专利名称：尿液分析用试剂及尿液分析方法
技术领域：
本发明涉及用于分析尿中有形成份的试剂及其分析方法。
背景技术：
在肾脏及尿道系统的感染症、炎症性病变、变性病变、结石和肿瘤等疾病中，不同的疾病尿液中会出现各种不同的有形成份。所谓有形成份包括红细胞、酵母样真菌、精子等。分析尿中的这些成份在泌尿系统疾病的早期发现和异常部位的判断上非常重要。
作为分析尿中有形成份的试剂，比如有美国专利号5891733上公开的试剂。美国专利号5891733上公开有包含碘化3，3’-二甲基-2，2’-氧杂羰花青(DiOCI(3)3，3’-dimethyl-2，2’-oxacarbocyanine iodide)等作为缩合苯衍生物的第一染料和溴化乙锭或碘化丙锭等能够对受损白细胞染色的第二染料在内的尿中有形成份分析用试剂。据美国专利号5891733记述，第一染料能够与细胞膜结合。美国专利号5891733还记述说，对第一染料来说，红细胞的染色性和酵母样真菌的染色性不同，因此，将红细胞和酵母样真菌之间的染色性差异作为荧光强度的不同来捕捉，并可据此区分红细胞和酵母样真菌。然而，美国专利号5891733关于以含精子的尿液为标本时区分精子与尿液中其他成份的方法没有记述。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够正确从尿中所含有形成份中识别精子的试剂及其方法。
即，本发明提供如下尿液分析用试剂，其包含
实际不损伤尿中红细胞膜而只损伤尿中酵母样真菌细胞膜的真菌细胞膜损伤物质；能够对酵母样真菌染色、使受损酵母样真菌的荧光强度比所述红细胞更强的第一色素；及对精子染色、使精子的荧光强度比受损酵母样真菌的荧光强度更强的第二色素。
其中所述真菌细胞膜损伤物质实际上不损伤精子的细胞膜。
其中所述真菌细胞膜损伤物质选自由芳香族醇、醋酸苯以及苯并噻唑化合物构成的组群。其中所述芳香族醇为苯氧基乙醇。
所述第一色素对受损酵母样真菌的核酸染色，并对精子的细胞膜染色。
所述第二色素是细胞膜渗透性比第一色素更强的色素。
所述第一色素和第二色素分别选自由下列化学式(1)式、(2)式和(3)式表示的荧光色素构成的组群中 式中，A1表示氧原子、硫原子、硒原子或C(CH3)2基；R1为低级烷基；X为卤或高氯酸；Y为-CH＝基或-NH-；m为1或2；n为0或1；B由下式表示 式中，A2为氧原子、硫原子或C(CH3)2基，R2为低级烷基、2个低级烷氧基取代的苯基或1个二低级烷基氨基取代的苯基，二低级烷基氨基的低级烷基也可用氰基取代。
所述第二色素的R1的碳原子数比第一色素的R1的碳原子数多。
所第一色素的极大吸收波长为630～640nm，所述第二色素的极大吸收波长为640～660nm。
所述真菌细胞膜损伤物质收于第一容器，所述第一色素和第二色素收于第二容器内。
本发明还提供有以下步骤的尿液分析方法对尿液进行荧光染色处理，制备测定用试样；其中，所述荧光染色处理实际上不损伤尿中所含红细胞膜，只损伤酵母样真菌细胞膜，对红细胞、酵母样真菌和精子染色，使酵母样真菌荧光强度强于红细胞荧光强度、精子荧光强度强于酵母样真菌荧光强度；用光束照射所述测定用试样，从该测定用试样中取得散射光信息和荧光信息；及根据所述散射光信息和所述荧光信息，鉴别所述测定用试样中的精子。
所述荧光染色处理用以下物质实施实际上不损伤尿中红细胞膜、只损伤尿中酵母样真菌细胞膜的真菌细胞膜损伤物质；能对酵母样真菌染色、使受损酵母样真菌的荧光强度强于所述红细胞荧光强度的第一色素；及对精子染色、使精子的荧光强度强于所述受损酵母样真菌的第二色素。
本发明进一步提供一种尿液分析方法，包括以下步骤混合尿液、真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素，其中所述真菌细胞膜损伤物质实际上不损伤尿中红细胞膜、只损伤尿中酵母样真菌细胞膜，所述第一色素能对酵母样真菌染色，使受损酵母样真菌的荧光强度强于所述红细胞荧光强度，所述第二色素对精子染色，使精子的荧光强度强于所述受损酵母样真菌的荧光强度；光束照射所述混合液，从所述混合液获取散射光信息和荧光信息；及根据所述散射光信息和荧光信息，识别所述混合液所含精子。
其还包含对识别出的精子计数的步骤。
所述散射光信息为前向散射光强度，所述荧光信息为荧光强度。
其中在所述识别步骤中，分别识别所述混合液中所含红细胞、酵母样真菌和精子。
图1为用含有第一色素和第二色素的尿液分析用试剂测定含精子和酵母样真菌的尿液时所得散点图的概念图。
图2为用含第一色素的试剂测定含精子和酵母样真菌的尿液时所得散点图的概念图。
图3图示了NK136的浓度与精子的染色性之间的关系。
