玉米光合作用组织和非光合作用组织昼夜节律的鉴定及其在改良作物方面的用途的制作方法

专利名称：玉米光合作用组织和非光合作用组织昼夜节律的鉴定及其在改良作物方面的用途的制作方法
技术领域：
本发明整体涉及分子生物学领域。
背景技术：
昼夜循环是控制植物日节律和季节节律的一个主要环境因素。昼夜明暗转变带动内部昼夜节律钟，昼夜节律钟产生在不变的光照条件下自行维持的(自由运转的)节律。昼夜节律钟的一个简化模型由三个基本组元组成输入途径，其能感光；核心振荡器，其是产生节律的转录机制；以及输出途径，其控制各种发育和代谢过程，引起对昼夜周期的适当的生理适应(Barak, et al.，(2000) Trends Plant Sci 5 :517-522 (Barak 等人，2000年，《植物科学趋势》，第 5 卷，第 517-522 页)；Harmer，(2009) Annu Rev Plant Biol 60:
357-377 (Harmer，2009年，《植物生物学年评》，第60卷，第357-377页))。内部时钟和外部明/暗循环的适当同步使植物更强壮、存活率更高、竞争优势更明显(Dodd，et al.，(2005)Science 309 :630-633 (Dodd等人，2005年，《科学》，第309卷，第630-633页))并且长势更佳(Ni，et al.，(2009) Nature 457 :327-331 (Ni 等人，2009 年，《自然》，第 457卷，第 327-331页))。到目前为止，植物昼夜节律系统的基因结构在拟南芥中阐述得最多(Mas，(2008)Trends Cell Biol 18 :273-281 (Mas，2008 年，《细胞生物学趋势》，第 18 卷，第 273-281页))。输入途径由两套光受体组成，即感受红光/远红光的光敏色素(PHYA-E)和感受UV-A/蓝光的隐花色素(CRY1和CRY2)，它们在日间感知光并向核心振荡器发送信号(Nemhauser, (2008) Curr Opin Plant Biol 11 :4-8 (Nemhauser, 2OO8 年，《植物生物学新见》，第11卷，第4-8页))。核心振荡器基因形成连锁的转录反馈环路(Harmer andMcClung, (2009) Science 323 :1440-1441 (Harmer 和 McClung，2009 年，《科学》，第 323 卷，第 1440-1441 页))。晨间环路由 MYB 样转录因子 CCAl (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED)和LHY(LATE ELONGATED HYP0C0TYL)组成，它们参与两个不同环路的调控。在晨间环路中，CCA1/LHY负调控伪应答调控因子TOClOlMING OF CAB EXPRESSION I)和TCP样转录因子 CHE(CCA1 HIKING EXPEDITION)的转录。T0C1/CHE 形成正调控 CCA1/LHY 转录的复合物(Pruneda-Paz, et al. , (2009) Science 323 1481-1485 (Pruneda-Paz 等人，2009年，《科学》，第323卷，第1481-1485页))。在日间环路中，CCA1/LHY正调控PRR7和PRR9 (PSEUDO-RESPONSE RE⑶LAT0RS)的转录，二者都负调控CCA1/LHY。在晚间环路中，T0C1/CHE充当GI(GIGANTIA)的负调控因子，后者本身是TOCl的正调控因子。晚间基因ZTL(ZEITLUPE,降解蛋白的F_box蛋白)参与TOCl和PRR3蛋白的降解，提供在蛋白水平上对核心时钟组分的调控(Mas, et al.，(2003) Nature 426 :567-570 (Mas等人，2003年，《自然》，第426卷，第567-570页))。多个连锁的转录环路使遗传机制既保持稳固又不乏灵活性(Harmer(2009))。昼夜节律钟产生节律输出，从而调控许多植物发育和生理过程，包括生长(Nozue, et al.，(2007) Nature 448 :358-361 (Nozue 等人，2007 年，《自然》，第 448 卷，第 358-361 页)；Nozue and Maloof, (2006) Plant Cell Environ 29 :396-408 (Nozue 和Maloof，2006年，《植物、细胞与环境》，第29卷，第396-408页))、开花时间、一年生植物的块莖形成、多年生植物的生长停止和顶芽形成(Lagercrantz, (2009) J Exp Bot 60:2501-2515 (Lagercrantz，2009年，《实验植物学杂志》，第60卷，第2501-2515页))、光合作用(Sun, et al.，(2003) Plant Mol Biol 53 :467-478 (Sun 等人，2003 年，《植物分子生物学》，第 53 卷，第 467-478 页))、氮吸收(Gutierrez, et al. , (2008)Proc Natl AcadSci USA 105 :4939-4944 (Gutierrez等人，2008年，《美国国家科学院院刊》，第105卷，第4939-4944 页))以及激素信号传导和应激反应(Covington and Harmer, (2007)PLoS Biol5 e222 (Covington和Harmer，2007年，《公共科学图书馆 生物学》，第5卷，第e222页)。然而，目前只是初步了解将昼夜节律钟和输出途径关联起来的分子节点(molecular nodes)。迄今为止，理解最清楚的关联点是拟南芥和水稻开花时间的光周期调控。拟南芥时钟基因GI及其水稻同源基因OsGI促进转录因子CO(CONSTANS)和0sC0(Hdl，HEADINGl)的表达，这两个转录因子控制拟南芥的下游开花激活因子FT(FL0WERING LOCUS T)及其水稻同源基因 Hd3a (HEADING 3a)的转录(Michaels，(2009) Curr Opin Plant Biol 12 :75-80 (Michaels,2009 年，《植物生物学新见》，第 12 卷，第 75-80 页)，Tsuji and Komiya, (2008)Rice I 25-35 (Tsuji和Komiya，2008年，《水稻》，第I卷，第25-35页))。光周期敏感性途径确保了在有利的条件下开花。有几篇论文鉴定了拟南芥核心振荡器与多种植物生理过程之间的分子关联。节律性下胚轴生长是由两个碱性螺旋-环-螺旋转录因子PIF4和PIF5 (PHYT0CHR0M-INERACTING FACTOR)的正作用促进的，它们的转录水平由CCAl调控(Nozue, et al. , (2007) Nature 448 :358-361 (Nozue 等人，2007 年，《自然》，第 448 卷，第
358-361页))。下胚轴生长也由植物激素生长素的游离水平独立调控，生长素由生长素生物合成基因YUCCA8产生，该基因由时钟依赖性Myb样转录因子RVEl (REVEILLE I)直接控制(Rawat, et al.，(2009) Proc Natl Acad Sci USA 106 :16883-16888 (Rawat 等人，2009年，《美国国家科学院院刊》，第106卷，第16883-16888页))。这是昼夜节律振荡器与调控拟南芥幼苗生长的生长素网络之间的直接关联。PPR9/7/5基因的输出途径与中间代谢(主要是线粒体中的)，特别是三羧酸(TCA)循环的维持相关(Fukushima, et al. , (2009)ProcNatl Acad Sci USA106 :7251-7256 (福岛等人，2009年，《美国国家科学院院刊》，第106卷，第7251-7256页))。TOCl也与胁迫相关ABA激素有关联，其将昼夜节律钟与植物对干旱的反应联系起来(Legnaioli，et al.，(2009) The EMBO Journal 28 :3745-3757 (Legnaioli 等人，2009年，《欧洲分子生物学学会会刊》，第28卷，第3745-3757页))。芯片技术的应用揭示了拟南芥中昼夜节律对基因转录的普遍影响。这些研究主要集中在感光组织上，例如拟南芥莲座。在绿色组织中，多达35%的拟南芥基因受昼夜节律调控(Covington, et al. , (2008) Genome Biol9 :R130 (Covington 等人，2008 年，《基因组生物学》，第 9 卷，第 R130 页)；Harmer, et al. , (2000) Science 290 :2110-2113 (Harmer等人，2000 年，《科学》，第 290 卷，第 2110-2113 页)；Ptitsyn, (2008) BMC Bioinformatics9(9) S18(Ptitsyn,2008年，《BMC生物信息学》，第9卷第9期，第S18页))。虽然动物模型表明几乎每个组织的转录程序都有很大的昼夜节律组分，但尚未对多种植物组织系统地评估昼夜光周期对转录的相对贡献(Ptitsyn, et al. , (2006) PLoS Comput Biol 2 el6 (Ptitsyn等人,2006年，《公共科学图书馆计算生物学》,第2卷，第el6页))。在前基因组时代，在玉米叶光合作用和叶伸长速率中观察到昼夜变化，它们在中午达到峰值(Kalt-Torres and Huber, (1987) Plant Physiol 83 :294-298 (Kalt-Torres 和 Huber, 1987年 ，《植物生理学》，第 83 卷，第 294-298 页)，Kalt-Torres, et al.，(1987)Plant Physiol83 :283-288 (Kalt-Torres 等人，1987 年，《植物生理学》，第 83 卷，第 283-288 页)，Usuda,et al.，(1987) Plant Physiol83 :289-293 (Usuda 等人，1987 年，《植物生理学》，第 83 卷，第289-293页))。在非光合作用的籽粒中也发现了胚乳特异性转录因子02(0paqUe 2)的昼夜变化，并且有人提出02活性由昼夜代谢物流量控制(Ciceri, et al.，(1999)PlantPhysiol 121 1321-1328 (Ciceri 等人，1999 年，《植物生理学》，第 121 卷，第 1321-1328页))。