表达载体的制作方法

专利名称：表达载体的制作方法
表达载体自从Kohler和Milstein于1975年发现单克隆抗体(mAbs)以来,它们已成为极有价值的分子工具。由于它们的高特异性，单克隆抗体(mAbs)被用于生物学范畴中的标准技术，成为对蛋白功能和分布进行表征的关键。除了它们在基础研究中的应用之外，mAbs还被广泛用作为诊断和治疗活性剂。由于它们的广泛应用范围，mAbs的产生成为标准流程。但是，其仍可能存在问题，因为对于生理学设置中的研究而言，mAbs识别以其天然构象存在的抗原是很重要的。最常见地，针对源于靶蛋白的预测序列的合成肽来制造mAbs。不幸的是，这些Abs虽然具有与肽的强烈反应性，但频繁失败于识别天然蛋白。产生mAbs的另一标准流程使用重组表达的蛋白。原核表达系统是最广泛使用的表达宿主。但是当研究哺乳动物表面蛋白时，通常必须要使用哺乳动物表达系统，因为它们更可能产生具有合适的二硫键、翻译后糖基化或蛋白水解修饰的功能性蛋白。对重组蛋白的纯化通常是繁琐的任务，这经常代表着获得抗体的限制性步骤。虽然引入亲和标签能简化纯化，但以足够的产率及纯度获得天然构象的重组蛋白仍是困难的。这最显著地应用于膜相关蛋白，因为它们可能在纯化过程期间丢失其天然结构。当企图产生能识别处于天然背景的蛋白的mAbs时，下述也很关键不仅在免疫步骤中、还要在筛选流程中也使用天然构象的蛋白。很多标准杂交瘤筛选方案(例如将重组蛋白固定于固体支持物上)可显著改变蛋白构象。就这些原因而言，基于与重组蛋白的结合选择的mAbs可能不能结合处于天然背景的相同蛋白。因此，需要允许在细胞的细胞表面表达天然构象的抗原的抗原表达系统。在第一个目的中，本发明提供了用于蛋白的细胞表面表达的核酸表达载体，所述载体依序包含编码分泌信号肽的多核苷酸序列、用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点、和编码血型糖蛋白的跨膜结构域的多核苷酸序列。在核酸表达载体的一种优选实施方式中，血型糖蛋白的跨膜结构域是血型糖蛋白A的跨膜结构域。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，血型糖蛋白A的跨膜结构域是小鼠血型糖蛋白A跨膜结构域或亚美尼亚仓鼠(Armenian hamster)血型糖蛋白A结构域。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，小鼠血型糖蛋白A跨膜结构域包含Seq.Id. No. I中公开的氨基酸序列，亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白A结构域包含Seq. Id. No. 12中公开的氨基酸序列。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，分泌信号肽是蜂毒肽(bee-venommeIittin)的分泌信号肽。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，蜂毒肽的分泌信号肽包含Seq. Id. No. 2中公开的氨基酸序列。在另一优选的实施方式中，核酸表达载体还在用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点下游(3’ )包含编码FLAG标签的多核苷酸序列，所述标签包含Seq.Id. No. 3的氨基酸序列。
在另一优选的实施方式中，核酸表达载体还在编码血型糖蛋白的跨膜结构域的多核苷酸序列下游(3’)包含编码His标签(优选地，包含Seq.Id. No. 4中公开的氨基酸序列的His标签)的多核苷酸序列。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，克隆位点包含NheI、KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV和NotI的限制性酶切割位点。在另一优选的实施方式中，核酸表达载体包含选自由Seq. Id. No. 5、Seq.Id. No. 13、Seq. Id. No. 14和Seq. Id. No. 15构成的组的多核苷酸序列。在核酸表达载体的另一优选实施方式中，待表达的蛋白是膜相关蛋白。在第二个目的中，本发明提供了包含本发明的载体的细胞，优选地，哺乳动物细 胞，更优选地，ffiK细胞。