图4为实施例1所得散点图。
图5为比较例1所得散点图。
图6为实施例2所得散点图。
图7为比较例2所得散点图。
图8为实施例3所得散点图。
图9为比较例3所得散点图。
具体实施例方式[尿样分析用试剂]本实施方式的尿液分析用试剂包含实际上不损伤尿中红细胞膜、只损伤尿中酵母样真菌细胞膜的真菌细胞膜损伤物质；能对酵母样真菌染色、使受损酵母样真菌荧光强度强于实际上未受损的红细胞的荧光强度的第一色素；及对精子染色、使精子的荧光强度强于受损酵母样真菌荧光强度的第二色素。使用此尿液分析用试剂，能够准确识别尿中有形成份中的精子。
本说明书中所谓“细胞膜损伤”，指在细胞膜形成特定物质能够通过的细孔道。
(1)真菌细胞膜损伤物质真菌细胞膜损伤物质系指破坏尿中酵母样真菌细胞膜的物质。真菌细胞膜损伤物质具有在部分酵母样真菌细胞膜形成细孔的作用。由于这一物质，细胞膜上产生细孔，于是，当用色素处理细胞时，色素很容易通过这些细孔进入细胞内。细胞膜受损的细胞不仅细胞膜表面，细胞内物质(如核酸等)也能被色素染色。其结果，细胞膜受损的细胞比膜未受损细胞色素染色性高。因此，通过使用真菌细胞膜损伤物质和能够对细胞膜受损的有形成份染色的色素，就可以识别有受损细胞膜的有形成份和无受损细胞膜的有形成份。
真菌细胞膜损伤物质以不溶解红细胞的物质为宜。而且，真菌细胞膜损伤物质优选实际上不损伤精子细胞膜的物质。
此种真菌细胞膜损伤物质有中国专利公开公报第1755348号(美国美国申请公开号No.2006-0073601)记述的含苯环非离子型有机化合物。具体而言，有苄醇、苯乙醇、苯酚、1-苯氧基-2丙醇、2-苯氧基乙醇等芳香族醇和醋酸苯以及2-氨基苯并噻唑、苯并噻唑等苯并噻唑化合物。其中优选2-苯氧基乙醇。
真菌细胞膜损伤物质只要在试剂中含有满足以下条件的浓度即可。该条件即当尿液与试剂混合时能够损伤酵母样真菌细胞膜而不给尿中红细胞膜以实质损伤。真菌细胞膜损伤物质的浓度根据其损伤能力适当选择即可。例如当真菌细胞膜损伤物质为2-苯氧基乙醇时，其最终浓度以0.3～1.5％为宜，0.5～1.0％更好，最好是0.5～0.7％。在此，所谓最终浓度指在尿液与试剂混合制备的测定用试样中的浓度。
(2)第一色素第一色素是能够染色酵母样真菌的色素，它可使受损酵母样真菌荧光强度强于实际未受损红细胞的荧光强度。此第一色素从破损产生的细胞膜细孔进入细胞质内，对受损细胞荧光染色。通常，进入细胞质内的色素量与细胞膜受损程度有关。
真菌其种类繁多，因此尺寸也多种多样。大型真菌其大小有时类似红细胞。这时，很难通过散射光区分大型真菌和红细胞。因此，可望根据色素的染色性差异来区分大型真菌和红细胞。第一色素可以从真菌细胞膜损伤物质产生的细胞膜细孔进入细胞质内对酵母样真菌染色。因此，使用第一色素可以使膜受损的真菌和膜实际上没有受损的红细胞之间产生染色性差异。即，比起实际上未受损红细胞和精子来，第一色素更多地进入被真菌细胞膜损伤物质损伤的酵母样真菌的细胞质内。因此，酵母样真菌的第一色素染色性高于红细胞和精子的第一色素染色性。如上所述，因为第一色素可以荧光染色，所以色素的染色性能够作为荧光强度显示出来。
作为第一色素，没有特别限定，只要是能够对细胞内物质荧光染色的色素即可。这是因为，如上所述，第一色素的染色性主要取决于真菌细胞膜损伤物质造成的细胞膜损伤程度。由于能对核酸荧光染色的色素有助于从无核红细胞和有核酵母样真菌的染色性上区分，故作为第一色素较受欢迎。
另外，第一色素应该可以对细胞膜未受损的红细胞和精子的细胞膜染色，而且，对精子的细胞膜染色比红细胞膜更强为宜。红细胞和精子的细胞膜实际上并未在真菌细胞膜损伤物质的作用下受损伤，因此，第一色素实际上无法通过细胞膜。然而，通过使用如上所述第一色素，红细胞和精子被染色，而且精子的细胞膜比红细胞着色性更好，这样就可以轻易识别红细胞和精子。
这种第一色素可从由下列化学式(1)式、(2)式和(3)式表示的荧光色素构成的组群中选择。
(1)式、(2)式和(3)式中，A1表示氧原子、硫原子、硒原子或C(CH3)2基。R1为低级烷基。X为卤或高氯酸。Y为-CH＝基或-NH-。m为1或2。n为0或1。
B由下式表示 所述式中，A2为氧原子、硫原子或C(CH3)2基。R2为低级烷基、2个低级烷氧基取代的苯基或1个二低级烷基氨基取代的苯基。此二低级烷基氨基的低级烷基也可用氰基取代。
(1)～(3)式中，A1和A2可相同也可不同。R1和R2可相同也可不同。
具有所述化学结构的荧光色素可与细胞膜结合。且具有所述化学结构的荧光色素在结合或吸附于精子和红细胞等的未受损细胞膜并对其染色的同时，从细胞膜受损的酵母样真菌的细胞膜细孔中进入细胞质内，对核酸染色。