Gl(gigzl)和CO(Conzl)的玉米同源基因被证明有昼夜节律，它们是控制拟南芥开花时间的光周期途径中的昼夜节律钟的直接输出(Miller，et al.，(2008)Planta 227 1377-1388 (Miller等人，2008年，《植物》，第227卷，第1377-1388页))，尽管温带玉米是开花不受白天长度调控的日中性植物。本研究鉴定了两个TOCl同源基因ZmTOCa和ZmTOCb，它们分别定位于5号和4号染色体。两个基因的转录都在6pm达到峰值，这与拟南芥TOCl基因表达相符。TOCl是伪应答调控因子(PRR)家族的成员，该家族由拟南芥和水稻中进化上保守的五个PRR基因组成(Murakami, et al. , (2007)Biosci Biotechnol Biochem 71 :1107-1110(Murakami 等人，2007年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第71卷，第1107-1110页)；Murakami，etal.，(2003) Plant Cell Physiol 44 :1229-1236 (村上等人，2003 年，《植物细胞生理学》，第44卷，第1229-1236页))。除了两个ZmTOCl同源基因外，本研究还鉴定了 ZmPRR73、ZmPRR37和ZmPRR59，它们是基于序列相似性水平根据水稻PRR基因命名的(村上等人，(2003))。还鉴定了两个 ZEITLUPE 同源基因(Kim, et al.，(2007) Nature 449 :356-360 (Kim等人，2007年，《自然》，第449卷，第356-360页))ZmZTLa和ZmZTLb,它们定位于2号和4号染色体。GIGANTIA的两个玉米直系同源基因gigzlA和gigzlB此前已有描述(Miller，et al.，(2008) Planta 227 1377-1388 (Miller 等人，2008 年，《植物》，第 227 卷，第1377-1388页))，在此确认了它们在穗和叶中的振荡。安捷伦(安捷伦科技有限公司生命科学与化学分析事业部，美国特拉华州威明顿市森特威尔路2850号，19808-1610 (AgilentTechnologies, Inc., Life Sciences and Chemical Analysis,2850 Centerville Road,Wilmington, DE 19808-1610，USA))和亿明达(亿明达股份有限公司，美国加利福利亚圣地亚哥市镇中心大道 9885 号，92121 (Illumina, Inc. , 9885Towne Centre Drive, San Diego,CA 92121 USA))分析都说明大部分已知的核心组元循环往复。通过RT-PCR分析进一步确认了核心组分ZmCCA、ZmLHY, ZmTOCla和ZmTOClb的循环。与叶组织相比，发育期穗中的核心组元的振幅减弱，但仍然强健。这些数据表明大部分植物核心振荡器系统在非光合作用组织例如穗中起作用，但振荡器输出显然与影响下游昼夜表达改变的转录机器远远分离。核心时钟机构以及源于此的邻近信号机构的组分可以例如改变或扩展源和库例如叶和穗之间关系达到正向影响作物表现这样的方式改进。已证实来自不同种质源的昼夜模式的大规模遗传互补能增强组合的昼夜模式和表观适应性(Ni，(2009))。


图I :在玉米中起作用的昼夜核心时钟组元、染色体位置和达到峰值表达水平的时间。图2 :用 qRT-PCR 验证 ZmCCAl、ZmLHY、ZmTOCla 和 ZmTOClb 的昼夜表达。图3 :穗中昼夜表达的基因、染色体位置和达峰值表达水平的时间。图4 =ZmCCAl和ZmLHY基因的外显子/内含子结构图5 :依时间富集的基因功能项的昼夜模式

发明内容
目前还没有对玉米的昼夜/生理节律转录模式进行过系统研究。开始本研究工作，是为了用现代全基因组图谱分析技术考察玉米中昼夜循环在调控基因转录中作用的范围。设计了在天然未受干扰条件下的田间实验，并采集了光合作用组织(即叶)和非光合作用组织(即发育期穗)的样品。鉴定了数千个在玉米叶中显著地循环的转录物。然而在非光合作用的穗中只有少至45个的少部分基因明显地进行昼夜循环。其中许多是拟南芥核心振荡器基因的玉米同源基因，表明核心昼夜节律基因是保守在玉米中的，且在光合作用组织和非光合作用组织中昼夜表达。在分析中鉴定了多个玉米昼夜调控的基因。总共471个序列，包括来自未成熟穗的序列、在叶组织中有闻振幅/大幅度循环的序列以及与NUE和碳氣功能相关的多种序列。这些序列包含0RF、编码的多肽和与其相关的启动子。以下列表包括本发明的一些实施例I. 一种分离出的多核苷酸,所述分离的多核苷酸选自a.多核苷酸，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多核苷酸与选自SEQ IDNO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和 470 的多核苷酸的全长序列具有至少90%的序列同一性；其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有昼夜活动调节剂的功能；b.多核苷酸，所述多核苷酸选自 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90%的序列同一性；c.与(a)或(b)的多核苷酸完全互补的多核苷酸；d.由(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽；和e.多肽，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多肽与选自SEQ ID NO 185,187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、43 3、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、467、469 和471的多肽的全长序列具有至少90%的序列同一性。2. 一种重组表达盒，所述重组表达盒包含权利要求I所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义或反义方向有效连接至启动子。3. 一种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求2所述的表达盒。4. 一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求2所述的重组表达盒。5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。6.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。8. 一种转基因种子，所述转基因种子来自权利要求4所述的转基因植物。9. 一种调整植物昼夜节律的方法，所述方法包括a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求I所述的多核苷酸；和b.在植物细胞生长条件下培养所述植物；其中所述植物细胞中的昼夜节律被调制。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自选自以下的植物玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。11. 一种调制植物中整株植物或昼夜节律的方法，所述方法包括a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求I所述的多核苷酸；b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；和c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的昼夜节律被调制。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可。13. 一种来源于对转基因植物组织进行加工的方法的产品，所述转基因植物组织表达编码昼夜起作用的基因的分离多核苷酸，所述方法包括
a.用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸与选自 SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、40、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、3 24、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468和470的多核苷酸的全长序列具有至少90%的序列同一性；所述多核苷酸有效地连接至启动子；和b.在植物细胞生长条件下培养所述转化的植物细胞；其中所述转化的植物细胞的生长被调制；c.在形成植物的条件下培养所述植物细胞，以在植物组织中表达所述多核苷酸；和d.对所述植物组织进行加工以获得产品。14.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。15.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗和稷。16.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述多核苷酸的过表达导致与未转化的植物相比改善的植物生长。17.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，表现出改善的源-库关系。18.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，具有
