用于诊断路易体痴呆的遗传标记的制作方法

专利名称：用于诊断路易体痴呆的遗传标记的制作方法
用于诊断路易体痴呆的遗传标记本发明涉及医学领域，并且特别涉及神经退行性疾病。本发明具体涉及用于路易体痴呆诊断的标记。
背景技术：
路易体疾病包括以存在称作路易体(LB)的蛋白质性神经元包涵体(proteinaceous neuronal inclusion)为特征的一组病症。在临床上，可以区分帕金森病(PD)和路易体痴呆(DLB)两种病症。是老年人中最常见的进行性运动病症，而DLB是仅次于阿尔茨海默病(AD)的导致痴呆的第二大常见的原因。虽然LB实际上在每个脑区域内的广泛分布是DLB的典型特征，但是在ro中黑质受影响最大。
最初描述DLB时，认为DLB是罕见的病症，但是在过去几年，广泛研究已表明DLB占尸检病例的10-15%。主要的DLB症状包括认知损害波动、经常出现视幻觉和帕金森症，然而，许多与AD重叠的症状导致时常发生DLB误诊。由于AD和DLB患者在对药物治疗的响应和预后方面不同，重要的是提高DLB诊断的准确度。为了实现DLB与AD之间更好的临床区分，在过去几年内已经开展了多种纵向研究和比较研究。仅具有路易体(LB)病理学的患者比仅具有AD或者具有混合性AD/LB病理学的患者表现出相对较少的严重损害但是更显著的执行功能和注意力衰退。此外，DLB患者比具有AD的患者表现出较慢的认知记忆减退，但是具有更多的精神病学症状，其中该种症状学在较后的疾病阶段会观察到。最后，已经证明在早期阶段痴呆中视幻觉的存在对DLB最具有特异性。值得提及的是，虽然达到了临床诊断的高特异性(在不同研究中从90至99%的范围变化)，但其灵敏度仍然相对较低(18-83%)。因此，对在1996年建立的用于很可能和可能DLB临床诊断的第一公认指南已经进行修订以提高DLB诊断的灵敏度，然而，许多与AD重叠的症状导致在40-80%病例之间的频繁DLB误诊。低的DLB诊断灵敏度的主要原因源于增加比率的病例表现出除了 LB相关病理学之外的AD特征性变化。为了评价该类型的组合病理学，第三DLB协会提出ー个模型将AD相关病理学置入到LB病理学环境中。AD类型病理学阶段越高，实现正确诊断DLB的灵敏度越低。因此，最近的报告证实，随着AD相关病理学的増加，DLB的误诊增加，但是即便如此，仅大约52%的患者在低AD病理学阶段被正确诊断为DLB。对DLB的治疗是症状性的，并且基于有限次数的临床试验和来自AD试验的结果延伸。现在，AD治疗包括使用胆碱酯酶抑制剂或者通过增加脑内こ酰胆碱水平或者通过强化神经细胞对こ酰胆碱响应的方式来改善こ酰胆碱的有效性。此外，神经安定药用于減少通常在病程过程中出现的精神病症状。相反，对于治疗DLB，使用神经安定药会在大约50%的DLB患者中引起不良反应并可能引起死亡。因此，区别性地诊断AD与DLB的能力不仅对于待治疗个体而言是主要的优势，而且对于公共健康系统的经济压カ而言也是主要的优势。然而，当前，精确地区分AD与DLB仅可能依靠死后的脑组织分析。现在，DLB诊断基于按照由DLB国际工作组协会(the Consortium on DLBInternational Workshop)建立的指南(I.G. McKeith, “Consensus guidelines forthe clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB)(路易体痴呆(DLB)临床和病理诊断的公认指南DLB国际工作组协会报告)”，T. Alzheimer, sDis. 2006，第9卷，第417-23页)对症状和特征的临床评价，但是如上面所解释，其导致DLB误诊。影像学方法如正电子断层成像术(PET)和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)可以利用，但是它们的敏感性不是非常高并且它们对于常规临床应用而言非常昂贵。早期明确诊断将给出治疗范围以降低或停止疾病进展。已经存在一些尝试试图找到遗传标记以精确地识别患有DLB的患者。遗传学试验将是非常有用的工具并且在DLB生前诊断中的每日临床实践中容易开展。