所述低级烷基指碳原子为1～6的烷基。作为低级烷基比如可以是甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、己基等。X的卤原子有氟、氯、溴、碘等。B中用2个低级烷氧基取代的苯基指2个C1-3的烷氧基、最好用C1-2的烷氧基(如甲氧基、乙氧基)取代的苯基。作为2个低级烷氧基取代的苯基，具体而言，可以是2，6-二甲氧苯基和2，6-二乙氧苯基等。B中用二低级烷基氨基取代的苯基意指C1-3的烷基氨基、最好是C1-2的烷基氨基取代的苯基。二低级烷基氨基的烷基也可用氰基取代，比如包括甲基、乙基、氰甲基、氰乙基等。作为理想的二低级烷基氨基取代的苯基有4-二甲氨苯基、4-二乙氨苯基、4-(氰乙甲氨)苯基等。
以下为这种荧光色素的具体举例
所述荧光色素中，NK-系列可以从林原生物化学研究所(株)购得。
也可根据色素的种类和分析仪器而定，但第一色素在试剂中的浓度以其在测定用试样(试剂与尿液的混合物)的最终浓度达到3～9ppm为宜。
(3)第二色素第二色素是对精子染色、使其荧光强度超过受损酵母样真菌的荧光强度的色素。此第二色素可以对精子进行比受损酵母样真菌更强的荧光染色，且第二色素的细胞膜渗透性比第一色素高，可以对细胞膜未受损的精子和红细胞等荧光染色。第二色素既可以结合或吸附到细胞膜、对细胞膜染色，也可渗透到细胞膜内，进入细胞质内对细胞内物质(比如核酸)染色。
第二色素应选用对精子细胞膜特别渗透性高的色素。酵母样真菌由于其种类繁多，其大小和细胞膜也多种多样，因此，不同的真菌种类，有的既不太受真菌细胞膜损伤物质损伤，又不太被第一色素染色。这种酵母样真菌如果尺寸小的话，则第一色素的染色性及尺寸都类似于精子，很难区分酵母样真菌和精子。于是，通过运用比第一色素膜渗透性高、对精子的膜渗透性更高的第二色素，就可对第一色素难以染色的精子染色，使精子与酵母样真菌的区分变得更容易。
作为这种第二色素，可以从以下化学式(1)式、(2)式和(3)式表达的荧光色素构成的组群中选择。
(1)式、(2)式和(3)式中，A1代表氧原子、硫原子、硒原子或C(CH3)2基。R1为低级烷基。X为卤或高氯酸。Y为-CH＝基或-NH-。m为1或2。n为0或1。B由下式表示 式中，A2为氧原子、硫原子或C(CH3)2基。R2为低级烷基、2个低级烷氧基取代的苯基或1个二低级烷基氨基取代的苯基。此二低级烷基氨基的低级烷基也可用氰基取代。
(1)～(3)式中，A1和A2可相同也可不同。R1和R2可相同也可不同。
所述低级烷基意指碳原子为1～6的烷基。作为低级烷基比如可以是甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、戊基、己基等。X的卤原子有氟、氯、溴、碘等。B中用2个低级烷氧基取代的苯基指2个C1-3的烷氧基、最好用C1-2的烷氧基(如甲氧基、乙氧基)取代的苯基。作为2个低级烷氧基取代的苯基，具体而言，可以是2，6-二甲氧苯基和2，6-二乙氧苯基。B中用二低级烷基氨基取代的苯基意指C1-3的烷基氨基、最好是C1-2的烷基氨基取代的苯基。二低级烷基氨基的烷基也可用氰基取代，比如包括甲基、乙基、氰甲基、氰乙基等。作为理想的二低级烷基氨基取代的苯基有4-二甲氨苯基、4-二乙氨苯基、4-(氰乙甲氨)苯基等。
以下为这种荧光色素的具体举例
所述荧光色素中，NK-系列可以从林原生物化学研究所(株)购得。
以上作为第二色素例举的(1)式、(2)式和(3)式所示色素与作为第一色素例举的(1)式、(2)式和(3)式所示色素相同，因此，当第一色素从(1)式、(2)式和(3)式表示的色素群中选择时，第二色素最好选择比所选第一色素膜渗透性高、特别是对精子细胞膜渗透性比第一色素高的色素。
此种第一色素和第二色素的组合比如可以是在所述(1)式、(2)式和(3)式表示的荧光色素中R1或A1不同的组合。通过改变R1的烷基碳原子数，可以改变膜渗透性。比如，R1为乙基和丙基的荧光色素比R1为甲基的荧光色素膜渗透性高。作为R1为乙基和丙基的荧光色素，比如有NK-136和NK-2251。R1为甲基的荧光色素有NK529。一般在(1)式、(2)式或(3)式所表示的色素中，R1的碳原子数越多，膜渗透性就越高。因此，以第二色素的R1碳原子数比第一色素的R1碳原子数多为宜。
第一色素的极大吸收波长和第二色素的极大吸收波长可同可不同。如果第一色素和第二色素的极大吸收波长不同，则分析尿液时可以使用不仅具有第一色素的励起用光源还具备第二色素的励起用光源的分析装置。另一方面，如果使用只有一种波长光照的光源，则最好光源照射的波长既为第一色素的吸收波长，也是第二色素的吸收波长，还应是第一色素的极大吸收波长。如果使用第一色素的极大吸收波长的光源，则第二色素也应由于第一色素发出的光束而励起。至少应该做到一方色素发出的光不会让另一方的荧光消失。