提闻的广量。19. 一种调控多核苷酸分子，所述分子包含选自以下的序列(a) SEQ ID NO31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO :31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90%的同一性。20. 一种嵌合多核苷酸分子，所述分子包含权利要求19所述的核酸片段。21.根据权利要求20所述的嵌合分子，所述分子包含所述昼夜调控元件和组织特异性表达元件。22.根据权利要求21所述的嵌合分子，其中所述组织特异性表达元件选自根特异性、维管束鞘细胞特异性、叶特异性和胚特异性表达元件。23.根据权利要求19所述的调控多核苷酸分子，其中所述调控多核苷酸分子是启动子。24. 一种包含权利要求19所述的调控分子的构建体，所述调控分子有效连接至异源多核苷酸分子，其中所述异源分子赋予所关注的性状。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中所述所关注的性状选自耐旱性、耐冻性、耐寒性、抗病性和昆虫抗性。26.根据权利要求24所述的构建体，其中所述异源分子在源-库代谢中起作用。27. 一种用权利要求19所述的调控分子转化的转基因植物。28.根 据权利要求27所述的转基因植物，其是单子叶植物。29.根据权利要求27所述的转基因植物，其选自玉米、大豆、卡诺拉油菜、棉花、向日葵、苜猜、甜菜、小麦、裸麦、水稻、甘鹿、燕麦、大麦、草坪草、高粱、稷、番爺、木豆、蔬菜、果树和饲草。30. 一种增加植物产量的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下表达所关注的异源多核苷酸。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述异源多核苷酸是昼夜调控的植物基因。32. 一种提高植物非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下在植物中表达一种或多种赋予非生物胁迫耐性的多核苷酸。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非生物胁迫耐性选自耐旱性、耐冻性和耐寒性。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐旱性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于中午或傍晚左右。35.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐冻性或耐寒性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于黎明或上午中间左右。36. 一种降低转基因表达的产量抑制的方法，所述方法包括表达有效连接至调控多核苷酸分子的转基因，所述调控多核苷酸分子包含选自以下的序列(a)SEQ ID NO31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO :31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90%的同一性。37. 一种筛选涉及非生物胁迫耐性的候选基因的方法，所述方法包括(a)鉴定在组成性表达或组织特异性表达下表现产量抑制的一个或多个候选基因和(b)在引导昼夜表达模式的调控分子控制下表达所述候选基因。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述调控分子包含选自以下的序列(a)SEQ ID NO :31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少
50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO :31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90%的同一性。
具体实施例方式除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非另外提出，否则本文所采用或所考虑的技术是本领域普通技术人员所熟知的标准方法。材料、方法和实例仅为示例性的而不是限制性的。以下内容以举例说明的方式给出，而非意在限制本发明的范围。下文将参照附图更完整地描述本发明，其中示出了本发明的一些但并非全部实施例。事实上，这些公开内容可以多种不同形式呈现，不应理解为受限于本文所述的实施例；相反，这些实施例提供的目的是使本发明满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，这些公开内容所属领域的技术人员将会想到本文所述公开内容的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，这些公开内容不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在本文末尾所附权利要求的范围内。虽然本文采用了特定术语，但它们仅以一般性和描述性含义使用而不出于限制目的。 除非另外指明，否则本发明的实施将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完整的解释。参见例如Langenheim and Thimann, BOTANY PLANT BIOLOGYAND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John Wiley (1982)(Langenheim 和 Thimann，《植物学植物生物学及其与人类事务的关系》，约翰威立出版社，1982年)；CELL⑶LTURE ANDSOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, vol. 1，Vasil, ed. (1984)(《植物细胞培养与体细胞遗传学》，第 I 卷，Vasil 编辑，1984 年)；Stanier, et al.，THE MICROBIAL WORLD, 5th ed.，Prentice-Hall (1986) (Stanier等人，《微生物世界》，第5版，普伦蒂斯·霍尔出版社，1986 年)；Dhringra and Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985)(Dhringra和Sinclair,《植物病理学基本方法》,CRC出版社，1985年)；Maniatis, et al.，MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL(1982) (Maniatis 等人，《分子克隆实验指南》，1982 年)；DNA CLONING, vols. I and II,Glover, ed. (1985)(《DNA 克隆》，第 I 卷和 II 卷，Glover 编辑，1985 年)；OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, Gait, ed. (1984)(《寡核苷酸合成》，Gait 编辑，1984 年)；NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, Hames and Higgins, eds. (1984)(《核酸杂交》，Hames 和 Higgins 编辑，1984 年)和丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY, Colowick andKaplan, eds, Academic Press, Inc. ，San Diego, CA (《酶学方法》，Colowick 和 Kaplan 编辑，学术出版社，加州圣地亚哥)。单位、前缀和符号可以它们SI接受的形式表示。除非另外指明，核酸以5’到3’的方向从左向右书写；而氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左向右书写。数值范围包括限定该范围的数字。氨基酸在本文中可通过它们通常知道的三字母符号表示或通过IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可通过它们通常接受的单字母密码表示。下面定义的术语通过参考本说明书整体进行更完整的定义。在描述本发明时，将采用下面的术语，并采用下文所示的定义。所谓“微生物”意指任何微生物(包括真核微生物和原核微生物)，如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA，安大略省密西沙加加拿大基因公司(Cangene, Mississauga, Ontario))、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如 DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY PRINCIPLES ANDAPPLICATIONS，Persing，et al. ,eds. ,American Society for Microbiology,Washington,DC(1993)(《诊断分子微生物学原理和应用》，Persing等人编辑，《美国微生物学会》，华盛顿，1993年)。扩增的产物称为扩增子。术语“保守修饰的变体”同时适用于氨基酸序列和核酸序列二者。就特定核酸序列而言，保守修饰的变体指编码氨基酸序列的相同的或保守修饰的变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码丙氨酸这种氨基酸。因而，在每个由密码子规定丙氨酸的位置，可将该密码子变更为所描述的相应密码子的任一种而不会改变所编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”，代表保守修饰变异的一种。编码多肽的本文每种核酸序列还描述了该核酸的每种可能的沉默变异。普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了 AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌(Micrococcus rubens),对其而言GTG是甲硫氨酸密码子(Ishizuka, et al. , (1993) J. Gen. Microbiol. 139 :425-32 (Ishizuka 等人，1993 年，《普通微生物学杂志》，第139卷，第425-432页))都可以被修改以获得功能相同的分子。因此，编码本发明多肽的核酸的每种隐匿的变异均隐含在每种所描述的多肽序列中并以引用的方式并入本文。对于氨基酸序列，技术人员将认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自I至15的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7或10个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，底物特异性、酶活性或配体/受体结合通常为天然蛋白对于其天然底物的至少30%、40%、50 %、60 %、70 %、80 %或90 %，优选60-90 %。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。下面的六个组各含有对彼此而言是保守置换的氨基酸I)丙氨酸(A)、丝氨酸⑶、苏氨酸⑴；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸⑷；5)异亮氨酸⑴、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缴氨酸(V);和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。另参见Creighton, PROTEINS, ff. H. Freeman and Co. (1984) (Creighton,《蛋白质》，ff. H.弗里曼公司，1984年)。如本文所用，“基本上由......组成”意指在如下情况下目标多核苷酸可包括额
