本发明属于分子标记的技术领域，具体涉及一种玉米单株穗重主效QTL、其获得方法及应用。
背景技术：
玉米是重要的粮食与饲料作物，是世界三大作物之一，且我国目前玉米已上升为第一大粮食作物。高产是玉米育种工作者追求的永恒主题和方向，也是玉米育种的重要目标。产量性状是由多基因控制的数量性状，一个复杂、多元的经济性状，是有相互关联的多基因控制的一系列生理生化过程的最终体现。但仅通过表型分析难以详尽阐明影响产量形成的具体原因。因此，从分子水平了解产量及相关性状的关系，对玉米产量的遗传改了具有重要意义。构建玉米遗传图谱并鉴定玉米产量相关性状如单株产量、百粒重、穗长、穗粗、穗行数、行粒数、出籽率等QTL定位及其基因效应的分析，是产量相关性状QTL进行分子标记辅助育种的基础。
QTL(quantitative trait locus的缩写)，为数量性状座位或者数量性状基因座，指的是控制数量性状的基因在基因组中的位置。目前，在MAIZEGDB(http://www.maizegdb.org/)和GREMENE网站上注册了大量关于玉米产量构成因子的QTL。但以上QTL定位所用图谱大都以第二代分子标记SSR为主。在遗传图谱的构建中，SSR技术只能对重复序列区域进行染色体定位，因此若要构建高密度的遗传图谱则必须结合其他分子标记技术以增加相邻重复序列之间的遗传标记数目。
分子标记发展经过第一代(RFLP为代表)、第二代(SSR为代表)的历程，新一代高通量测序技术和丰富的基因分型技术催生了第三代SNP的快速发展。与AFLP、RFLP、RAPD和SSR标记相比，SNP(Single nucleotide polymorphism)即单核苷酸多态性，具有密度高、代表性强、遗传稳定性好和易于实现自动化分析检测等优点，现已广泛应用于植物遗传连锁图谱构建、QTL定位以及生物多态性的研究等方面。同时SNP标记的发展促进了遗传图谱、基因定位、关联分析等对植物复杂数量性状的遗传研究。研究证明：多数SNP变异与基因功能密切相关，通过基因定位、关联分析可以发掘这些SNP位点信息并应用于作物遗传育种。但传统的SNP开发和分型技术由于成本较高、耗时较长、较为繁琐、在基因组上分布不均匀、密度低等缺点限制其进一步应用。
技术实现要素：
针对现有技术中玉米产量QTL定位所用遗传图谱标记密度较低，QTL定位置信区间较大，难以直接对定位QTL进行候选基因预测等问题，本发明采用GBS简略基因组测序技术，构建玉米高密度SNP遗传图谱，结合考察的玉米单穗粒重表型性状进行全基因组扫描，获得与目标性状QTL紧密连锁的SNP分子标记。
本发明提供了一种玉米单株穗重主效QTL，该QTL包括qEW-1、qEW-2、qEW-3、qEW-4和qEW-5，qEW-1定位在第4号染色体上，位于分子标记mk1399和mk1419之间；分子标记mk1399的序列如SEQ ID NO.1所示，分子标记mk1419的序列如SEQ ID NO.2所示；qEW-2定位在第4号染色体上，位于分子标记mk1650和mk1660之间，分子标记mk1650的序列如SEQ ID NO.3所示，分子标记mk1660的序列如SEQ ID NO.4所示；qEW-3定位在第7号染色体上，位于分子标记mk2462和mk2467之间；分子标记mk2462的序列如SEQ ID NO.5所示，分子标记mk2467的序列如SEQ ID NO.6所示；qEW-4定位在第7号染色体上，位于分子标记mk2468和mk2473之间；分子标记mk2468的序列如SEQ ID NO.7所示，分子标记mk2473的序列如SEQ ID NO.8所示；qEW-5定位在第7号染色体上，位于分子标记mk2483和mk2484之间，分子标记mk2483的序列如SEQ ID NO.9所示，分子标记mk2484的序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明还提供了一种玉米单株穗重主效QTL的获得方法，该方法包括以下步骤：
(1)选择玉米自交系SG-3为母本，玉米自交系SG-5为父本配置杂交组合，构建F2群体；
(2)提取两亲本和F2群体的DNA，对F2群体DNA样本进行GBS测序分型，基于玉米亲本基因型检测结果，进行亲本间多态性标记开发；
(3)采用binmap的方式，对所有标记进行bin的划分，构建遗传图谱，并使用winQTLcart2.5软件复合区间作图法进行QTL分析。
进一步的，步骤(1)中，构建包含199个单株的F2遗传群体。
进一步的，步骤(2)中，选用限制性内切酶MseI、HaeIII进行酶切，样本合格后建库，于HiSeq PE150测序平台上测序；原始测序数据经过基本质控后，与参考基因组进行比对，进行变异检测及筛选。
进一步的，步骤(2)中，过滤掉亲本信息缺失的位点；筛选父母本都为纯合且亲本间具有多态性的位点。
进一步的，步骤(3)中，采用binmap的方式，对所有标记进行bin的划分，窗口设置为15个，使用R/qtl进行遗传距离的计算，使用perl脚本进行画图。
进一步的，步骤(3)中，使用winQTLcart2.5软件复合区间作图法进行QTL分析，搜索步长设定为1cM。
本发明还提供了玉米单株穗重主效QTL在玉米单株穗重性状育种中的应用。
