点上的序列替换为替代性序列。所述方法可便于在宿主细胞体内实施。
[0019] 通常，当在体内实施时，不对人类或动物细胞实施本发明所述的方法。也就是说， 通常不以治疗方法的形式实施本发明所述的方法。可以离体或体外方式实施本发明所述的 方法。术语离体或体外应被理解为包括对微生物（对完整活细胞或非细胞物质二者）实施 的方法，但排除对人类或动物实施的方法。
[0020] 通常，实施所述的方法使至少部分插入在靶位点的序列随后被移除。如果实施所 述的方法以在靶位点替换序列并随后移除插入的序列，那么结果可以是使靶位点的序列缺 失。
[0021] 因此，可实施本发明所述的方法以改变靶位点的序列。这种改变可以是，例如添加 新的序列、替换现存的序列和/或缺失/去除现存的序列。
[0022] 因此，所述方法可被用于产生Rasamsonia无标记的缺失菌株。也就是说，可以用 标记序列替换靶序列，然后移除标记序列。
[0023] 在Rasamsonia细胞体内实施本发明。优选地，Rasamsonia细胞可产生感兴趣的 化合物，例如酶，特别是一种或多种纤维素酶。
[0024] 应用本发明的方法之前，Rasamsonia细胞可以能够产生感兴趣的化合物。在这种 情况下，可利用本发明的方法修饰靶位点以改变宿主细胞对感兴趣的化合物的生产，例如 可增加产量。或者，作为应用本发明的方法的结果，宿主细胞可产生感兴趣的化合物。
[0025] 特别地，可利用所述方法产生非同源重组（NHR)/同源重组（HR)的比率降低的 Rasamsonia细胞，以使所产生的细胞在靶位点靶向整合多核苷酸的效率提高。此外，可利用 所述方法使编码蛋白酶P印A的基因缺失，以使所产生的细胞显示出异源基因的生产的增 加。
[0026] 因此，利用本发明的方法产生的Rasamsonia细胞可以不含标记、显示较高程度的 HR和显示活性降低或有缺陷的蛋白酶p印A。这些细胞形成了本发明的一部分。
[0027] 因此，本发明提供在Rasamsonia细胞的靶位点实施重组的方法，其中所述方法包 括：
[0028] _提供两种或多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的 序列；(b)两个或多个位点特异性重组位点；（C)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的 序列；和⑷编码标记的序列，
[0029] 其中所述的两种或多种核酸能够相互同源重组以产生一种核酸，和
[0030] 其中所述的两种或多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记的序列； 和
[0031]-在Rasamsonia细胞中，使所述的两种或多种核酸相互重组并与靶位点的侧翼序 列重组，以在靶位点插入编码有功能标记的连续核酸序列和编码重组酶的序列，所述编码 标记和/或编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点且所述位点特异性 重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列，
[0032] 从而在Rasamsonia细胞的靶位点实施重组。
[0033] 因此，所述的两种或多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分标记基因的 序列，即各包含重组后编码有功能标记的部分序列（其中所述部分自身不编码有功能标 记）。本发明还提供：
[0034]-通过本发明的方法产生的Rasamsonia细胞；
[0035]-无标记的Rasamsonia细胞；
[0036]-Rasamsonia细胞，其是亲本Rasamsonia的变体，其中突变体中的NHR/HR的比率 比在相同条件下在所述亲本细胞中测量到的所述比率低；
[0037]-Rasamsonia细胞，其中NHR/HR的比率低于约50,优选地低于约10,甚至更优选地 低于约1，最优选地低于约0. 001。
[0038]-Rasamsonia细胞，其基因组中具有修饰以使其在产生至少一种天冬氨酸蛋白酶 pepA方面存在缺陷；
[0039]-用于生产一种或多种酶的多肽组合物的方法，其包括下述步骤：