在第三个目的中，本发明提供了用于产生针对特定蛋白的单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤a)用使用本发明的载体在其细胞表面表达特定蛋白的细胞去免疫非人动物，b)分离步骤a)的非人动物的脾细胞，c)将步骤b)的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生B细胞杂交瘤，以及d)鉴定表达针对特定蛋白的抗体的B细胞杂交瘤。在本发明的方法的一种优选的实施方式中，非人动物是小鼠或亚美尼亚仓鼠。“核酸表达载体”指能指导感兴趣的序列或基因表达的装配体。核酸表达载体包括与感兴趣的序列或基因有效相连的启动子。也可存在其它控制元件。此外，载体还可包括细菌复制起点、一种或多种可选择标志物、允许载体作为单链DNA存在的信号(例如M13复制起点)、多克隆位点和“哺乳动物”复制起点(例如SV40或腺病毒复制起点)。“载体”能将基因序列转移到靶细胞(例如病毒载体，非病毒载体，颗粒载体和脂质体)。载体用于将外来或异源DNA运送至合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可独立于宿主染色体DNA而复制，并且可产生载体及其插入的(外来)DNA的数个拷贝。术语“蛋白”在本文中使用时指氨基酸的聚合物，其不限于特定长度。因此，肽、寡肽和蛋白片段包括在的多肽的定义内。术语“单克隆抗体”在本文中使用时指从基本上同质的(substantiallyhomogeneous)抗体群获得的抗体，即，该群包含的各抗体除了可少量存在的可能的天然产生的突变之外是相同的。修饰词“单克隆”指从基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，其不应被解释为需要通过任何特殊的方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过杂交瘤方法(首先由Kohler和Milstein(1975)Nature 256 :495描述的)来制造，或可通过重组DNA方法(见例如美国专利号No. 4，816，567 (Cabilly等人)，以及Mage和 Lamoyi(1987)于 Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp. 79-97, Marcel Dekker, Inc.，New York中)来制造。单克隆抗体还可分离自使用例如McCafferty等人(1990)Nature348 :552-554中描述的技术产生的噬菌体文库。附图
简述图IA 显示了用于实施例中的人 ABCAl (Seq. Id. No. 7)、大鼠 TEMEM27 (Seq.Id. No. 9)和恶性疟原虫(P. falciparum)PFF0620c (Seq. Id. No. 11)蛋白的初级结构。用于所描述的构建体的结构域用斜线标示，并且指示了 N和C末端的氨基酸；
图IB显示了源于实施例中描述的载体的被表达的蛋白构建体的示意图。细胞外结构域等同于图IA中显示的那些；图2显 示了使用来自经pANITA2-ABCAl和pANITA2_TMEM27转染的HEK293细胞的全细胞裂解物的抗FLAG M2-HRP缀合抗体(Sigma)进行的Western印迹。观察到具有恰当分子量条带的强烈表达；图3A显示了 PFF0620C在经稳定转染的HEK细胞上的细胞表面表达。未经转染的HEK细胞(第I行)和展示PFF0620C的HEK细胞(第2行)的荧光(第2和3列)和微分干涉差显微图(第I列)。在室玻片上培养细胞，无固定下以抗FLAG抗体和经FITC标记的抗小鼠IgG抗体染色。用DAPI染色核；图3B显示了经稳定转染的HEK细胞上的PFF0620C的细胞外定位。用抗FLAG(左列)或抗6xHis抗体(右列)和经FITC标记的抗小鼠IgG抗体染色后PFF0620C-HEK细胞的荧光(第I和3行)和微分干涉差显微图(第2和4行)。使用抗FLAG抗体，活细胞和经甲醇固定的细胞被染色，而抗His抗体仅染色了经甲醇固定的细胞，这表明了 His标签的细胞内定位和FLAG标签(与源于恶性疟原虫的蛋白结构域一起)的细胞外定位；图4显示了针对与经转染细胞的结合对抗体进行筛选的结果。