当第一色素和第二色素的励起光不同时，以所述第一色素的极大吸收波长为630～640nm、所述第二色素的极大吸收波长为640～660nm为宜。
比如，当使用633nm的红色激光时，以第一色素用NK-529、第二色素使用NK-136及/或NK2251为宜。
第二色素的理想浓度只要根据色素的种类、所用分析装置、进而与第一色素的种类的组合适当选择即可。比如使用NK-529作为第一色素、NK-136作为第二色素时，第二色素的最终浓度以0.1～1.2ppm为宜，最好是0.3～0.6ppm。在此，最终浓度指尿液与试剂混合制备的测定用试样中的浓度。
(4)其他成份本实施方式的尿液分析用试剂除真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素外，还应含有以下成份(4-1)缓冲剂为保持缓冲能在不损伤红细胞和精子的细胞膜的pH值范围内，最好在尿液分析试剂中添加缓冲剂。
作为缓冲剂，以能使试剂的pH值为5.0～9.0范围内为宜，pH值为6.5～8.6范围内更好，pH值为7.0～7.8最好。一旦试剂的pH值超过9.0达到强碱性，红细胞就可能溶血。而pH值低于5.0，则有可能红细胞受损或尿中有形成份的染色性整体下降。
作为缓冲剂，只要可以使试剂的pH值保持在所希望的范围内即可，比如可以使用三羟甲基氨基甲烷以及诸如2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)、双(三(羟甲基)氨基甲烷)(Bis-Tris)、N-(2-乙酰氨基)-亚氨基二醋酸(ADA)、哌嗪-NN-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙烷磺酸(ACES)、3-(N-码啉基)-2-羟基丙磺酸钠(MOPSO)、2-(二乙醇胺基)乙磺酸(BES)、3-(N-吗啡啉)丙烷磺酸钠(MOPS)、三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-[N，N-双(2-羟乙基)]氨基-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、3-三羟甲基甲胺-2-羟基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N′-双(2-羟基丙磺酸)(POPSO)、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-羟基丙磺酸(HEPPSO)、N-2-羟乙基哌嗪-N′-3-丙磺酸(EPPS)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸(Bicine)和N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等良好(Good)缓冲剂等。其中，以4-羟乙基哌嗪乙磺酸为最适用。缓冲剂根据其缓冲能，其浓度以与尿混合时pH值达到某一范围内为宜。具体而言，缓冲剂浓度为20～500mM，最好为50～200mM。
(4-2)渗透压补偿剂为了保持渗透压使红细胞和精子的细胞膜免受损伤，最好添加渗透压补偿剂。尿液的渗透压范围很广，为50～1300mOsm/kg，分析用试剂的渗透压过低，红细胞会迅速溶血，反之，过高则尿中有形成份的损伤加大。因此，分析用试剂的渗透压以100～600mOsm/kg为宜，150～500mOsm/kg更好。
为保持这种渗透压而使用的渗透压补偿剂，有无机盐类及丙酸盐等有机盐类，还有糖类等。作为无机盐类可以用氯化钠、氯化钾、溴化钠等。有机盐类中，作为丙酸盐，可以使用丙酸钠、丙酸钾、丙酸铵等；其他有机盐类可以使用草酸盐和醋酸盐等。糖类可以使用山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等。
(4-3)螯合剂在尿液分析中，为了减少尿中出现无晶型盐类(比如磷酸铵、磷酸镁和碳酸钙)的影响，还应添加溶解无晶型盐类的螯合剂。螯合剂只要是脱钙剂、脱镁剂即可，并无种类的限制。比如可以是乙二胺四乙酸(EDTA)盐类、环己二胺四乙酸(CyDTA)、N-2(乙二醇)甘氪酸(DHEG)、DPTA-OH、EDDA、EDDP、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(GEDTA)、N一羟乙基乙胺三乙酸(HDTA)、亚氨二乙酸(HIDA)、Metyl-EDTA、氮川三乙酸(NTA)、多聚磷酸盐(NTP)、NTPO、EDDPO等。其中以乙二胺四乙酸(EDTA)盐类、环己二胺四乙酸和GEDTA最适宜。
