专利名称：玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，属于玉米抗病性鉴定技 术领域。
背景技术：
玉米丝黑穗病是世界性的重要玉米病害。在国外最早报道见于1875年，亚、非、欧 洲各国家均有不同程度发生，给玉米生产带来一定的经济损失(王远路，200 。该病在我 国各玉米产区均有不同程度的发生，其中以北方春播区、西南丘陵山地区受害较重，一般发 病率在5% 10%之间，个别重病地块发病率可达60% 70%以上。可通过加强田间管理降低玉米丝黑穗病发病率，也可采用种子包衣等药剂防治措 施使发病程度得到控制，但这些方法受气候和人为操作影响较大，稳定性不足，成本高，易 造成感病和严重的减产，药物使用不当容易对玉米造成毒害，易污染环境，而且不同的品种 间对玉米丝黑穗病的抗性存在极显著的差异。防治该病最有效的方法是种植抗病玉米品 种，而抗病品种的选育依赖于抗病种质资源，为此需加强对玉米种质资源进行该病的抗性 评价，进而选育抗病玉米自交系。由于玉米丝黑穗病从种子萌发到七叶期都能侵染，并且各时期表现不同的特征， 因此该病的抗性鉴定方法较多。主要包括质壁分离法、接种后在乳熟期进行鉴定、乳酚油 棉兰染色玉米生长锥鉴定法、丁布含量测定方法、叶片褪绿斑的有无鉴定法、通过观察生长 锥中菌丝进行鉴定、PCR技术的玉米丝轴黑粉菌侵染率。其中，乳熟期进行田间菌土法鉴定 是目前通用的鉴定方法(Kruger W，1962)，具体方法为从上一年秋季的典型病株上采集病 瘿，装布袋、置通风处越冬；播种前一周将病瘿上的菌粉抖落，用40目的筛子筛出冬孢子， 按0. 质量比与晒过的细土混合配成菌土 ；播种时先播种子，覆盖菌土 100g，上面再上一 层覆土，等玉米生长到乳熟期进行病株率调查。虽然鉴定结果相对准确可靠，但是存在一 定的局限性用地量大，需要时间长，要求材料纯度高，鉴定群体量大一般不少于50株，同 时需在多年多点多个环境进行鉴定。通过观察生长锥中菌丝进行鉴定目前有6种常用的 染色法，并且，张宝艳O008)比较了姬姆萨氏色素(Giemsa)、考马斯亮兰组织透明染色、番 红0-Κ0Η、苯胺蓝-甘油、曲利苯兰酒精-乳酚酸和苯胺蓝-乳酚油染色法对玉米丝黑穗病 菌不同生长发育阶段的染色效果。结果表明，在一定的染液浓度条件下，6种染色方法均可 进行冬孢子、芽管、先菌丝、担子、担孢子等寄主组织内部菌体的原位染色。曲利苯兰组织 透明染色方法更稳定、简捷和易于观察，能观察玉米丝黑穗病菌的整个生长发育阶段，因此 适宜胞间菌丝的染色。此法对丝黑穗的鉴定也比较准确，每次鉴定的量少，并且，据檀国庆 (2009)报道，发现玉米在接种后有带菌现象，即植物体内有菌丝存在但在乳熟期不发病。因 此，这种状况就很难判断。上面的每种方法都有其优点和局限性，如利用在苗期侵染叶片所产生的褪绿斑点 来鉴定抗病性的方法仅适用于自交系且判断不准确；而乳熟期鉴定结果虽然准确可靠，但 用地量大，工作效率低，群体不少于50株，同时需在多个环境鉴定，因此需要寻求一种能在室内准确快速鉴定资源抗性的方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在的问题提供一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定 的方法，达到建立简便、快速、有效、准确的使用少量材料即可进行玉米丝黑穗病接种鉴定 的目的。上述的目的通过以下的技术方案实现玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，该方法包括如下步骤(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液玉米丝黑穗病菌冬孢子粉在室温下干燥6-7天， 无菌水清洗，甲醛+高锰酸钾熏蒸25min，接种至麦芽糖水琼脂培养基下倒置暗培养 17h，挑取已经萌发的单个冬孢子，接种至马铃薯葡萄糖培养基，下倒置暗培养15d，将 培养好的丝黑穗病菌的菌落刮出，转入2%的蔗糖溶液中下振荡暗培养48h，调整菌 液浓度为 6. 