在这个意义上，为发现与DLB的关系而研究联系的ー些蛋白质和基因是a -7烟碱こ酰胆碱受体亚基、骨桥 蛋白、ー氧化氮合酶、泛素羧基末端水解酶LI基因、BDNF基因或￠-突触核蛋白基因。它们当中有许多已经在试验水平在脑样本中进行了研究，并且它们无法用于真正的临床诊断，因为难于得到患者脑活检。丁酰胆碱酯酶(BChE)是在肝脏中合成的糖蛋白酶。在人脑中发现其主要位于神经胶质中，特别是皮质和皮质下结构中，但是其还发现于神经元中，尤其是涉及认知功能的那些神经元中。在AD患者中，BChE存在于淀粉状蛋白斑中，以及神经原纤维缠结中。该酶作为有机磷和氨基甲酸酯化合物的解毒酶起作用并且水解琥珀酰胆碱、阿司匹林和可卡因。BChE在人脑中的功能尚不熟知，但是已知当こ酰胆碱酯酶(AChE)减少或者缺乏时其水解こ酰胆碱(ACh)。它是用于决定呼吸暂停易感性的标记。到目前，已经在位于3号染色体上(3q26. l-q26. 2)的BChE基因中鉴定出65个变体(參见F. Parmo-Folloni等，“Twonew mutations of the human BCHE gene (人 BCHE 基因的两个新突变)(IVS3-14T > C 和L574fsX576) ”Chemico-BioloRical Interactions 2008，第 175 卷，第 135-7 页)。为了表示对Werner Kalow的敬意，将BChE基因外显子4中存在的A539T突变命名为K变体。K变体与对应于DNA序列(NCBI登录号NG_009031)中位置68974的mRNA中核苷酸1615位置处的从鸟嘌呤至腺嘌呤的DNA转换有夫，这导致氨基酸从丙氨酸539改变成苏氨酸。K变体位于蛋白质的C末端，一方面负责其四聚体化并且另一方面负责弱化￠-淀粉状蛋白纤丝形成。在血清中，BChE K变体造成血清BChE活性水平降低三分之一。虽然BChE在脑中的主要功能仍然未知，但是K变体似乎降低了 P -淀粉状蛋白纤丝形成的衰减速率，从而加速了 AD进展。相反，tau蛋白在携帯至少ー个K等位基因的AD患者中较少磷酸化，这表示出对AD的保护性机制。许多研究已经研究了 BChE基因，尤其是BChE K变体与AD之间可能的关联。已经讨论了载脂蛋白E基因(ApoE4) e4等位基因——一种对于AD已知的主要遗传风险因子——与BChE基因变体的同时出现影响AD病理学。ー些报告显示，在具有BChE野生型和ApoE4基因型组合的受试者中AD风险增加。其它报告发现，BChE K和ApoE4组合增加AD风险。已经表明，AD中认知减退的进行受BChE基因型的影响。然而，关于BChE K变体既不作为AD风险因子也不作为AD进展标记的作用没有明确结论。已经研究了 BChE K基因型和DLB之间可能的相关性。Singleton等(A. B. Singleton ^Butyrylcholmesterase K an association with dementia withLewy bodies ( 丁酰胆碱酷酶K :与路易体痴呆的相关性)”，Lancet 1998,第351卷，第1818页)报导了与对照相比DLB中纯合BChE K携帯者频率增加。最近的研究发现，与PDD 患者相比，DLB 患者中 BChE K 和 ApoE4 频率增加(R. Lane 等，“BuChE-K and APOEepsilon4 allele frequencies in Lewy body dementias, and influence of genotypeand hyperhomocysteinemia on cognitive decline(路易体痴呆中BuChE-K和APOE e 4等位基因频率，以及基因型和高同型半胱氨酸血症对认知减退的影响)”，Mov. Disord. .2009，第24卷，第392-400页)。基于比PDD受试者更高百分比的DLB具有额外的AD类型病理学并且额外的AD类型病理学导致更快速认知减退的假设，作者推断，该基因型在痴呆发生和LBD进展中可能是重要的。然而，最近的研究表明，在BChE K变体与痴呆的DLB表型之间不存在显著的相关性(參见 W. Maetzler 等,“ No differences of butyry Icho I inesteraseprotein activity and allele frequency in Lewy body diseases (在路易体疾病中，丁酰胆碱酯酶蛋白质活性以及等位基因频率无差异)”Neurobiol. Dis. 2009，第35卷，第296-301 页)。