螯合剂只要在试剂中含有其最终浓度为0.05～5W/W％的范围内即可，最好含有0.1～1W/W％。在此，最终浓度指在尿液与试剂混合制备的测定用试样中的浓度。
(4-4)表面活性剂要提高真菌细胞膜损伤物质的溶解性，也可以在试剂中添加十四烷基三甲基溴化铵(MTAB)、十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)和辛基三甲基溴化铵(OTAB)等表面活性剂。试剂中的表面活性剂浓度过高，会溶解红细胞和精子的细胞膜，因此，表面活性剂在试剂中的浓度以不使红细胞溶血为宜，还以不损伤精子的细胞膜的浓度为宜。
(5)试剂盒本实施方式中的尿液分析用试剂当然也可以是集真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素以及根据需要加入的缓冲剂等其他成份于同一容器中的一液态试剂，但不限于此。
从第一色素和第二色素的稳定性看，最好将含有真菌细胞膜损伤物质的第一试剂和含有第一色素和第二色素的第二试剂分别装入不同的容器，作为具有这些试剂的试剂盒。
试剂盒中，含有真菌细胞膜损伤物质的第一试剂中应添加缓冲剂、渗透压补偿剂、表面活性剂和螯合剂。
另一方面，以上作为第一色素和第二色素举例的那种荧光色素在水溶液中大多易分解，因此，第二试剂最好让第一色素和第二色素溶解到水溶性有机溶剂。
作为水溶性有机溶剂宜使用低级链烷醇、低级亚烷基醇和低级亚烷基醇一低级烷基醚。作为水溶性有机溶剂比如可以使用甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、乙二醇一甲醚、乙二醇一乙醚等。其中乙二醇、二甘醇和三甘醇等葡萄糖类更适宜。从粘性和对尿中有形成份的影响考虑，乙二醇最好。
本实施方式的尿液分析方法包括以下步骤对尿进行荧光染色处理，制备测定用试样；激光照射测定用试样，从测定用试样取得散射光信息和荧光信息；根据取得的信息，识别精子。
所述荧光染色处理实际上没有损伤尿中红细胞膜，而只破坏了尿中酵母样真菌的细胞膜，然后对红细胞、酵母样真菌和精子染色，使酵母样真菌的荧光强度高于红细胞荧光强度，精子荧光强度高于酵母样真菌的荧光强度。
因此，用此尿液分析方法可以正确识别尿液所含有形成份中的精子。在识别步骤中，如果还要识别红细胞和酵母样真菌的话，还可以分别正确识别红细胞和酵母样真菌。而且，在所述尿液分析方法中加入对识别出来的精子计数的步骤，还可以准确计数精子。
在所述制备测定用试样步骤中，对尿液进行荧光染色处理，制备测定用试样。此荧光染色处理对尿中酵母样真菌细胞膜加以破坏，而对尿中红细胞实际上不予损伤。且此荧光染色处理对红细胞、酵母样真菌和精子进行荧光染色，使酵母样真菌的荧光强度强于红细胞荧光强度，精子荧光强度高于酵母样真菌的荧光强度。此处理具体而言可以通过将所述尿液分析用试剂和尿液混合来进行。
将尿液与尿液分析用试剂混合，则试剂中的真菌细胞膜损伤物质损伤酵母样真菌细胞膜，试剂中的第一色素透过受损细胞膜对酵母样真菌染色。另一方面，在真菌细胞膜损伤物质中没有溶血的红细胞则没有象酵母样真菌那样被第一色素染色，结果，红细胞的荧光强度没有酵母样真菌的荧光强度强。真菌细胞膜损伤物质对精子实际上不起作用，因此，精子的细胞膜实际上也没有受损伤，第一色素与精子细胞膜结合使精子染色。
第二色素比第一色素膜渗透性大，且对精子细胞膜的特异性高，因此，第二色素即使膜未受损也可以与精子细胞膜结合，对精子整个细胞膜染色，有时可以染色到细胞质内。从而经过第二色素荧光染色处理，精子的荧光强度比酵母样真菌强。
在取得散射光信息和荧光信息的步骤中，使用的光源至少能够励起第一色素和第二色素中一种色素即可，但最好是能够励起两种色素的光源。照射只励起一种色素的光源时，另一种色素需要被励起的色素放射的荧光励起。即，在这种情况下，作为所用尿液分析试剂所含色素的组合，最好含有双方色素都能励起的色素组合。
激光照射用这种尿液分析试剂制备的测定用试样，则测定用试样中的第一色素和第二色素被励起。这样就可以取得反映测定用试样中有形成份形态信息的散射光信息和反映有形成份的染色强度信息的荧光信息。
要从测定用试样中获取散射光信息和荧光信息，可以将测定用试样导入流式细胞仪的流动室，用励起荧光色素的励起光照射在流动室内流动的测定用试样。
散射光信息是散射光强度，最好是前向散射光强度。前向散射光强度一般反映对应于细胞大小的信息。