2X105cfu/ml ；(2)培养玉米幼苗挑选发育良好玉米种子，放入铺好滤纸的发芽盒中，喷水后放 入人工气候箱中，20°C下进行暗培养，直至芽长到3cm ；(3)接种玉米丝黑穗病菌将步骤O)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤 (1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为 6X10—2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25°C /15°C变温处理；(4)接种后幼苗的培养在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20% ；(5)接种效果的检测接种IOd后，取接种部位下Icm下的玉米茎部组织，CTAB法 提取DNA，依据玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，采用PCR的方法进行接种效果 的检测。所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，步骤(5)中所述的引物为引物 1 :5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3'，引物 2:5' -ATACACCTGTGACGGCTG-3 ‘，PCR 反应程序为预 变性95°C 3min，变性95°C 30s，退火温度56°C 40s，延伸72°C 40s，循环37次，终延伸72°C 延伸lOmin，最后4°C保存。有益效果1.适应范围广本发明的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定方法适用于玉米种质 对玉米丝黑穗病的抗性鉴定及遗传研究，本发明对丝黑穗病菌接种浓度、接种部位、接种温 度、土壤湿度等接种条件，进行了详细的研究，确立了适宜的范围，建立了玉米丝黑穗病接 种室内快速接种鉴定方法，本发明的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法具有适用范围 广的特点，适用于几乎所有的玉米种质。2.本发明所需样本数量少，操作比较简便。本发明只需少量玉米材料，效率高，成 本低廉。本发明步骤简单，不需将玉米播种至田间，接种鉴定周期短，鉴定效率高。3.本发明易于掌握，不受环境条件影响，重复性高。本发明使用玉米幼苗中胚轴为 接种部位，容易获得，在室内进行检测，条件可控，适于对大量玉米种质对玉米丝黑穗病的 抗性检测及遗传研究。
附图1是本发明的步骤框图。附图2是接种浓度各自交系变化分析图。附图3是土壤湿度各自交系变化分析图。附图4是接种部位各自交系变化分析图。附图5是接种方法各自交系变化分析图。附图6是接种温度各自交系变化分析图。
具体实施例方式实施例1 玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，该方法包括如下步骤(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液玉米丝黑穗病菌冬孢子粉在室温下干燥6-7天，无 菌水清洗，24ml甲醛+12g高锰酸钾熏蒸25min，接种至麦芽糖水琼脂培养基，28°C下倒置 暗培养17h，挑取已经萌发的单个冬孢子，接种至马铃薯葡萄糖培养基二8°C下倒置暗培养 15d，将培养好的丝黑穗病菌的菌落刮出，转入2%的蔗糖溶液中下振荡暗培养48h， 调整菌液浓度为6. 2X105cfu/ml ；(2)培养玉米幼苗挑选发育良好玉米种子，放入铺好滤纸的发芽盒中，喷水后放 入人工气候箱中，20°C下进行暗培养，直至芽长到3cm ；(3)接种玉米丝黑穗病菌将步骤O)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤 (1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为 6X10—2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25°C /15°C变温处理；(4)接种后幼苗的培养在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20% ；(5)接种效果的检测接种IOd后，取接种部位下Icm下的玉米茎部组织，CTAB法 提取DNA，依据玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，采用PCR的方法进行接种效果 的检测。所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，步骤(1)中所述的麦芽糖水琼脂 培养基的配比为麦芽糖lg，琼脂20g，水1000ml，所述的马铃薯葡萄糖培养基的配比为葡萄 糖 IOg,马铃薯 200g,琼脂 15-20g,水 IOOOml。