因此，需要提供将在普通临床实践中使用的用于精确鉴别患有路易体痴呆的患者并与阿尔茨海默病相区别的方法。

发明内容
发明人已经发现了使得能够确定患者是否患有路易体痴呆并且将其与阿尔茨海默病相区别的BChE基因中的特异性改变。在现有技术中存在g在寻找BChE K变体与DLB之间相关性的文献，但是如下所解释，最近的研究认为没有明显的相关性(參见W. Maetzler等，见上)。令人惊奇地是，本发明的发明人已经发现，利用与在BChE基因中在位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区迄今为止未知改变的基因型同时出现的K变体基因型，获得了用于DLB诊断的特异信息。因此，确定这两个基因型可用于区别DLB与AD，这两个基因型构成了 DLB的特异性遗传标记。本发明人还进ー步观察到，基因型的组合可以鉴别一组患有DLB并与AD相区别的患者。该组合由NCBI登录号NG_009031中在位置3687、4206和4443处的多态性位点、在位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区的基因型(即分别是SEQ ID NO :1的位置3687、4206、4443和4780-4786)，和在NCBI登录号NG_009031中在位置68974的多态性位点(即SEQID NO 28中的位置934)的基因型形成。BChE核苷酸序列中改变的位置从对应于启动子和基因的NCBI登录号NG_009031的核苷酸序列给出。该序列于2010年I月31日公布。多态性位点3687、4206、4443和在位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区位于启动子区域内。对于这些位点，还參考SEQ ID NO 1,SEQ ID NO :I对应于NCBI中BChE完整序列从核苷酸I至核苷酸5040的序列。有时使用的核苷酸可能编号使用转录起始作为位置1，并且因此，该位置上游的核苷酸作为负数位置。转录起始位置I对应于NG_0090031中的位置5001。在本说明书中使用的编号与“负数”编号之间的对应在此给出A3687G 对应于 A-1314GA4206G 对应于 A-795GC4443T 对应于 C-558T
从4780至4786的多聚胸腺嘧啶对应于_215至-221位置68974处的多态性位点位于NG_009031的编码区内。从NG_009031的位置68041至7020的区域作为SEQ ID N0:28包括在内。单独以该区域来说，将核苷酸重新编号，因此在完整基因序列中的位置68974变成了 SEQ IDNO 28中的位置934。该多态性与BChE外显子4中氨基酸变化有夫，导致产生K变体。由于序列编号不同，所以在文献中对于该多态性使用的位置是1615 (參照编码无信号肽的成熟BChE蛋白质的mRNA序列)。如在下面实施例中所述，在独立评价的BChE基因中五个改变的每ー个与DLB之间没有发现特异的相关性；但是令人惊奇地是，这些改变相组合提供对于DLB的特异性信息。因此，本发明的ー个方面提供用于诊断DLB的体外方法，包括在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因中下列改变的基因型，或者与所述改变连锁不平衡的多态性的基因型位置68974处的多态性位点和位置4780至4786处的多聚胸腺嘧 啶区。