荧光信息最好是荧光强度。荧光强度反映细胞的荧光染色的强度。
在识别步骤中，根据取得的散射光信息和荧光信息，识别精子和尿中其他有形成份。如上所述，在测定用试样制备步骤中，红细胞、酵母样真菌和精子被荧光染色，且酵母样真菌的荧光强度强于红细胞荧光强度，精子的荧光强度强于酵母样真菌的荧光强度。因此，通过散射光信息和荧光信息就能够准确识别尿中精子。比如，在此识别步骤中，绘制以散射光强度和荧光强度为纵横二轴的散点图，通过划定精子出现的区域，即可识别精子。在此识别步骤中，根据散射光信息和荧光信息还可正确识别红细胞和酵母样真菌。比如，绘制以散射光强度和荧光强度为纵横二轴的散点图，通过分别划定红细胞和酵母样真菌出现的区域，即可分别识别红细胞和酵母样真菌。
再通过追加的对识别出的精子进行计数的步骤，即可正确计数精子。如果在识别步骤中也识别红细胞和酵母样真菌的话，在此计数步骤中也可正确计数红细胞和酵母样真菌。
图1是用所述尿液分析试剂(即含真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素的尿液分析用试剂)以所述方法分析尿液所取得的散点图的概念图。作为参考，图2显示了使用含真菌细胞膜损伤物质和第一色素但不含第二色素的试剂、以所述方法分析尿液所取得的散点图的概念图。二者均为纵轴是散射光强度，横轴为荧光强度。使用含真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素的尿液分析用试剂时，酵母样真菌被第一色素染色，其结果如图1所示，在散点图中，相对于红细胞团出现的区域(以下称红细胞区域)，酵母样真菌团出现在荧光强度高的位置。当使用含有真菌细胞膜损伤物质和第一色素、不含第二色素的试剂时也一样，如图2所示，在散点图中，相对于红细胞区域，酵母样真菌团出现在荧光强度高的位置。但是，此试剂不含第二色素，因此，在图2中精子团出现的区域(以下称精子区域)与酵母样真菌团出现的部分区域重合。与此相反，使用含有真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素的试剂时，精子既被第一色素染色，又被第二色素染色，结果如图1所示，精子区域朝着荧光强度高的方向移动，从而可以避免与酵母样真菌团区域重合。这样就可以明确区分酵母样真菌团和精子团。
使用含有真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素的试剂时，如图1所示，可以明确区分红细胞区域、酵母样真菌团和精子团。因此，计算各团出现的个数就可以求出各自在有形成份试样中的数量和含有率。
作为本实施方式的尿液分析试剂适用的尿样分析装置可以列举出具备以下部分和功能的装置照射具有前述荧光色素励起波长的光束的励起光用光源；从试样中获取有形成份发出的散射光和荧光的受光器；处理所得散射光的信息和所得荧光的信息、判断所述有形成份是红细胞、酵母样真菌还是精子的信息处理手段。
最好关于所述散射光的信息是散射光强度，所述荧光的信息是荧光强度。
信息处理手段最好具备识别和计数手段，以通过判断获取的散射光强度和荧光强度属于红细胞、酵母样真菌还是精子，来识别尿样中所含红细胞、酵母样真菌和精子并对其计数。
计数手段最好能绘制以前向散射光强度和荧光强度为二轴的散点图，划定红细胞团、酵母样真菌团和精子团，来计数该团所含点数。也可具备计算划定区域中的平均荧光强度和平均散射光强度等的演算手段。
此外，关于精子团的划定，比如，也可通过以下演算手段进行散点图比较并划定精子团。即混合不含第二色素的试剂和尿液制备出比较用试样，根据该比较用试样的散射光信息和荧光信息绘制出散点图，再混合本发明的试剂和尿液制备出比较用试样，根据该比较用试样的散射光信息和荧光信息绘制出散点图，将二者的散点图进行比较，根据比较结果划定区域。
分析装置也可具备显示绘制的散点图和演算结果的显示器。
(实施例)[测定用试样的制备方法](1)真菌细胞膜损伤物质含有液用2-苯氧基乙醇为真菌细胞膜损伤物质。分别按以下所示浓度添加缓冲剂、渗透压补偿剂、螯合剂和pH调节剂，配制第一试剂。
HEPES 11.9g/l丙酸钠 5.98g/lEDTA-3K 4.0g/l2-苯氧基乙醇7.5g/l苛性钠 pH值达到7.2的量(2)色素含有液(2-1)色素含有液A将NK529作为第一色素溶解于二甘醇来配制色素含有液A。
NK529可被本实施例使用的流式细胞仪配备的励起用光源发出的红色激光束(波长635nm)励起。在本实施例使用的流式细胞仪将全自动尿有形成份分析仪UF110i(SYSMEX公司研制)中的氩激光光源取代为半导体激光光源。以下简称为流式细胞仪。