在第二个步骤中，通过IFA(免疫荧光检验)，针对与经转染细胞结合的抗体，筛选了 IgG的产生为阳性的所有孔。用各杂交瘤上清液染色点样到多孔载玻片上的经转染的和未经转染的ffiK细胞，并通过荧光显微镜进行分析；图5显示了对产生的单克隆抗体与重组恶性疟原虫蛋白的反应性的western印迹分析。针对相应的重组蛋白的代表性单克隆抗体的特异性由Western印迹分析展示。用分别按照所描述的那样产生的抗6xHis mAb和抗PFF0620cmAb来探测PFF0620c-(第I行)、含有不相关蛋白的对照PANITA2构建体(第2和3行)以及未经转染的HEK细胞(第4行)的裂解物。图6显示PFD1130W-特异性的单克隆抗体体内抑制寄生虫生长。
实施例在哺乳动物细胞的细胞表面的表达蛋白分别使用表达质粒pANITA2-PFF0620C、pANITA2-ABCAl 或 pANITA2_TMEM27，在 HEK细胞的细胞表面表达恶性疟原虫0RFPFF0620C、人ABCAl细胞外结构域和大鼠TMEM27细胞外结构域。为确保细胞表面的高水平表达，以若干方式修饰基因(图I) i.针对在哺乳动物细胞中的表达对内源序列进行密码子优化以及仅使用预测的细胞外结构域用蜂毒肽的分泌信号序列替换内源分泌信号序列对进行膜锚定，使用小鼠血型糖蛋白A的跨膜结构域编码序列代替预测的GPI连结信号序列或预测的跨膜结构域；iv.为允许表达分析，将FLAG标签插入跨膜结构域的N-末端，将6xHis标签放置于C末端。两种标签位于恰在跨膜结构域之前和之后，以协助对重组表达的抗原细胞外定位的验证。通过稳定转染，建立表达恶性疟原虫PFF0620C、人ABCAl细胞外结构域和大鼠TMEM27细胞外结构域的源于HEK的细胞系。为获得高表达的细胞系，用抗FLAG抗体进行表面染色之后，通过荧光活化细胞分选，将转染体分进高表达细胞库。达到分选进高表达细胞库的门限的细胞的平均荧光强度是所有转染体的2. 1-4. 3倍高。通过Western印迹分析，针对表达，对表达人ABCAl和大鼠TMEM27的细胞系进行了测试，显示出具有预期分子量的蛋白的高水平表达。(图2)。通过用抗FLAG抗体进行免疫荧光分析(在活细胞上产生了强烈的信号)，显示了恶性疟原虫PFF0620C蛋白的细胞表面表达。(图3)。相反，用抗6xHis抗体进行染色仅在甲醇固定的细胞上产生了强烈信号，而在活细胞上没有(图3B)。这些结果验证PFF0620c表达并锚定于细胞壁，其中FLAG-标签位于细胞外，以及His标签位于细胞内。在被经转染的HEK细胞免疫的小鼠中发展疟疾抗原特异性抗体用PFF0620C-HEK的高表达细胞库去免疫NMRI小鼠。小鼠在三个连续天获得IO6个细胞的静脉内注射，两周后再进行另一套三次每日注射。通过流式细胞术分析血清抗体效价的发展，将转染体的免疫染色与未经转染的ffiK细胞相比较。用转染体观察到的荧光强度是未经转染的对照ffiK细胞的四倍高。这表明小鼠增加了针对在经转染的HEK细胞表面表达的疟疾抗原的抗体应答。 将用经转染的HEK细胞免疫的小鼠的脾细胞与PAI骨髓瘤细胞融合，以产生B细胞杂交瘤。将融合的细胞分布于微滴定培养板的孔中。为鉴定产生PFF0620C特异性抗体的杂交瘤细胞，使用两步筛选流程，其完全避免了对经纯化的重组蛋白的需要。首先通过ELISA针对IgG产生来测试所有培养孔。测试孔的18-29%是阳性的。在第二步中，通过IFA，针对与经转染的细胞结合的抗体，筛选IgG的产生为阳性的所有孔。用各杂交瘤上清液对点样到多孔载玻片上的经转染的和未经转染的ffiK细胞进行染色，通过荧光显微镜分析(图4)。针对每种样品，将未经转染的HEK细胞用作为阴性对照。在经转染的细胞上阳性的大量克隆在未经转染的细胞上也是阳性。但是融合也产生含有与转染体强烈反应但不与未经转染的ffiK细胞反应的抗体的大量孔。所有其它抗体对用于免疫的经转染细胞来说都是特异性的，它们不染色对照转染体。从该类别的孔中，通过从PFF0620C-融合体重新克隆，获得17个杂交瘤克隆。再通过Western印迹分析,进一步验证单克隆抗体的特异性(图5)。mAbs中的16个在用于免疫的转染体裂解物中染色了相应的重组蛋白，但是在对照经转染的ffiK细胞或未经转染的HEK细胞的裂解物中则不染色。PFDl130w-特异性单克隆抗体体内抑制寄生虫生长我们在恶性疟原虫SCID小鼠模型中评估了抗PFD1130W mAbs的体内寄生虫抑制活性。