在特定的实施方案中，该方法还包括确定BChE基因中下列改变的基因型，或者与所述改变连锁不平衡的多态性的基因型位置3687、4206和4443处的多态性位点。如在下面实施例中所示，分析了 AD(n = 26)、纯DLB(n = 12)、普通DLB(n = 24)和对照(n = 23)的死后样本，以及从223例AD和160例对照受试者得到的临床诊断样本。作为结果，描述了三种类型的遗传标记。首先，在两个多态性位点上的特异性变化同时出现的特征在于，存在在位置4780至4786具有I个胸腺嘧啶的ー个等位基因，并且在位置68974，对于ー个等位基因存在鸟嘌呤，而对于另一等位基因存在腺嘌呤。这种同时出现是鉴别诊断DLB与AD的特异性标记。大约50%的可能误诊的DLB患者通过使用该标记将得到挽救。本发明的另ー实施方案涉及第ニ种遗传标记，其是基因型组合AAAGCC8+K+。其由位置3687 (两个等位基因在该位置均包含腺嘌呤)>4206 ( ー个等位基因包含腺嘌呤并且另ー个等位基因包含鸟嘌呤)、4443 (两个等位基因均包含胞嘧啶)、4780至4786 (两个等位基因的至少ー个由8个胸腺嘧啶构成)和68974(两个等位基因的至少ー个包含腺嘌呤)上多态性位点的特异性基因型构成。在痴呆患者中该基因型组合的确定用作鉴别诊断标记，提供对DLB的临床诊断，但是其还可用作无症状个体中DLB的早期诊断标记。本发明的另ー实施方案涉及第三种遗传标记，其是基因型组合AAAAC+77KW。其由位置3687 (两个等位基因在该位置均包含腺嘌呤)>4206 (两个等位基因在该位置均包含腺嘌呤)、4443(两个等位基因的至少ー个在该位置包含胞嘧啶)、4780至4786(两个等位基因均由7个胸腺嘧啶构成)和68974( —个等位基因包含腺嘌呤并且另ー个等位基因包含鸟嘌呤)上多态性位点的特异性基因型构成。痴呆患者中该基因型组合的确定用作鉴别诊断标记，提供对DLB的临床诊断，但是其还可用作无症状个体中DLB的早期诊断标记。有利地，在DLB的巨大异质性内井根据实施例，本发明的方法使得可以鉴别性检测45-60%的DLB病例，否则这些病例将被诊断为AD。在临床实践中难于诊断的这些百分比的患者将会从疾病一开始就接受正确的诊断。对于该疾病的特异性是99%。这代表着用于DLB的第一种特异性标记。直到现在，在现有技术中可利用的工具不能在临床实践中特异性鉴别DLB。这样，当受试者被诊断为AD时，他会接受精神安定药治疗，这是对于AD中精神病症状最恰当的治疗，但是超过50 %的DLB患者对该种治疗表现出不良反应,在许多病例中导致死亡。本发明方法之所以重要，是因为其能够使医学界对患有DLB的患者应用恰当的治疗，而无不正确治疗的危险。因此，应用本发明的方法，DLB的诊断特异性增加以及由使用神经安定药治疗的副作用引起的死亡将会降低。此外，由于本发明的方法使得特异性诊断患有DLB的患者，所以在临床试验中包含状况明确的的患者群体是可能的。医学中的“诊断”意思是指通过其外在的征兆、症状和潜在的生理学/生物化学原因(ー种或多种)识别疾病或病症的行为或过程。从本说明书的意义上说，BChE基因中的“改变”意思是指在被认为是野生型的核苷酸序列中的任何结构变化。改变的实例可以包括单核苷酸多态性，一个或多个核苷酸的缺失、插入、置換或重复，以及核苷酸上的化学修饰(例如甲基化)。在本说明书中“确定基因型”意思是指鉴定给定位置处的核苷酸。 在本说明书中，“ー个等位基因中的给定核苷酸”意思是指对于该基因中的该核苷酸而言受试者是杂合子，“在两个等位基因中”意思是指对于该核苷酸而言其是纯合子。根据本发明，所述方法包括确定BChE基因上的所指出的改变，并且还确定与所述改变连锁不平衡的多态性，这将给出相同信息。在群体遗传学中，连锁不平衡是不必然位于同一染色体上的两个或更多个基因座上等位基因的非随机关联。按照本发明的诊断方法，DLB分析如下怀疑发生痴呆和/或具有非确定性临床家族性评价的患者将通过确定上述BChE基因的改变的遗传测试进行诊断。在检测DLB特异性基因型的情况下，不需要额外的测试或试验来正确诊断DLB。基因分型的直接应用意味着在日常临床实践中大量节省金钱。本发明方法用于下列的疑似诊断很可能为AD对可能为DLB ;可能为AD对很可能为DLB ;可能为AD对可能为DLB ;很可能为AD对很可能为DLB ;很可能为AD对可能为AD ；可能为DLB ;和很可能为DLB。医生诊断可能的AD是基于覆盖个人和家族医学史的完整患者会面，结合所开展的任何神经病学、精神病学和实验室检验結果。当患者抱怨记忆力減退的逐渐进展，并且当医生找不到可以解释记忆カ丧失的任何其他情况时，医生可能认为是AD0医生将寻找例如抑郁或者甲状腺功能低下的病症、中风引起的神经病学损伤、或可促进记忆カ丧失的任何药物治疗。