外的序列该额外的序列在严格杂交条件下不会选择性地杂交至与该多核苷酸所杂交的cDNA相同的cDNA，且该杂交条件包括在0. IX SSC^PO. I %十二烷基硫酸钠中在65°C下进行的洗涤步骤。就指定的核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成指定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可在该核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如内含子)，或可缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当用例如某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum) (Yamao, et al. , (1985) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 82 :2306-9 (Yamao等人，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第2306-2309页))或纤毛虫大核表达核酸时，可使用这些生物体中存在的通用密码的变体。
当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本发明的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray, et al. , (1989)Nucleic Acids Res. 17 477-98 (Murray等人，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，该文献以引用方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉米优选密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行实质性修饰的核酸。例如，有效连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者由其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质修饰。所谓“宿主细胞”意指含有载体并且支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉油菜、大麦、稷和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。术语“杂交复合体”包括指由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。在将核酸插入细胞的语境中，术语“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，包括指将核酸并入真核或原核细胞中，其中该核酸可并入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。术语“分离的”指诸如核酸或蛋白质之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。如本文所定义，“分离的”核酸也称为“异源”核酸。除非另有规定，否则术语“昼夜核酸”意指包含编码昼夜多肽的多核苷酸(“昼夜多核苷酸”)的核酸。如本文所用，“核酸”包括指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表指定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性的核酸文库如基因组文库和cDNA文库的构建在标准的分子生物学参考书有教导，如Berger and KimmeUUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES (Berger 和 Kimmel，《分子克隆技术指南》)，选自丛书 METHODS IN ENZYM0L0GY,vol. 152,Academic Press, Inc. , San Diego,CA(1987)(《酶学方法》，第 152卷，学术出版社，加州圣地亚哥，1987年)；Sambrook，et al. ,MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, 2nded. ,vols. 1-3(1989) (Sambrook等人,《分子克隆实验指南》,第二版,第1-3卷，1989年)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Ausubel,et al. ,eds,Current Protocols, ajoint venture between Greene Publishing Associates, Inc.and John Wiley & Sons,Inc. (1994 Supplement)(《最新分子生物学实验方法汇编》,Ausubel等人编辑,选自《实验室指南》，格林出版联合公司与约翰威立父子出版公司的合资公司)。如本文所用，“有效连接”包括指第一序列(如启动子)和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始或介导对应第二序列的DNA的转录。一般来讲，有效连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白质编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。 如本文所用，术语“植物”包括指整个植株、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本发明方法的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的种南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜猜属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、紅豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹤草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠爺属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番爺属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、爺属(Solanum)、碧冬爺属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米。如本文所用，“产量”包括指收获时针对谷粒水分(通常是15% )进行了修正后的每英亩谷类作物的蒲式耳数。谷粒水分是在收获时的谷粒中测量。谷粒的调整后测试重量被确定为对收获时谷粒水分含量做了修正之后的每蒲式耳的磅重。如本文所用，改善的“源-库”关系包括指与籽粒灌浆中同化物的供给(即源)和需求(即库)间的比例改善相关的特性。如本文所用，“多核苷酸”包括指脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列基本上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指代指定的序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其他原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(如次黄嘌呤核苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个实例)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，“启动子”包括指DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其他蛋白质(例如转录因子)的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。例子为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子被称为“组织偏好的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一个或多个器官中某些细胞类型中的表达，例如根或叶中的维管细胞。