(2-2)色素含有液B将NK529作为第一色素、NK136作为第二色素溶解于二甘醇来配制色素含有液B。
(2-3)色素含有液C将NK529作为第一色素、NK2251作为第二色素溶解于二甘醇来配制色素含有液C。
(3)与尿标本混合将尿标本与所述真菌细胞膜损伤物质含有液按1∶3的比例混合，再添加色素含有液，使第一色素的最终浓度为6ppm，配制出测定用试样。
使用第二色素浓度不同的6种色素含有液B调查了第二色素浓度与精子染色性之间的关系。作为第一色素的NK529，添加于色素含有液B，其加入量为其在测定用试样中的最终浓度达6ppm。作为第二色素的NK136则在色素含有液B中加入的量分别为其最终浓度达到0.3ppm、0.6ppm、1.2ppm、1.5ppm、3ppm或6ppm。
用第二色素浓度不同的6种色素含有液B、有精子出现的尿标本和所述真菌细胞膜损伤物质含有液制备6种测定用试样。将制备的各种测定用试样放入流式细胞仪，测定其荧光强度。
再用色素含有液A取代色素含有液B，同样制备测定用试样，将其放入流式细胞仪，测定NK136含量为0ppm时的荧光强度。
结果如图3所示。在图3中，纵轴为荧光强度，横轴为第二色素NK136的浓度(最终浓度)。
从图3可以看出，NK136的浓度在0.3～1.2ppm范围内荧光强度越来越高，但即使超出此范围的高浓度，荧光强度也不会再增加。
作为尿标本1，使用的是有精子出现的人的尿液。
实施例1色素含有液使用的是配制出的NK529最终浓度为6ppm、NK136最终浓度为0.6ppm的色素含有液B。
将尿标本1与真菌细胞膜损伤物质含有液混合，再与所述色素含有液B混合，制备出测定用试样。
将制备出的测定用试样导入流动室，用流式细胞仪检测，绘制出以荧光强度(横轴)和前向散射光强度(纵轴)为二轴的二维散点图。所得散点图如图4所示。在该散点图中，划定了被认为是精子出现的区域(散点图中用实线圈划的区域)。从出现在这一区域内的精子检测出荧光强度平均值为165。
比较例1用色素含有液A(NK529最终浓度为6ppm)和实施例1同样从尿标本1制备测定用试样。
将制备的测定用试样导入流动室，用流式细胞仪测定，绘制以荧光强度(横轴)和前向散射光强度(纵轴)为二轴的二维散点图。所得散点图如图5所示。在该散点图中，划定了被认为是精子出现的区域(散点图中用实线圈划的区域)。从出现在这一区域内的精子检测出荧光强度平均值为110。
从图4和图5的比较和所得各荧光强度平均值中可以看出，使用包含NK136作为第二色素的试剂(实施例1)精子团出现在荧光强度更高的区域。
作为尿标本2，使用的是有酵母样真菌出现的人的尿液。
实施例2色素含有液使用的是配制出的NK529最终浓度为6ppm、NK136最终浓度为0.6ppm的色素含有液B。
将尿标本2与真菌细胞膜损伤物质含有液混合，再与所述色素含有液B混合，制备出尿标本2的测定用试样。
将制备出的测定用试样导入流动室，用流式细胞仪检测，绘制出以荧光强度(横轴)和前向散射光强度(纵轴)为二轴的二维散点图。所得散点图如图6所示。在该散点图中，计算出被认为是精子出现区域(图中用实线圈划的部分)的荧光强度平均值，结果为87。
比较例2用色素含有液A(NK529最终浓度为6ppm)和实施例2同样从尿标本2制备测定用试样。
将制备的测定用试样导入流动室，用流式细胞仪测定，绘制以荧光强度(横轴)和前向散射光强度(纵轴)为二轴的二维散点图。所得散点图如图7所示。在该散点图中，划定了被认为是精子出现的区域(散点图中用实线圈划的区域)。从出现在这一区域内的精子检测出荧光强度平均值为87。
从图6和图7的比较和所得各荧光强度平均值中可以看出，试剂中的第二色素实际上并未对酵母样真菌出现的位置产生影响。
作为尿标本3使用的是有精子出现的人的尿液。
实施例3色素含有液使用的是配制出的NK529最终浓度为6ppm、NK2251最终浓度为0.6ppm的色素含有液C。
将尿标本3与真菌细胞膜损伤物质含有液混合，再与所述色素含有液C混合，制备出尿标本3的测定用试样。
将制备出的测定用试样导入流动室，用流式细胞仪检测，绘制出以荧光强度(横轴)和前向散射光强度(纵轴)为二轴的二维散点图。所得散点图如图8所示。在该散点图中，划定了被认为是精子出现的区域(散点图中用实线圈划的区域)。从出现在这一区域内的精子检测出的荧光强度平均值为165。
比较例3用色素含有液A(NK529最终浓度为6ppm)和实施例3同样从尿标本3制备测定用试样，用流式细胞仪测定，绘制以荧光强度(横轴)和前向散射光强度(纵轴)为二轴的二维散点图。所得散点图如图9所示。在该散点图中，划定了被认为是精子出现的区域(散点图中用实线圈划的区域)。从出现在这一区域内的精子检测出的荧光强度平均值为126。