无法揭不任何促成的疾病使得确定有可能是AD。很可能为AD是晚于可能为阿尔茨海默病的下一歩，并且这意味着医生“相对确定”患者具有该疾病。有利地，本发明方法允许诊断DLB，而不需要通过创伤性方法得到样本，所述创伤性方法如活检；并且在该种情况下为脑组织显微活检。作为遗传检验，本发明方法在从受试者移出的任何生物学样本如血液上实施，原因在于其适用于身体的任何细胞类型。在另ー个实施方案中，确定基因型通过选自由以下各项组成的群组的技术之ー实施引物特异性多重PCR然后检测、多重等位基因特异性引物延伸、基于微列阵的方法、和动态等位基因特异性杂交。在特定的实施方案中，其通过引物特异性多重PCR然后检测来实施。聚合酶链式反应(PCR)是用于体外扩增核酸的最广泛使用的方法。PCR可以是实时PCR，其中通过标记探针检测靶基因型的存在与扩增几乎是同时的。靶多态性的扩增可以通过引物特异性多重PCR进行，并且随后通过聚丙烯酰胺电泳检测或者通过遗传分析仪分析。备选地，可以开展不同的PCR反应，之后进行琼脂糖凝胶电泳或者测序。可通过等位基因特异性引物延伸(ASPE)开展基因型的測定。这是序列特异性酶促反应技术，可以用于在单管中測定多重SNPs。ASPE方法包括两个阶段，酶促反应确定靶基因型，之后捕获在固体微球表面上用于检測。该技术利用液相动力学，允许序列标记微球用于检测新模板。这借助于正确捕获与等位基因特异性寡核苷酸相连的序列实现。任选地，检测可以通过下列进行由通过任何机制沉积的寡核苷酸制成的DNA生物芯片/微列阵、由通过照相平板印刷术或任何其他机制原位合成的寡核苷酸制成的DNA生物芯片。允许在总的人基因组DNA中进行多重SNP基因分型而无需靶扩增或复杂性降低的基于微列阵的方法也可以用于BChE改变的基因分型。该直接的SNP基因分型方法学不需要酶并且依赖于金纳米微粒探针的高灵敏度。特异性来源于依靠等位基因特异性的表面固定化捕获探针和基因特异性的寡核苷酸功能化金纳米微粒探针的两次相继的寡核苷酸杂交至靶标。测定模式是简单的、快速的且强大的，意味着其适合于在“医护点(point ofcare)”进行多重SNP分析。
此外，基因型的确定可以通过动态等位基因特异性杂交(DASH)开展，动态等位基因特异性杂交在一些实验室中代表通量SNP基因分型的基础。DASH的核心反应原理是在DNA变性过程中实时(动态)跟踪等位基因特异性差异。为了达到该目的，寡核苷酸探针首先与靶DNA杂交，这是基本上所有基因分型方法必需的组成部分。靶DNA包含固定在固体表面上的PCR产物的一个链，并且使用与靶等位基因之一互补的单一探针。该测定构思显示非常精确(> 99. 9%准确性)。在第二个方面中，本发明提供用于开展如上所定义方法的试剂盒，包含用于确定BChE基因改变的基因型的适当手段。在特定的实施方案中，试剂盒包含用于通过引物特异性多重PCR实施扩增的适当手段。本发明提供的试剂盒可以在常规临床实践中用于鉴别患有DLB的患者，由此将所述患者与患有AD的其他患者区别开来。使用本发明的试剂盒，临床医生将能够对患有DLB的患者应用更加个体化的且风险适当的治疗策略。在另ー个方面中，本发明涉及如上所定义的试剂盒用作诊断DLB的用途。本发明还涉及位置68974处的多态性位点与BChE基因中一个或多个改变相组合用作诊断路易体痴呆的标记的用途，所述ー个或多个改变选自位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区、位置3687处的多态性位点、位置4206处的多态性位点、和位置4443处的多态性位点。在特定的实施方案中，位置68974处的多态性位点与位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区组合使用。在另ー个实施方案中，位置68974处的多态性位点与位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区，以及与位置3687、4206和4443处的多态性位点组合使用。本发明还涉及通过分析BChE基因中上述改变的基因型，确定受试者是否会对使用精神安定药的治疗有响应的方法。由于该方法可以确定患者是否患有DLB或者AD，所以提供合适的治疗是可能的。在整个说明书和权利要求书中，词语“包含/包括(comprise) ”和该词语的改变形式，例如“包含/包括(comprising) ”,不g在排除其他技术特征、添加物(additive)、成分或步骤。通过研究本说明书，本发明其他的目标、优势和特征对本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过本发明的实践而获知。此外，本发明涵盖本文所述特定和优选实施方案的所有可能的组合。下列实施例和附图以解释说明的方式提供，并且不旨在限制本发明。