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的实例包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调节启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织优选的、细胞类型特异性的、发育调节的和诱导型的启动子构成了 “非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。如本文所用，“调控元件”或“调控多核苷酸”指调整与所述调控元件相关的可转录多核苷酸的表达的核酸片段。这种关联可能以顺式出现。植物启动子也可以用作调整有效连接至所述启动子的特定基因的表达的调控元件。当有效连接至可转录多核苷酸分子时，调控元件影响所述可转录多核苷酸分子的转录模式。“顺式元件”或“顺式作用元件”指影响基因表达的顺式作用的转录调控元件。顺式元件可以具有结合调整转录的转录因子、反式作用蛋白质的功能。本文公开的昼夜启动子可包含一个或多个提供昼夜基因表达模式的顺式元件。本文公开的植物启动子和调控元件可包括通过启动子工程产生的核苷酸序列，SP组合已知启动子和/或调控元件以产生人工的、合成的、嵌合的或杂交的启动子。这些启动子也可以组合来自一个或多个启动子的顺式元件,例如通过向包含昼夜表达调控元件的启动子添加异源组织特异性调控元件。因此，设想了包含至少一个本文公开的启动子的顺式元件，用于调整有效连接的多核苷酸序列的表达的嵌合或杂交启动子的设计、构建和使用。本文公开的启动子序列(包括SEQ ID NO :31-183及其片段，包括例如其50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800,1900,2000和最多2500个连续核苷酸并与这些片段具有约80%或85%或90%或95%或99%同一性)预期用于调整一个或多个异源基因的表达模式。在此语境下的术语“异源”指所关注的核苷酸的表达由不是所述核苷酸自身启动子的启动子序列或其片段调整。根据本文提供的指导，本领域普通技术人员可以容易地制备本文公开的多个启动子序列的缺失构建体。选择位于公开的调控元件3’或5’端侧翼的约25-50个连续核苷酸用于调整基因表达。也进行了突变分析以增强昼夜调控的特异性。术语“昼夜多肽”指一条或多条氨基酸序列。该术语还包括其片段、变体、同源物、等位基因或前体(例如原前蛋白或前蛋白)。“昼夜蛋白质”包括昼夜多肽。除非另有规定，否则术语“昼夜核酸”意指包含编码昼夜多肽的多核苷酸(“昼夜多核苷酸”)的核酸。如本文所用，“重组的”包括指已通过引入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。如本文所用，术语“重组的”不涵盖通过天然发生的事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的变更，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
如本文所用，“重组表达盒”是具有一系列规定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。可将重组表达盒掺入到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指并入蛋白质、多肽或肽(统称“蛋白质”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，除非另外进行限制，否则可涵盖可以以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥功能的天然氨基酸已知类似物。术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且基本上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少40%的序列同一性，优选60-90%的序列同一'I"生，最优选ioo%的序列同一'丨生(即互补性)。术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指探针与其靶序列杂交的程度将比它与其他序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的环境中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴别与探针可最高达100%互补的靶序列(同源探测)。或者，可调节严格性条件以允许序列中有一些错配，以使得检测到较低程度的相似性(异源探测)。优选地，探针长为大约500个核苷酸，但长度可变化很大，从小于500个核苷酸到等于靶序列的整个长度。通常，严格条件将为其中盐浓度低于约I. 5M钠离子，通常为约O. 01至I. OM钠离子浓度(或其他盐)，pH为7. O至8. 3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30°C，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60°C的那些条件。严格条件还可通过添加去稳定剂如甲酰胺或Denhardt’ s来实现。示例性的低严格性条件包括在37°C下用30至35%甲酰胺、IM NaCl、I % SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并在50至55°C下在IX至2X SSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中等严格性条件包括37°C下在40至45%甲酰胺、IM NaClU % SDS中杂交，并在55至60°C下在O. 5X至IX SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在50%甲酰胺、IM NaClU%SDS中于37°C下杂交，并在O. IX SSC中于60_65°C下洗涤。特异性通常决定于杂交后的洗涤，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，Tm可由Meinkothand Wahl, (1984)Anal. Biochem. 138 :267-84(Meinkoth 和 Wahl, 1984 年，《分析生物化学》，第 138 卷，第 267-284 页)的方程 T111 = 81. 5°C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -O. 61(%form)-500/L估计；其中M为单价阳离子的摩尔浓度，％ GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％ form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，L为杂交体的长度(单位为碱基对)。TmS 50%的互补靶标序列与完美匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和PH下)。每1%的错配，Tm降低约1°C ;因此，可调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至所需同一性的序列。例如，如果寻求具有彡90%同一性的序列，则可将Tm降低10°C。通常，将严格条件选择为比特定序列及其互补序列在确定的离子强度和PH下的热解链温度(Tm)低约5°C。然而，极端严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；适度严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低严格条件可以采用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20°C的杂交和/或洗涤；利用该公式、杂交和洗涤组成以及所需的Tm，普通技术人员将认识到杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化固有地得到了描述。如果所需的错配程度导致^低于45°C (水溶液) 或32°C (甲酰胺溶液)，则优选增加SSC浓度以使得可使用较高的温度。有关核酸杂交的详尽指南可在如下文献中找到Tijssen，LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BI0L0GY—HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, part I, chapter 2，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays, ^lsevierjNew York (1993) (Tijssen,《生物化学和分子生物学实验技术-与核酸探针的杂交》，第I部分，第2章，“有关杂交原理和核酸探针分析策略的综述”，爱思唯尔，纽约，1993 年)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, chapter 2，Ausubel，et al.，eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》，第2章,Ausubel等人编辑,格林出版社与Wiley-Interscience,纽约，1995年)。除非另有规定，否则在本专利申请中，高严格性定义为在4X SSC、5X Denhardt/ s (5gFicolI，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白于500ml水中)、O. lmg/ml煮沸的鲑精DNA和25mM磷酸钠中在65°C下杂交，和在O. IX SSC,O. 1% SDS中在65°C下洗涤。如本文所用，“转基因植物”包括指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括任何其基因型已因异源核酸的存在而被变更的细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此变更的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。