使用用于产生针对恶性疟原虫PFF0620c的mAbs的相同方法和载体(见下文的方法章节)，产生抗PFDl 130w mAbs。该模型使用移植有人红细胞的非骨髓消减的N0D_scidIL2Rnull小鼠，以允许恶性疟原虫生长。多个三只小鼠的组(具有0. 58±0. 14%的寄生虫血症)分别被注射一次 2. 5mg 抗 PFD1130w cl2mAb、0. 5mg抗 _PFD1130w cl2mAb 或 2. 5mg 同型/亚类对照mAb (相对每只小鼠而言)。在接着的六天里监测所有小鼠的寄生虫血症。在仅接受PBS或对照mAb的小鼠中寄生虫血症继续增加，六天后达到11.3±0. 8%，接受0. 5mg抗-PFD1130w cl2mAb的小鼠的寄生虫血症增加至低得多的程度，六天后达到5. 6±1. 3%。接受2. 5mg抗-PFD1130W cl2mAb的小鼠的寄生虫血症直到实验结束也保持为较低(第6天1.4±0.3%)。六天后的寄生虫血症较之阴性对照组的差异是高度显著的(两侧t-检验；P < 0. 0001)(图 6)。
抗PFD1130w mAbs体内抑制寄生虫生长的事实表明描述的完全基于细胞的技术产生能结合其天然背景的内源蛋白的mAbs的能力。方法构建质粒和转化将编码蜂毒肽分泌信号序列的双链寡核苷酸与经NheI消化的pcDNA3. I (+)(Invitrogen)连接,产生质粒pcDNA3. 1_BVM,其具有保留在信号序列3’的单个NheI位点。使用从骨髓提取的RNA作为模板,通过rtPCR(Invitrogen SuperScript III第一链合成试剂盒和Roche Expand高保真PCR系统)，获得小鼠血型糖蛋白细胞质和跨膜结构域cDNA。得到的PCR扩增子被克隆进pCR2. I克隆载体。小鼠血型糖蛋白的引物含有5’NotI位点以及3’组氨酸标签，之后是终止密码子和EagI位点。用EagJ切下血型糖蛋白_6His片段，将其与经NotI消化的pcDNA3. 1_BVM连接，产生质粒pcDNA3. 1_BVM_GP，其具有保留在血型糖蛋白序列5’端的pcDNA3. INotI位点。为制造完全的表达载体(pANITA2)，将双链寡核苷 酸连接进经NotI消化的pcDNA3. 1_BVM_GP，其编码侧翼有短接头序列的Flag标签，产生加到Flag标签5，侧的独特的NotI位点。采用密码子使用的优化，合成大鼠TMEM27细胞外结构域(Seq. Id. No. 9的aa15-130)、恶性疟原虫基因PFF0620C的预测的细胞外结构域(Seq. Id. No. 11的aa 21-353)和人ABCAlN-末端细胞外结构域(Seq. Id. No. 7的aa 43-640) cDNA序列，以提供哺乳动物细胞培养中的高表达。将基因连接进PANITA2载体的独特的NheI和NotI位点，通过DNA测序验证载体的序列。之后将得到的质粒分别称为pANITA2-TMEM27、pANITA2-PFF0620C或PANITA2-ABCA1。在pANITA3. I和pANITA3. 3中，还通过定点诱变除去天然pcDNA3. IXbaI和XhoI位点。多克隆位点和融合蛋白编码序列的特征显示于下表I中，其中从插入起始开始编号。通过PCR克隆和核苷酸测序测定亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白序列，其中使用中国仓鼠血型糖蛋白序列作为引物设计的指导，并且使用从亚美尼亚仓鼠骨髓RNA制备物产生的cDNAo 下述序列描述于表 I 中:具有 Kozak 序列的 pANITA2 = Seq. Id. No. 15, pANITA3. I =Seq. Id. No. 13，和 pANITA3. 3 = Seq. Id. No. 14。表I :对表汰载体的比较
载体元件pANITA2 pANITA3.1 pANITA3.3
Kozak 序歹丨J1-121-121-12
蜂毒肽信号序列9-729-729-72
独特NheI限制性位点70 7570-7570-75
独特KpnI限制性位点82-8782-8782-87
独特BamHI限制性位点94-9994-9994-99独特 EcoRI 限制性位点106-111106-111106-111
独特 EcoRV 限制性位 I、112-117112-117112-117
独特XbaI限制性位点-118-123118-123