所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，步骤(5)中所述的引物为引物 1 :5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3'，引物 2:5' -ATACACCTGTGACGGCTG-3 ‘，PCR 反应程序为预 变性95°C 3min，变性95°C 30s，退火温度56°C 40s，延伸72°C 40s，循环37次，终延伸72°C 延伸lOmin，最后4°C保存。实施例2 本试验选用经多年接种鉴定已知抗性的的高抗(HR)、抗病(R)、中抗(MR)、感病 (S)和高感(HS)各2个玉米自交系为试验材料，试验材料的田间发病率及丝黑穗的抗感性 见表1。表1试验材料的田间发病率及丝黑穗的抗感性玉米自交系田间发病率％抗病性齐3190. 00HRSH150. 00HRMol71. 64R综311. 40RB735. 60MRHC6. 70MRX17834. 40S金黄96B24. 20S黄早四76. 81HS昌7-293. 25HS采用正交设计，人工接种研究的因素包括丝黑穗病菌接种浓度、土壤湿度、接种部 位、接种方法、接种温度，本试验的水平为3。选择L18(37)正交表，正交试验方案见表2。同 时进行田间接种鉴定作为对照。表2正交试验计划表
权利要求
1.一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，其特征是该方法包括如下步骤(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液玉米丝黑穗病菌冬孢子粉在室温下干燥6-7天，无菌水 清洗，甲醛+高锰酸钾熏蒸25min，接种至麦芽糖水琼脂培养基，28°C下倒置暗培养17h，挑 取已经萌发的单个冬孢子，接种至马铃薯葡萄糖培养基二8°C下倒置暗培养15d，将培养好 的丝黑穗病菌的菌落刮出，转入2%的蔗糖溶液中下振荡暗培养48h，调整菌液浓度 为 6. 2X105cfu/ml ；(2)培养玉米幼苗挑选发育良好玉米种子，放入铺好滤纸的发芽盒中，喷水后放入人 工气候箱中，20°C下进行暗培养，直至芽长到3cm ；(3)接种玉米丝黑穗病菌将步骤O)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤(1) 中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为 6X10—2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25°C /15°C变温处理；(4)接种后幼苗的培养在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20%；(5)接种效果的检测接种IOd后，取接种部位下Icm下的玉米茎部组织，CTAB法提取 DNA，依据玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，采用PCR的方法进行接种效果的检 测。
2.根据权利要求1所述的玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法，其特 征是步骤(5)中所述的引物为引物1 :5-GCAGCCTCAGCATTACTC-3 ‘，引物2 5 ‘ -ATACACCTGTGACGGCTG-3 ‘，PCR 反应程序为预变性 95°C 3min,变性 95°C 30s，退火温度 56°C 40s，延伸72°C 40s，循环37次，终延伸72°C延伸lOmin，最后4°C保存。
全文摘要
本发明涉及一种玉米丝黑穗病室内快速接种鉴定的方法。本发明的方法包括(1)制备玉米丝黑穗病菌菌液(2)培养玉米幼苗；(3)将步骤(2)中培养的玉米幼苗的中胚轴部位侵入步骤(1)中制备好的玉米丝黑穗病菌菌液中，放入真空干燥器中，盖上盖子，打开真空泵，压力为6X10-2帕处理25-35min将玉米幼苗取出，接种温度为25℃/15℃变温处理；(4)在接种后苗移栽到土壤，保证土壤湿度稳定在20％；(5)接种10d后，取接种部位下1cm下的玉米茎部组织，CTAB法提取DNA，依据玉米丝黑穗病菌基因组上SR3序列设计引物，采用PCR的方法进行接种效果的检测。本发明用于室内快速接种鉴定玉米丝黑穗病。
文档编号C12Q1/02GK102051410SQ201010246839
公开日2011年5月11日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者张亚军, 张 林, 李新海, 王振华, 邸宏 申请人:东北农业大学