如本文所用，“载体”包括指用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系(a) “参考序列”、(b) “比较窗口”、(c) “序列同一性”、(d) “序列同一性百分数”和(e) “基本上全同”。如本文所用，“参考序列”是用作序列比较基准的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如全长cDNA或基因序列的片段或完整的cDNA或基因序列。如本文所用，“比较窗口”意指包括指多核苷酸序列的连续和指定的片段，其中多核苷酸序列可与参考序列进行比较并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空 位罚分。将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的各种方法是本领域公知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith and Waterman, (1981)Adv. Appl. Math2 :482 (Smith 和Waterman, 1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))可以对用于比较的序列进行最佳比对；还可采用同源性对比算法(GAP) (Needleman and ffunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48 443-53 (Needleman和ffunsch, 1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页))；相似性搜索方法(Tfasta 和 Fasta) (Pearson and Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85 :2444(Pearson和Lipman, 1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444页))；这些算法的计算机化实施包括，但不限于Intelligenetics (加州山景城(Mountain View,California))的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software Package 第8版(可得自Genetics Computer Group ( GCG 程序(Accelrys公司(加州圣地亚哥(San Diego, CA)))中的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA。CLUSTAL 程序由如下文献详细说明Higgins and Sharp, (1988)Gene 73 :237-44(Higgins 和 Sharp, 1988 年，《基因》，第 73 卷，第 237-244 页)；Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5 :151-3 (Higgins 和Sharp, 1989年，《计算机在生物科学中的应用》,第5卷,第151-153页)；Corpet, et al.,(1988) Nucleic Acids Res. 16 10881-90 (Corpet 等人，1988 年，《核酸研究》，第 16 卷，第10881-10890 页)；Huang, et al. , (1992)Computer Applications in the Biosciences8 :155-65 (Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)和Pearson, et al. , (1994)Meth. Mol. Biol. 24 :307-31 (Pearson 等人，《分子生物学方法》，第24卷,第307-331页)。用于多个序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp (Feng andDoolittle, (1987) J. Mol. EvoI. ,25 :351-60 (Feng 和 Doolittle, 1987 年，《分子进化杂志》，第 25 卷，第 351-360 页)，其类似于 Higgins and Sharp, (1989)CABIOS 5 151-53 (Higgins和Sharp，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)描述的方法，并且据此以引用的方式并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白质查询序列针对蛋白质数据库序列进行查询JBLASTN，用于蛋白质查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见⑶RRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, Chapter 19, Ausubel, et al. , eds. , Greene Publishing andWiley-Interscience,New York(1995)(《最新分子生物学实验方法汇编》,第19章,Ausubel等人编辑，格林出版社与Wiley-Interscience,纽约，1995年)。
GAP利用Needleman和Wunsch(出处同上)的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP会考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。其允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，都必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。Wisconsin Genetics Software Package第10版中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。空位产生和空位延伸罚分可以以选自0-100的整数来表示。因而，例如，空位产生和空位延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更大。GAP给出具有最好的比对的家族中的一个成员。这个家族可能存在许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而被最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应 于空位的符号忽略。当一对符号的打分矩阵值大于或等于O. 50(相似性阈值)时，对相似性打分。Wisconsin Genetics Software .Package 第 10 版中所用的打分矩阵为 BL0SUM62 (参见 Henikoff and Henikoff, (1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA89 10915 (Henikoff 和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。除非另外指明，否则本文所提供的序列同一性/相似性值指用BLAST2. O程序包，采用默认参数获得的值(Altschul, et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25 3389-402 (Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页))。如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白质可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白质包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其他区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用 SEG (Wooten and Federhen, (1993) Comput. Chem. 17 149-63 (Wooten和Federhen, 1993年，《计算化学杂志》,第17卷，第149-163页))和XNU(Claverie andStates, (1993) Comput. Chem. 17 :191-201 (Claverie 和 States, 1993 年，《计算化学杂志》,第17卷，第191-201页))低复杂性过滤程序。在两条多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白质使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差别在于这种保守置换的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调节的方法是本领域技术人员所熟知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予I分，非保守置换给予O分，则保守置换给予O至I之间的分数。例如，根据Meyers andMiller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4 :11-17 (Meyers 和 Miller, 1988 年，《计算机在生物科学中的应用》，第4卷，第11-17页)的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE (Intelligenetics (美国加州山景城(Mountain View, California, USA)))中所实现的。