独特 NotI 限制性位点124-131124-131124-131
Flag标签/肠激酶切割位点133-156133-156133-156
独特 HindIII 限制性位点-154-159154-159
小鼠血型糖蛋白膜锚172-369163-369-
亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白膜锚--178-375
6-His 标签382-399382-399388-405
终止密码子400-405 400-405 406-411建立稳定表达PFF0620C、TMEM27或ABCAl结构域的HEk293细胞系使用JetPEI (PolyPlus)转染试剂，按照厂商方案，用 pANITA2_TMEM27、PANITA2-PFF0620C或pANITA2-ABCAl转染293HEK细胞。转染后48小时开始抗生素选择。每3-4天更换含有500ug/ml遗传霉素(Gibco)的选择培养基。非抗生素抗性细胞死掉以及抗性细胞开始正常生长之后，通过FACS产生高表达的库。用不含酶的解离缓冲液(不含酶、基于 Hank’s 的细胞解离缓冲液(Cell dissociation buffer enzyme-free Hanks，-based),Gibco)来解离细胞，用封闭缓冲液(含有3% BSA的PBS)来洗。然后将细胞与200 yl稀释于封闭缓冲液中的IOOii g/ml抗-FLAG mAb = FLAG-27在冰上孵育15分钟。然后用封闭缓冲液洗细胞，并与200 u I稀释于封闭缓冲液中的100 u g/ml FITC缀合的山羊抗小鼠IgG 抗体(RAM/IgG (H+L)/FITC, Nordic Immunological Laboratories)在冰上孵育 15 分钟。最后洗涤之后，使用BD FACSAria运行FACSDiva软件，分析和分选经标记的细胞。使用合适的散点图门限(scatter gates)，进行所有分析，以排除细胞碎片和聚集物。门限设置被设置为收集经过高度标记的细胞。分选后，在具有20% FCS的培养基中收集细胞，并将其涂布于35mm孔中。
对活HEK细胞的免疫荧光染色为对活HEK细胞进行免疫荧光染色，使用室玻片(4孔室玻片，Lab-TekTM，NuncTM)。在湿箱中于室温下用H2O中的100mg/l多聚-D-赖氨酸对孔进行包被过夜。用灭菌H2O对孔洗三次后，每个孔接种40’000个细胞。三天后，通过将孔与500 Ul稀释于不含血清的培养基中的合适的mAb孵育，在冰上进行30分钟免疫染色。用不含血清的培养基洗两次后，向孔中加入500 ii I稀释于不含血清的培养基中的IOOii g/ml FITC-缀合的山羊抗小鼠IgG抗体(RAM/IgG (H+L)/FITC, Nordic Immunological Laboratories),并在冰上鮮育 30 分钟。最后，用不含血清的培养基对孔漂洗两次，并用DPBS (Dulbecco' s含钙的磷酸缓冲盐溶液，Gibco)洗一次。用含有DAPI (含有DAPI的ProLong Gold抗变色试剂，Invitrogen)的封固溶液对玻片封固，盖上盖玻片。按照上文所述对染色加以评估。对小鼠的免疫
通过静脉注射IO6个经稳定转染的HEK细胞来对NMRI小鼠进行免疫。解冻细胞，洗涤并重悬浮于0. 9% NaCl中。在三个连续天，以及两周后再在三个连续天，完成注射。强化之后，收集血液，使用经稳定转染的293HEK细胞，通过IFA，针对抗PFF0620C抗体的存在，对血清加以测试。选择具有与表达的细胞强烈反应的血清的动物用于融合。它们在融合前两天和一天接受IO6个细胞的最终注射。处死小鼠，并移出脾。通过在无菌条件下研磨来收获脾细胞，并使用聚乙二醇1500 (Roche Diagnostics)将其与骨髓瘤细胞搭档(PAI小鼠骨髓瘤细胞，源于P-3X63-Ag8)融合。将融合混合物涂布到多孔板上，通过在补充有小鼠巨噬细胞P388的培养物上清液的HAT培养基中生长，来选择杂交瘤。通过下文所述的ELISA和IFA，在融合后2-3周，针对特异性IgG的产生来筛选孔。通过有限的稀释，克隆来自最初筛选中阳性的孔的细胞，以获得单克隆群。IgG ELISA 筛选 在湿箱(humid box)中，用100 ii I稀释于PBS中的5 ii g/ml山羊抗小鼠IgG ( Y-链特异性)mAb (Sigma)包被 Maxisorp 板(Nunc)过夜。