图I显示针对四个组得到的对比。圆圈指示四维图内的不同基因型组合的位置。星号显示疾病组和对照组的一致的、基因型组合依赖性位置。它们的位置清楚地显示在cDLB和对照之间、AD和对照之间，还在AD和cDLB之间存在显著的差异。虽然对照组位于两个维度的负象限内，cLBD位于第一维度正象限和第二维度负象限内并且AD位于第一和第二维度正象限内。这些结果强有力地表明，对于BChE遗传学而言三个组存在显著差异。这意味着疾病特异性基因型组合可代表有用的疾病标记。图2显示三个基因型组合依赖性DLB组的额皮质内的相对BChE表达水平(I)基 n = 12。这些结果表示为通过A ACt方法得到的与剩余DLB患者相比的相对表达变化,而在剰余的DLB患者中BChE表达假设为I。误差线表示方差估计。*低于參照组I. 5和2倍之间的显著性表达变化，**低于參照组超过2倍。携帯两种DLB特异性BChE基因型组合(AAAGCC8+K+或者AAAAC+77WW)之一的所有DLB患者，表现出比剩余DLB患者低的BChE表达水平。这种降低的表达与对照脑中的BChE表达水平相似，该事实表明携带AAAGCC8+K+或AAAAC+77WW的DLB患者对通常使用的应用胆碱酯酶抑制剂的治疗不响应。此外，这ー发现代表着这些DLB患者的特异性特征，定义DLB的分子亚组。
实施例死后样本根据当地伦理委员会制定的规则，具有临床和神经病理诊断的死后额皮质样本由巴塞罗那大学神经病学组织库(the University of Barcelona NeurologicalTissue Bank)和 Bellvitge 神经病理学脑库研究所(the Bellvitge Institute ofNeuropathology Brain Bank,BrainNet Europe)促成。它们对应于24个具有普通路易体疾病(cLBD)的脑(死亡年龄79. 9，年龄范围从64至90;女性男性比I. 5 I)，12个具有纯路易体痴呆(PDLB)的脑(死亡年龄74. 4，年龄范围从60至80 ;女性男性比I : 2)，26个AD脑(死亡年龄78. 1，年龄范围从61至95 ;女性男性比I : I. I)和23个对照脑(死亡年龄68. 5，年龄范围从54至83 ;女性男性比I : 1.1)。神经病理学检查显不，所有AD脑呈现AD Braak和Braak VI期。Braak和Braak是用于评价/定量脑内AD的分期。它被神经病理学家用于评价淀粉状蛋白斑和神经原纤维缠结的密度。根据Braak和Braak的AD分期，I-VI :神经原纤维缠结；A_C :淀粉状蛋白斑。两个cLBD样本相当于Braak和Braak III期,三个相当于Braak和Braak IV期并且19个剩余的样本相当于V和VI期。在pDLB脑中，检测到Braak和Braak 0至II期,并且在对照样本中无AD相关变化。虽然AD和对照脑均未显示相关病理学，但是按照Braak-Braak分类法，所有PDLB样本以及cLBD样本呈现出对应于相关变化的5和6期。临床诊断的样本
血液样本获得自在我们的Germans Trias i Pujol医院的神经科，按照NINCDS-ADRDA和DSM-IV标准诊断的223名AD患者(年龄71.1 ;年龄范围从49至86岁；女性男性比率I : I. 6)。此外，还有59名年龄匹配对照受试者(年龄68. 8 ;年龄范围从46至91岁；女性男性比I 1.5)。在另外的实验中，对160名年龄匹配对照受试者(年龄68. 8 ;年龄范围从46至91岁;女性男性比I 1.5)进行取样。在医院伦理委员会授权并得到签名的知情同意书之后开展研究。DNA 提取使用TRI试剂按照制造商的说明书从冰冻脑样本提取DNA。