如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分数是这样计算的确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。术语多核苷酸序列的“基本上相同”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100%之间的序列同一性，优选至少50%的序列同一'I"生，优选至少60 %的序列同一'丨生,优选至少70 %,更优选至少80 %,更优选至少90 %且最优选至少95%序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调节这些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白质的相 应同一性。用于这些目的的氨基酸序列基本上相同通常意指55-100%之间的序列同一性，优选至少55%，优选至少60%，更优选至少70%、80%、90%，最优选至少95%。核苷酸序列基本上相同的另一指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。遗传密码的简并性允许许多氨基酸置换，这种氨基酸置换在编码相同氨基酸的核苷酸序列中导致多样化，因而有可能该DNA序列可编码相同多肽但在严格条件下不彼此杂交。例如，当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生一个核酸拷贝时，这可能会发生。两条核酸序列是基本上相同的一个指示是，第一核酸编码的多肽与第二核酸所编码的多肽发生免疫交叉反应。在肽的情形中，术语“基本上相同”指肽包含在指定比较窗口上与参考序列具有55-100%之间的序列同一性；优选与参考序列具有至少55%的序列同一性,优选60%,优选70%,更优选80%,最优选至少90%或95%的序列同一性。优选地,利用Needleman和Wunsch(出处同上)的同源比对算法进行最佳比对。两条肽序列是基本上相同的指示是，一种肽可与针对第二种肽产生的抗体发生免疫反应。因而，例如，如果某种肽与第二种肽差别仅在于保守置换的话，则这两种肽基本上相同。此外，当某种肽与第二种肽差别在于非保守变化时,如果抗体识别的表位基本上相同，则它们基本上相同。“基本上相似的”肽共有如上所述的序列，例外的是不相同的残基位置差别可在于保守氨基酸变化。本发明公开了昼夜多核苷酸和多肽。本发明的新型核苷酸和蛋白质具有表明它们调控细胞数量并因而在植物发育中起重要作用的表达模式。该多核苷酸在多种植物组织中表达。该多核苷酸和多肽因而提供了操纵植物发育来改变种子和营养组织发育、时间安排或组成的机会。这可用于产生不育植株、无籽植株或具有改变的胚乳组成的植株。通过交互BLAST搜索并评估推断的蛋白质关系是否遵循物种形成模式，来鉴定拟南芥和水稻昼夜节律基因的玉米直系同源基因，然后查询叶和穗组织的振荡模式。采用这些标准，在玉米同源基因中鉴定出了数个主要核心组分，包括CCA1/LHY、TOCU PRR7/3、GI和 ZTL (图 I)。本研究鉴定了两个TOCl同源基因ZmTOCa和ZmTOCb，它们分别定位于5号和4号染色体。两个基因的转录都在6pm达到峰值，这与拟南芥TOCl基因表达相符。TOCl是伪应答调控因子(PRR)家族的成员，该家族由拟南芥和水稻中进化上保守的五个PRR基因组成(Murakami, et al.，(2007) Biosci Biotechnol Biochem 71 :1107-1110 (Murakami 等人,2007年，《生物科学、生物技术与生物化学》，第71卷，第1107-1110页)；Murakami,et al.，(2003) Plant Cell Physiol 44 :1229-1236 (村上等人，2003年，《植物细胞生理学》，第44卷，第1229-1236页))。除了两个ZmTOCl同源基因外，本研究还鉴定了 ZmPRR73、ZmPRR37和ZmPRR59，它们是基于序列相似性水平根据水稻PRR基因命名的(村上等人，(2003))。还鉴定了两个 ZEITLUPE 同源基因(Kim, et al.，(2007) Nature 449 :356-360 (Kim 等人，2007年，《自然》，第449卷，第356-360页))ZmZTLa和ZmZTLb，它们定位于2号和4号染色体。GIGANTI的两个玉米直系同源基因gigzlA和gigzlB此前已有描述(Miller，et al.，(2008)Planta 227 :1377-1388 (Miller 等人，2008 年，《植物》，第 227 卷，第 1377-1388 页))，在此确认了它们在穗和叶中的振荡。通过RT-PCR分析进一步确认了核心组分ZmCCA、ZmLHY、ZmTOCla和ZmTOClb的循环(图2)。与叶组织相比，发育期穗中的核心组元的振幅减弱，但仍然强健。这些数据表明大部分植物核心振荡器系统在非光合作用组织例如穗中起作用，但振荡器输出显然与影响下游昼夜表达改变的转录机器远远分离。 确定了昼夜调控的转录物遍及玉米叶细胞的大部分功能。本文所确定会受昼夜调控的6674个转录物(出自10，037个安捷伦(Agilent)阵列探针)代表超过22%的检测到的表达的全部转录物，这6674个转录物可以归属于1716个不同的基因本体(GO)项和22个KOG功能类别。一般而言，各个基因峰在其昼夜循环中只有一个峰。当把这些基因归属于各功能项并绘制这些功能项在一天范围内的相对富集时，大部分功能具有一天中时间特有模式的显著富集。然而，一些功能项也明显趋向于具有双峰模式，其中在IOAM有上午中间的峰，在傍晚6PM或晚上IOPM有第二个峰。超过18%的功能项被分类为双峰调控的，并根据上午或下午峰的相对富集进一步细分。加上指定为一天中只在一个峰处达峰值的各个功能，所述1738个功能的94. 5%归属于这两模式中的一种,只剩下95个归属于“其他”模式。通常双峰模式的功能项代表更广泛的基因富集功能分类，例如蛋白质激酶活性、信号转导机制或氨基酸转运和代谢。(图5)因此，这些双峰模式往往在整天也具有充分代表性，不只是IOAM和6/10PM。然而，基因和功能富集峰通常在上午中间出现并在傍晚/晚上再次出现，这仍然是昼夜模式的主要特征。在本实验中，日出是6:02AM，日落在8:40PM。因此，日出为IOAM的功能峰之前4小时，但日落为6PM时间点之后2. 45小时和IOPM时间点之前I. 25小时。附加的时间点可提供更高的分辨率，但在双峰模式中IOAM > 6/10PM模式的功能富集指数比6PM > IOAM模式高出70%，这可能与这些时间点相对于日出和日落的不对称分布有关。或者，一些功能类别可能固有地在上午阶段富集，反映潜在的生物趋势。1643个或94. 5%的功能项归属于一个时间峰模式,这表明各功能在一天中有相当确定的演化。可见功能组不是均匀分布于一天的不同阶段，而是表现出特定的模式和偏向。黎明富集的功能类别包括例如对寒冷的响应、脂类分解代谢和激素信号传导。然后在上午中间，多个激素响应功能被富集。预期中午由光合作用系统I和II、叶绿素合成和参与抗氧化剂生成的单脱水抗坏血酸还原酶(MDAR)主导。傍晚和晚上显示出明显的核糖体和DNA损伤修复(包括解旋酶、端粒酶和核酸内切酶活性)的富集，说明染色体和核糖体修复系统被激活。此外，蔗糖转运和戊糖磷酸支路在傍晚/晚上达峰值，说明了叶绿体碳水化合物代谢的力度变化。深夜峰包括红光远红光传导，如引言所述，其不仅调控核心时钟，而且调控过氧化氢代谢。在夜间通常与细胞死亡相关的半胱天冬酶(样)活性、光系统II分解代谢、核苷酸转运和代谢以及乙酰辅酶A结合功能都达到峰值。其他不规则但令人关注的峰模式是在6PM和2AM都达到峰值的氨基酸糖基化，以及在IOAM和2AM达到峰值的苹果酸酶和钙调蛋白结合。这些只是描述全株植物细胞生理学的非常复杂的情形的几个例子。值得注意的是，尽管许多基因和功能受昼夜调控，但大部分功能类别只有少数受昼夜调控的成员。在1738个功能类别中，平均覆盖率是28. 2 %，中位数为20 %，众数为约15%。昼夜调控的转录物无法完全代表包含多个基因的功能类别，对于昼夜调控的转录物而言，只有很少功能类别显著地富集。在昼夜调控组中，GO :0004614磷酸葡萄糖变位酶活性在6个转录物中有5个，GO =0009926生长素极性运输在4个转录物中有3个。这些发现说明昼夜调控的转录物参与但不主导这些不同的功能。在分析中鉴定了多个玉米昼夜调控的基因。总共471个序列，包括来自未成熟穗的序列、在叶组织中有闻振幅/大幅度循环的序列以及与NUE和碳氣功能相关的多种序列。这些序列包含0RF、编码的多肽和与其相关的启动子。 鍾本发明特别提供包括昼夜多核苷酸在内的RNA、DNA及它们的类似物和/或嵌合体的分离的核酸。本发明还包括为在不同生物体中表达而经优化的多核苷酸。例如，对于多核苷酸在玉米植物中的表达，可变更该序列以解决特定的密码子偏好性和改变GC含量，如根据Murray等人(出处同上)所述。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子使用在Murray等人(出处同上)的表4中列出。本发明的昼夜核酸包括分离的昼夜多核苷酸，所述多核苷酸包括(a)编码昼夜多肽及其经保守修饰的和多态性的变体的多核苷酸；(b)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；(c) (a)或(b)的多核苷酸的互补序列。下面的表I列出了本文公开的多核苷酸和多肽的具体成份表I
权利要求
1.一种分离的多核苷酸,所述分离的多核苷酸选自 a.多核苷酸，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多核苷酸与选自SEQID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和 470 的多核苷酸的全长序列具有至少90%的序列同一性；其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽具有昼夜活动调节剂的功能； b.多核苷酸，所述多核苷酸选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和 470 ； c.与(a)或(b)的多核苷酸完全互补的多核苷酸； d.由(a)或(b)的多核苷酸编码的多肽；和 e.多肽，如用GAP算法在默认参数下确定的，所述多肽与选自SEQID NO :185,187,189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291、293、295、297、299、301、303、305、307、309、311、313、315、317、319、321、323、325、327、329、331、333、335、357、359、361、363、365、367、369、371、373、375、377、379、381、383、385、387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407、409、411、413、415、417、419、421、423、425、427、429、431、433、435、437、439、441、443、445、447、449、451、453、455、457、459、461、463、465、467、467、469 和 471的多肽的全长序列具有至少90%的序列同一性。