本发明的有益效果为：本发明以高产早熟玉米自交系SG5为母本、产量性状相对较差的玉米自交系SG7为父本配置杂交组合，并构建其F2遗传群体；并对F2遗传群体进行GBS测序分型，同时结合基于SG5、SG7双亲发掘的差异SNP进行基因型分析。调查F2单穗产量性状，同时利用winQTLcart2.5软件复合区间作图法对F2单穗产量性状进行QTL分析，分析主效QTL所在染色体区域和遗传效应，为挖掘控制玉米单穗产量性状主效QTL及连锁标记提供理论依据，获得与目标QTL紧密连锁的SNP分子标记，为玉米单穗产量性状QTL候选基因预测、克隆及分子标记辅助育种奠定基础。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例1
本发明使用本地高产早熟玉米自交系SG-3为母本、产量相对较差的自交系SG-5为父本配置的杂交组合，构建其F2群体；对F2群体进行GBS测序分型，同时结合两亲本间开发的SNP标记进行基因型分析，构建遗传连锁图谱。再调查F2的单穗产量性状，应用QTL Cartographer v2.5软件复合区间作图法对单株产量性状QTL分析，分析主效QTL所在染色体区域和遗传效应。
本发明方法具体包括下列步骤：
1、亲本选择及群体构建：选择高产早熟且抗灰斑病玉米自交系SG-3为母本、产量相对较差的自交系SG-5为父本配置杂交组合，南繁加代并构建其包含199个单株的F2遗传群体。
2、表型调查：考察P1、P2和F2单穗产量性状。
3、群体GBS测序分型：对构建的F2群体DNA样本(6叶期幼苗)进行GBS测序。GBS技术包括DNA制备、限制性内切酶酶切、加接头、文库构建、PCR反应、测序、生物分析的步骤；
(1)采用CTAB法提取P1、P2和F2群体基因组DNA；
(2)酶切：0.1-1μg基因组DNA用限制性内切酶MseI和HaeIII进行双酶切，以得到适合的marker密度；
(3)加Pl和P2接头：酶切后的片段两端加Pl和P2Adapter(可与酶切DNA缺口互补)；
(4)片断选择：PCR扩增两端分别含有Pl和P2接头的tag序列，DNA片段pooling，电泳回收需要区间的DNA；
(5)高通量测序：Cluster制备，上机测序；
(6)将检测合格的DNA文库进行Illumina HiseqTM测序，产出原始数据(即raw data或raw reads)，结果以FASTQ文件格式存储(文件名：*.fq)。原始测序数据中会包含接头信息，低质量碱基，未测出的碱基，为保证信息分析质量，这些信息会对后续的信息分析造成很大的干扰，分析前需将这些干扰信息去除掉，最终得到的数据即为有效数据，我们称之为clean dates或clean reads。将clean data与NCBI的核苷酸数据库进行比对，没有发现其他来源的DNA污染。
(7)统计clean reads两端为MseI捕获的Reads数、捕获的Reads数占Clean reads数的比率，即酶捕获率。得出的酶捕获率平均为98.45％，酶切效果良好，建库合格。
(8)使用BWA比对软件(参数：mem-t 4-k 32-M-R)，将亲本和子代clean data的PE reads与参考基因组进行比对；使用SAMtools将比对结果进行格式转换，转换成SAM/BAM files；使用Perl脚本统计比对率和覆盖度；使用SAMtools对比对结果进行排序(参数：sort)，用于变异检测。参考基因组下载地址：ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-29/fasta/zea_mays/dna/2 ea_mays.AGPv3.29.dna.toplevel.fa.gz。
(9)对BWA比对结果进行过滤：特比对到基因组上唯一位置的reads挑选出来，进行后续分析；采用GATK(-type UnifiedGenotyper)对过滤后的bam文件进行群体SNP检测。
(10)基于玉米亲本基因型检测结果，进行亲本间多态性标记开发。过滤掉亲本信息缺失的位点；筛选父母本都为纯合且亲本间具有多态性的位点(例如：在某个SNP位点亲本1基因型为“GG”，亲本2基因型为“AA”，亲本基因型都为纯合，且亲本间基因型不相同)。完成亲本间标记开发后，提取199子代在上述XX个亲本多态性标记位点的基因型。
4、对分型后的子代标记进行筛选，得到高质量遗传标记，采用binmap的方式，对所有标记进行bin的划分，窗口设置为15个，使用R/qtl进行遗传距离的计算，使用perl脚本进行画图。使用winQTLcart2.5软件复合区间作图法(CIM)进行QTL分析，搜索步长设定为1cM，采用的LOD临界值为1000次permutation的阈值。
根据上述方法获得了与玉米单株穗重性状的QTL，与玉米单株穗重性状的QTL定位结果如表1所示。由表1可知，本发明得到与单株穗重性状的5个QTL位点，该QTL包括qEW-1、qEW-2、qEW-3、qEW-4和qEW-5；qEW-1定位在第4号染色体上，位于分子标记mk1399和mk1419之间，LOD值为4.2；qEW-2定位在第4号染色体上，位于分子标记mk1650和mk1660之间，LOD值为5.2；qEW-3定位在第7号染色体上，位于分子标记mk2462和mk2467之间，LOD值为5.2；qEW-4定位在第7号染色体上，位于分子标记mk2468和mk2473之间，LOD值为5.1；qEW-5定位在第7号染色体上，位于分子标记mk2483和mk2484之间，LOD值为4.4。
表1 与玉米单株穗重性状的QTL定位结果