用含有 0. 05% Tween-20 的 PBS 洗两次后，用封闭缓冲液(50mM Tris、140mM NaCl、5mM EDTA.O. 05% NONidet P40、0.25% 明胶、1% BSA)于37°C对孔封闭I小时，之后洗两次。向孔中加入50iU杂交瘤上清液，并在37°C孵育I小时。洗四次后，在室温黑暗下、于湿箱中，用50iU以I : 1000稀释于封闭缓冲液中的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG( Y-链特异性)(Sigma)对板孵育I小时。洗四次后，加入TMB过氧化物酶底物溶液，监测颜色改变。抗体产生和表征使用小鼠单克隆抗体同型试剂盒(IS02，Sigma)进行对抗体同种型的鉴定。为进行大规模mAb生产，于500ml转瓶(Corning)中培养杂交瘤细胞系。使用蛋白A或蛋白G琼脂糖凝胶，通过亲和色谱纯化mAbs。DNA和蛋白序列
权利要求
1.用于蛋白的细胞表面表达的核酸表达载体，所述载体依序包含含有编码分泌信号肽的序列的多核苷酸序列、用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点、和包含编码血型糖蛋白的跨膜结构域的序列的多核苷酸序列。
2.权利要求I的核酸载体，其中所述血型糖蛋白的跨膜结构域是血型糖蛋白A的跨膜结构域。
3.权利要求I或2的核酸载体，其中所述血型糖蛋白A的跨膜结构域是小鼠血型糖蛋白A跨膜结构域或亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白A结构域。
4.权利要求3的核酸载体，其中所述小鼠血型糖蛋白A结构域包含Seq.Id. No. I中公开的氨基酸，以及所述亚美尼亚仓鼠血型糖蛋白A结构域包含Seq. Id. No. 12中公开的氨基酸序列。
5.权利要求1-4的核酸载体，其中所述分泌信号肽是蜂毒肽的分泌信号肽。
6.权利要求5的核酸载体,其中所述蜂毒肽的分泌信号肽包含Seq.Id. No. 2中公开的氨基酸序列。
7.权利要求1-6的核酸载体，其还在用于插入编码待表达蛋白的多核苷酸序列的克隆位点下游(3’ )包含编码FLAG标签的多核苷酸序列，所述标签包含Seq. Id. No. 3的氨基酸序列。
8.权利要求1-7的核酸载体，其还在编码血型糖蛋白的跨膜结构域的多核苷酸序列下游(3’)包含编码His标签的多核苷酸序列，所述His标签优选地是包含Seq. Id. No. 4中公开的氨基酸序列的His标签。
9.权利要求1-8的核酸载体，其中所述克隆位点包含NheI、KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV和NotI的限制性酶切割位点。
10.权利要求1-9 的核酸载体，其包含选自 Seq. Id. No. 5,Seq. Id. No. 13,Seq. Id. No. 14或Seq. Id. No. 15的多核苷酸序列。
11.权利要求1-10的核酸载体，其中所述待表达的蛋白是膜相关蛋白。
12.包含权利要求1-11的载体的细胞，优选地，哺乳动物细胞，更优选地，HEK细胞。
13.权利要求12的细胞用于表达适于抗体产生的蛋白的用途。
14.权利要求12的细胞用于免疫用于抗体产生的非人动物的用途，所述抗体优选地是单克隆抗体。
15.用于产生针对特定蛋白的单克隆抗体的方法，所述方法包括下述步骤 a)用使用权利要求1-11的载体在其细胞表面表达特定蛋白的细胞免疫非人动物， b)分离步骤a)的非人动物的脾细胞， c)将步骤b)的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，产生B细胞杂交瘤，以及 d)鉴定表达针对特定蛋白的抗体的B细胞杂交瘤。
16.权利要求15的方法，其中所述非人动物是小鼠或仓鼠。
17.如前文描述的本发明。
全文摘要
本发明提供了用于蛋白的细胞表面表达的表达载体。
文档编号C12N15/85GK102782142SQ201180011799
公开日2012年11月14日 申请日期2011年2月28日 优先权日2010年3月2日
发明者A·德雷耶, H·马蒂勒, J·比彻姆 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司