2.一种重组表达盒，所述重组表达盒包含权利要求I所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸以有义或反义取向有效连接至启动子。
3.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求2所述的表达盒。
4.一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求2所述的重组表达盒。
5.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
6.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物是双子叶植物。
7.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘蔗和可可。
8.—种转基因种子，所述转基因种子来自权利要求4所述的转基因植物。
9.一种调制植物昼夜节律的方法，所述方法包括 a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求I所述的多核苷酸；和 b.在植物细胞生长条件下培养所述植物；其中所述植物细胞中的所述昼夜节律被调制。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述植物细胞来自选自以下的植物玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜猜、棉花、水稻、大麦、稷、花生、甘鹿和可可。
11.一种调制植物中整株植物或昼夜节律的方法，所述方法包括 a.向植物细胞中引入重组表达盒，所述重组表达盒包含有效连接至启动子的权利要求I所述的多核苷酸； b.在植物细胞生长条件下培养所述植物细胞；和 c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物中的昼夜节律被调制。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、稷、花生和可可。
13.一种来源于对转基因植物组织进行加工的方法的产品，所述转基因植物组织表达编码昼夜起作用的基因的分离多核苷酸，所述方法包括 a.用重组表达盒转化植物细胞，所述重组表达盒包含多核苷酸，所述多核苷酸与选自SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、20、40、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、260、262、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290、292、294、296、298、300、302、304、306、308、310、312、314、316、318、320、322、324、326、328、330、332、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358、360、362、364、366、368、370、372、374、376、378、380、382、384、386、388、390、392、394、396、398、400、402、404、406、408、410、412、414、416、418、420、422、424、426、428、430、432、434、436、438、440、442、444、446、448、450、452，、454、456、458、460、462、464、466、468 和470的多核苷酸的全长序列具有至少90%的序列同一性；所述多核苷酸有效地连接至启动子;和 b.在植物细胞生长条件下培养所述转化的植物细胞；其中所述转化的植物细胞的生长被调制； c.在形成植物的条件下培养所述植物细胞，以在植物组织中表达所述多核苷酸；和 d.对所述植物组织进行加工以获得产品。
14.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物是单子叶植物。
15.根据权利要求13所述的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、甘蔗和稷。
16.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述多核苷酸的过表达导致与未转化的植物相比改善了的植物生长。
17.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，表现出改善的源-库关系。
18.根据权利要求4所述的转基因植物，其中所述植物与未转化的植物相比，具有提高的产量。
19.一种调控多核苷酸分子,所述分子包含选自以下的序列(a) SEQ ID NO :31-183 ；(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO :31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90%的同一性。
20.一种嵌合多核苷酸分子，所述分子包含权利要求19所述的核酸片段。
21.根据权利要求20所述的嵌合分子，所述分子包含所述昼夜调控元件和组织特异性表达元件。
22.根据权利要求21所述的嵌合分子，其中所述组织特异性表达元件选自根特异性、维管束鞘细胞特异性、叶特异性和胚特异性表达元件。
23.根据权利要求19所述的调控多核苷酸分子，其中所述调控多核苷酸分子是启动子。
24.一种包含权利要求19所述的调控分子的构建体，所述调控分子有效连接至异源多核苷酸分子，其中所述异源分子赋予所关注的性状。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中所述所关注的性状选自耐旱性、耐冻性、耐寒性、抗病性和昆虫抗性。
26.根据权利要求24所述的构建体，其中所述异源分子在源-库代谢中起作用。
27.一种用权利要求19所述的调控分子转化的转基因植物。
28.根据权利要求27所述的转基因植物，其是单子叶植物。
29.根据权利要求27所述的转基因植物，其选自玉米、大豆、卡诺拉油菜、棉花、向日葵、苜猜、甜菜、小麦、裸麦、水稻、甘蔗、燕麦、大麦、草坪草、高粱、稷、番茄、木豆、蔬菜、果树和饲草。
30.一种增加植物产量的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下表达所关注的异源多核苷酸。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述异源多核苷酸是昼夜调控的植物基因。
32.—种提高植物非生物胁迫耐性的方法，所述方法包括在权利要求19所述的调控分子的控制下在植物中表达一种或多种赋予非生物胁迫耐性的多核苷酸。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述非生物胁迫耐性选自耐旱性、耐冻性和耐寒性。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐旱性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于中午或傍晚左右。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述赋予耐冻性或耐寒性的多核苷酸是在调控元件控制下表达的，其峰值表达发生于黎明或上午中间左右。
36.一种降低转基因表达的产量抑制的方法，所述方法包括表达有效连接至调控多核苷酸分子的转基因，所述调控多核苷酸分子包含选自以下的序列(a) SEQ ID NO :31-183;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO =31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO :31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90%的同一性。
37.一种筛选涉及非生物胁迫耐性的候选基因的方法，所述方法包括(a)鉴定在组成性表达或组织特异性表达下表现产量抑制的一个或多个候选基因和(b)在引导昼夜表达模式的调控分子控制下表达所述候选基因。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述调控分子包含选自以下的序列(a)SEQID NO :31-183 ;(b)核酸片段，所述核酸片段包含SEQ ID NO :31-183之一的至少50-100个连续核苷酸，并且其中所述片段包含表2所列的一个或多个昼夜调控元件；和(c)核酸序列，所述核酸序列具有用GAP算法在默认参数下确定的与SEQ ID NO :31-183之一的约500-1000个连续核苷酸至少90%的同一性。
全文摘要
本发明提供涉及玉米的叶和穗组织中昼夜循环的多核苷酸序列。本发明提供了多核苷酸序列及其编码的与振荡相关的多肽的用途。所述公开的序列负责控制作物中植物生长、源-库关系和产量。
文档编号C12N5/10GK102906267SQ201180012114
公开日2013年1月30日 申请日期2011年1月6日 优先权日2010年1月6日
发明者O.N.丹尼列夫斯卡亚, J.E.黑本, K.R.海斯, C.R.西蒙斯, S.D.德尚 申请人:先锋国际良种公司, 纳幕尔杜邦公司