分子标记的信息如表2所示。分子标记mk1399的序列如SEQ ID NO.1所示，mk1399核苷酸序列第51处的核苷酸为G或T；分子标记mk1419的序列如SEQ ID NO.2所示，mk1419核苷酸序列第51处的核苷酸为G或A；分子标记mk1650的序列如SEQ ID NO.3所示，mk1650核苷酸序列第51处的核苷酸为T或A；分子标记mk1660的序列如SEQ ID NO.4所示，mk1660核苷酸序列第51处的核苷酸为A或G；分子标记mk2462的序列如SEQ ID NO.5所示，mk2462核苷酸序列第51处的核苷酸为C或T；分子标记mk2467的序列如SEQ ID NO.6所示，mk2467核苷酸序列第51处的核苷酸为A或C；分子标记mk2468的序列如SEQ ID NO.7所示，mk2468核苷酸序列第51处的核苷酸为C或T；分子标记mk2473的序列如SEQ ID NO.8所示，mk2473核苷酸序列第51处的核苷酸为G或A；分子标记mk2483的序列如SEQ ID NO.9所示，分子标记mk2483核苷酸序列第51处的核苷酸为A或C；分子标记mk2484的序列如SEQ ID NO.10所示，mk2484核苷酸序列第51处的核苷酸为G或A。
表2 与玉米单穗产量性状的QTL的分子标记信息
实施例2
选取6个已知单株穗重的玉米品系，其中，3个品系为玉米高产，3个品系为玉米低产。
分别提取上述6个品系的DNA基因组，用限制性内切酶MseI和HaeIII进行双酶切，对DNA样本(6叶期幼苗)进行GBS测序。
检测实施例1开发的5个QTL位点和10个分子标记，利用5个QTL位点和10个分子标记能将玉米高产和玉米低产区别开来，单株穗重鉴定与分子标记结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 六盘水师范学院
<120> 玉米单株穗重主效QTL、其获得方法及应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaggaagaag gtgacttttc aaaataccct tatgttttct ataatctttt gaggttttaa 60
acttttacat cttagtccat aattataaaa catgtacaaa t 101
<210> 2
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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tcagacatcc gatttcatcc caaacaaatt tattagaatt c 101
<210> 3
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 4
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaatgagatt ggttcgttag tcttttatag tttcttataa ctcaattatg actccgccgg 60
cttgacttgt ggattggttg ctttgaccat cagatgcttg a 101
<210> 5
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
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atgttgcata agaattacag tttatatttg caaatatata t 101
<210> 6
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acaacttgcc ttatacttgc gataacttgt tgtccagatg ttgacccaaa agttgggctt 60
ctgattcctc gtcacctcgc ctctactcgt agcaatacat a 101
<210> 7
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gctcgaataa taacataaaa gatagtaata gtcgattaca tcatgatgtc cgagacatcc 60
acatagtctt taacaattat caaagtgcgg aaatgaaaca t 101
<210> 8
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tatgctttaa ctcttgtagc ttcgcatgaa agacacgcac tacaagatcc ggacgatctt 60
gcggtgtctg cccagggaga agctccctcc ttatctcatc c 101
<210> 9
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aagtaggaca tgataggtct gaggacactt gccttcacca ggttgttgct aagagggatc 60
ttcggcaaca cactcaggaa cctcggactg ctcgttgtct a 101
<210> 10
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ttcggaagag aagcgccggg gatgagatcg atctgatgct caatgccacg gaggggagga 60
agacccggtg gtaagtccgt aggataaaca tcagcatact c 101