[0040] (a)通过在合适的培养基中培养本发明所述的Rasamsonia细胞生产多肽组合物， 其中所述细胞能够产生期望的多肽，例如酶，任选地其由重组核酸编码；和
[0041] (b)任选地，回收所述多肽组合物；
[0042] _用于生产包含纤维素、半纤维素和/或果胶中的一种或多种的多肽组合物的方 法，其包括下述步骤：
[0043] (a)通过在合适的培养基中培养根据本发明所述的Rasamsonia细胞生产多肽组 合物，其中所述细胞能够产生纤维素、半纤维素和/或果胶中的一种或多种，任选地其由重 组核酸编码；和
[0044] (b)任选地，回收所述多肽组合物；
[0045]-可来源于Rasamsonia细胞、优选的是Rasamsoniaemersonii细胞的核酸序列， 其编码参与非同源末端连接的多肽，其中所述核酸序列是：
[0046]a.SEQIDNO:20、SEQIDNO:23、SEQIDNO:26、SEQIDNO:29、SEQIDNO:32、 SEQIDN0:35,SEQIDN0:38,SEQIDN0:4USEQIDN0:44,SEQIDN0:47,SEQIDN0:50 或SEQIDN0:53所示的核酸序列；或者
[0047]b.编码与SEQIDNOSEQIDNO: 21、SEQIDNO: 24、SEQIDNO: 27、SEQIDNO: 30、 SEQIDNO:33,SEQIDNO:36,SEQIDNO:39,SEQIDNO:42,SEQIDNO:45,SEQIDNO:48, SEQIDN0:51或SEQIDN0:54所示的氨基酸序列有至少60%序列同一性的多肽的核酸序 列；
[0048]-可来源于Rasamsonia细胞、优选的是Rasamsoniaemersonii细胞的核酸序列， 其编码pepA天冬氨酸蛋白酶，其中所述核酸序列是：
[0049]a.SEQIDNO:58所示的核酸序列，或者
[0050]b.编码与SEQIDNOSEQIDN0:59所示的氨基酸序列有至少60%序列同一性的 多肽的核酸序列；
[0051]-包含本发明所述的核酸序列的重组核酸构建体；和
[0052]-由本发明的DNA序列编码的多肽。
[0053]附图简沐
[0054] 图1展示了质粒pDELNicB-3的示意图，其是用于使A.niger中的nicB基因失活的 替换盒的基础。替换盒包含nicB的侧翼区域、hygB标记盒、突变IoxP位点和E.coliDNA。 在实施例部分（参见下文）可以找到关于PDELNicB-3的更多细节。
[0055] 图2展示了质粒pDEL_PdxA_2的示意图，其是用于使A.niger中的pdxA基因失活 的替换盒的基础。替换盒包含PdxA的侧翼区域、ble标记盒、突变IoxP位点和E.coliDNA。 在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDEL_PdxA-2的更多细节。
[0056] 图3展示了质粒pDEL_EP0_Hyg-l的示意图，其包含使A.niger中的epo基因失活 的替换盒的一部分。替换盒包含epo的侧翼区域、hygB标记盒的一部分、突变IoxP位点和 E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDEL_EP0_Hyg_l的更多细节。
[0057] 图4展示了质粒pDEL_EP0_CRE_l的示意图，其包含使A.niger.中的印〇基因失 活的替换盒的一部分。替换盒包含epo的侧翼区域、hygB标记盒的一部分、突变IoxP位 点、ere重组酶表达盒和E.coliDNA。在实施例部分（参见下文）可以找到关于pDEL_EP0_ CRE-I的更多细节。
[0058] 图5展示了片段产生以及A.niger中的转化和重组中这些片段的使用的示意图。 顶部展示了利用PCR扩增产生"二重左"（"bipartiteleft"）和"二重右"（"bipartite right"）片段。底部图中展示了通过二重左片段和二重右片段在基因组内的同源重组转化 A.niger〇
[0059] 图6展示了片段产生以及A.niger中的转化和重组中这些片段的使用的示意图 (同样展示于图5)。这个特定实施例中的各二重（bipartit)片段不同，因为它们另外包含Cre重组酶盒。最后的图展示了Cre诱导的重组事件之后产生的基因组位点的布局。