从图8和图9的比较和所得各荧光强度平均值中可以看出，使用包含NK2251作为第二色素的试剂会增强精子的染色性，使精子团出现的位置向右(高荧光强度)偏移。
从以上调查得知，使用含有膜渗透性比第一色素高的第二色素的尿液分析试剂，可以将被认为是精子出现的区域设定在高荧光强度一侧，以区分被认为是酵母样真菌出现的区域。同时，将从不含第二色素的试剂和含有第二色素的试剂得出的各散点图重合比较，也可以将有差异出现在高荧光强度区域的粒子团划定为精子团。因此，使用本发明的分析用试剂可以正确鉴别酵母样真菌、红细胞和精子，从而实现高精度分析。
权利要求
1.一种尿液分析用试剂，包含实际不损伤尿中红细胞膜而只损伤尿中酵母样真菌细胞膜的真菌细胞膜损伤物质；能够使酵母样真菌染色、使受损酵母样真菌的荧光强度比所述红细胞更强的第一色素；及对精子染色、使精子的荧光强度比受损酵母样真菌的荧光强度更强的第二色素。
2.权利要求1所述试剂，其中所述真菌细胞膜损伤物质实际上不损伤精子的细胞膜。
3.权利要求1所述试剂，其中所述真菌细胞膜损伤物质选自由芳香族醇、醋酸苯以及苯并噻唑化合物构成的组群。
4.权利要求3所述试剂，其中所述芳香族醇为苯氧基乙醇。
5.权利要求1所述试剂，其中所述第一色素对受损酵母样真菌的核酸染色，并对精子的细胞膜染色。
6.权利要求1所述试剂，其中所述第二色素是细胞膜渗透性比第一色素更强的色素。
7.权利要求1所述试剂，其中所述第一色素和第二色素分别选自由下列化学式(1)式、(2)式和(3)式表示的荧光色素构成的组群中 式中，A1表示氧原子、硫原子、硒原子或C(CH3)2基；R1为低级烷基；X为卤或高氯酸；Y为-CH＝基或-NH-；m为1或2；n为0或1；B由下式表示 式中，A2为氧原子、硫原子或C(CH3)2基，R2为低级烷基、2个低级烷氧基取代的苯基或1个二低级烷基氨基取代的苯基，二低级烷基氨基的低级烷基也可用氰基取代。
8.权利要求7所述试剂，其中所述第二色素的R1的碳原子数比第一色素的R1的碳原子数多。
9.权利要求1所述试剂，其中所第一色素的极大吸收波长为630～640nm，所述第二色素的极大吸收波长为640～660nm。
10.权利要求1所述试剂，其中所述真菌细胞膜损伤物质收于第一容器，所述第一色素和第二色素收于第二容器内。
11.一种尿液分析方法，包括以下步骤对尿液进行荧光染色处理，制备测定用试样；其中，所述荧光染色处理实际上不损伤尿中所含红细胞膜，只损伤酵母样真菌细胞膜，对红细胞、酵母样真菌和精子染色，使酵母样真菌荧光强度强于红细胞荧光强度、精子荧光强度强于酵母样真菌荧光强度；用光束照射所述测定用试样，从该测定用试样中取得散射光信息和荧光信息；及根据所述散射光信息和所述荧光信息，鉴别所述测定用试样中的精子。
12.权利要求11所述方法，其中，所述荧光染色处理用以下物质实施实际上不损伤尿中红细胞膜、只损伤尿中酵母样真菌细胞膜的真菌细胞膜损伤物质；能对酵母样真菌染色、使受损酵母样真菌的荧光强度强于所述红细胞荧光强度的第一色素；及对精子染色、使精子的荧光强度强于所述受损酵母样真菌的第二色素。
13.一种尿液分析方法，包括以下步骤混合尿液、真菌细胞膜损伤物质、第一色素和第二色素，其中所述真菌细胞膜损伤物质实际上不损伤尿中红细胞膜、只损伤尿中酵母样真菌细胞膜，所述第一色素能对酵母样真菌染色，使受损酵母样真菌的荧光强度强于所述红细胞荧光强度，所述第二色素对精子染色，使精子的荧光强度强于所述受损酵母样真菌的荧光强度；光束照射所述混合液，从所述混合液获取散射光信息和荧光信息；及根据所述散射光信息和荧光信息，识别所述混合液所含精子。
14.权利要求13所述方法，还可以包含对识别出的精子计数的步骤。
15.权利要求13所述方法，其中，所述散射光信息为前向散射光强度，所述荧光信息为荧光强度。
16.权利要求13所述方法，其中，在所述识别步骤中，分别识别所述混合液中所含红细胞、酵母样真菌和精子。
全文摘要
本发明提供能够从尿中有形成份中正确识别精子的试剂。这个试剂包含实际不损伤尿中红细胞膜而只损伤尿中酵母样真菌细胞膜的真菌细胞膜损伤物质；能够对酵母样真菌染色、使受损酵母样真菌的荧光强度比没有受损的红细胞更强的第一色素；及对精子染色、使精子的荧光强度比受损酵母样真菌的荧光强度更强的第二色素。本发明还提供能正确识别尿中有形成份中的精子的方法。
文档编号C09K11/00GK101042397SQ200710079770
公开日2007年9月26日 申请日期2007年3月9日 优先权日2006年3月22日
发明者河岛康之 申请人:希森美康株式会社