[0060] 图7展示了Cre诱导的侧翼为IoxP的hygB选择标记的丢失。上部板是Cre未诱 导的转化体。下部板是通过涂布在作为碳源的木糖上而使Cre被诱导。百分比展示了Cre 诱导后，A.niger菌落中标记移除的百分比。
[0061] 图8描述了用于在真菌中瞬时表达ere重组酶的pEBA513的图谱。pEBA513是 PAMPF21衍生的载体，其包含AMl区域和CAT氯霉素抗性基因。显示的是ere重组酶基因 (ere)表达盒，其包含A.nigerglaA启动子（Pgla)、cre重组酶编码区和niaD终止子。此 外，还展示了由A.nidulansgpdA启动子（PgpdA)、hygB编码区和P.chrysogenumpenDE终 止子组成的潮霉素抗性盒。
[0062] 图9展示了利用PCR检测R.emersonii基因组中的pGBT0PEBA-205表达质粒。 分离并利用PCR分析来自转化体A-A4(泳道2-4)和空菌株（泳道5-7)的基因组DNA。 质粒DNA被用作PCR反应的对照模板：pGBT0PEBA-4(泳道8)、pGBT0PEBA-8 (泳道9)和 pGBTOPEBA-205 (泳道10)。在PCR反应中，加入针对pGBT0PEBA-4(泳道2、5和8,预计片 段：256bp)、pGBT0PEBA-8 (泳道 3、6 和 9,预计片段：306bp)和pGBT0PEBA-205 (泳道 4、7 和 10,预计片段：452bp)的引物。泳道1和11含有分子量标记。
[0063] 图10展示了无标记的R.emersonii转化体的表型分析和PCR分析。用milliQ水 (对照）或PEBA513构建体转化转化体A-A4以使ere重组酶瞬时表达，其中转化体A-A4含 有多拷贝的R.emersoniiCbhI和含有侧翼为IoxP的ble表达盒的pDEL_Pdx-A2质粒。
[0064](图10A):生长于含10yg/ml腐草霉素的PDA培养基（左侧图）和无选择的 PDA(右侧图）的转化体和空菌株的MTP板的图片。行A展示了A-A4的两种milliQ对照转 化体，其中A-A4包含具有侧翼为IoxP的ble表达盒（lox-ble-lox)的pDEL_Pdx_A2。行 B展示了pEBA513转化的两种A-A4转化体（lox-ble_lox+pEBA513)的生长。亲本转化体 A-A4(lox-ble_lox，转化前）生长于行C。最后，行D展示了空菌株的生长。
[0065](图10B):利用ere重组酶移除标记之前和之后的转化体以及ere重组酶构建 体的PCR分析。泳道2和泳道3展示了通过两种milliQ对照A-A4转化体的PCR分析得 到的PCR片段，其中使用针对ble表达构建体中的pdx侧翼的引物。如果转化体仍然含有 ble选择标记，那么2752bp的PCR条带是预计被扩增的PCR片段。泳道5和6展示了用 PEBA513转化的两种A-A4转化体的PCR分析，其中使用针对pEBA513cre重组酶表达质粒的 hygB基因的引物（314bp片段）。泳道8和9展示了用pEBA513转化的两种A-A4转化体的 PCR片段，其中使用针对bIe表达构建体的pdx侧翼的引物。88Ibp的PCR片段指示来源于 R.emersonii转化体的ble表达盒的缺失。泳道1、4和7含有分子量标记。
[0066] 图11描述了pEBAlOOl载体。部分载体片段和pEBA1002载体联合用于二重基因 革巴向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu800RF缺失。所述载体包含2500bp5'上游 侧翼区、lox66位点、由A.nidulansgpdA启动子驱动的ble编码序列的5'部分和pUC19 骨架（Invitrogen，Breda，荷兰）。转化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去 E.coliDNA0
[0067] 图12描述了pEBA1002载体。部分载体片段和pEBAlOOl载体联合用于二重基因靶 向方法以使Rasamsoniaemersonii中的ReKu800RF缺失。所述载体包含ble编码区的3' 部分、A.nidulanstrpC终止子、lox71 位点、ReKu800RF的 2500bp3' 下游侧翼区和pUC19 骨架（Invitrogen，Breda，荷兰）。转化R.emersonii菌株之前，用限制性酶Notl消化除去 E