TRI试剂溶液混合苯酚和异硫氰酸胍于单项溶液中，并且其用于从同一样本相继提取RNA、DNA和蛋白质。在通过分光光度法测定纯度和浓度之后，将DNA样本储存于4°C下直至使用。通过基于玻璃滤膜上DNA结合的标准方法开展从血液提取DNA。BChE启动子测序·由于BChE启动子序列由大约5000bp构成，所以扩增三个重叠的PCR片段用于序列分析。PCRl (引物BChEpromlUA和BChEpromlL ;表I)获得跨越位置-1869至位置-1031的838bp片段。在PCR2中(引物BChEprom2UA和BChEpromS6 ;表I)获得跨越位置-1152至-315的837bp片段，并且在PCR3中(引物BChEprom2UB和BChEprom2L ;表I)获得到跨越位置-473至位置+231的688bp片段。具有15 U I终体积的PCR反应包含I. 7mM MgCl2,200 u M姆种dNTP (Ecogen), 2pmoI姆种引物，I单位EcoTaq DNA聚合酶(Ecogen)和大约300ng DNA。建立标准PCR程序，对于PCRl退火温度为58°C，对于PCR 2和3为60°C，对于PCRl为30个循环并且对于PCR 2和3为35个循环。
表丨用于BChE启动子测序的引物
引物名称引物序列(5，今3，)SEQID NO
BChEproml UA TGATAGGCTGACCGTATGCT — SEQID NO: 2 —BChEpromlL _ ACCTCATCAGATGAGAAAGC SEQ ID NO: 3 BChEprorn2UA TCTCTTGGAAGCAGTTGACAT — SEQ ID NO: 4 _ BChEpromS6 CCATTATAGCTTCAATCTGTGC SEQ ID NO: 5 BChEprom2UB AGATACATATCAGAGACATCCATT SEQ ID NO: 6 BChEprom2L GAAGAGATCACTCTCATCCC SEQ ID NO: 7PCR产物通过使用ExoSap-IT试剂盒(GE Healthcare)纯化。使用BigDye (BigDyeTM 終止子 vs I. I 循环测序试剂盒，Perkin Elmer)，I Opmo I / ii I 各自引物和3. 5 ill纯化的PCR产物实施测序反应。在循环测序和DNA沉淀之后，在ABIPRISMTM3100 (Perkin Elmer)上得到序列。BChE启动子多杰件分析在BChE基因的启动子区发现4个新多态性。使用突变特异性PCR(MS-PCR)研究了它们当中三个以及众所周知的K变体多态性A3687G、A4206G、C4443T和BChE_K。每ーPCR反应具有15u I终体积，包含I. 7mM MgCl2, 200 y M每种dNTP (Ecogen)，2pmo I三种引物中的姆一种(表2), I单位EcoTaq DNA聚合酶(Ecogen)和300ng的DNA。实施标准PCR程序，35个循环，在A3687G、BChE-K扩增中退火温度为62°C，在A4206G、C4443T扩增中退火温度为57°C。所得到的PCR片段在高分辨率琼脂糖凝胶上分离。BChE A3687G多态性的A等位基因表现为153bp片段，并且G等位基因表现为133bp片段。K等位基因表现为149bp片段并且来自K变体多态性的野生型相应等位基因表现为169bp条带。BChE A4206G多态性的A等位基因长度为124bp并且G等位基因为104bp。最后，在C4443T多态性的情况下，T等位基因对应于145bp片段并且C等位基因对应于125bp片段。基于仅ー个核苷酸差别的不同片段大小构成多聚T(polyT)多态性。其基因分型通过毛细管电泳应用荧光染料标记引物(表2)在ABI PRISM 3100 (Perkin Elmer)上实现。在标准条件下使用30个循环的程序开展PCR。7T等位基因生成196bp，197bp片段代表8T等位基因。
权利要求
1.用于诊断路易体痴呆的体外方法，包括在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因中下列改变的基因型，或者与所述改变连锁不平衡的多态性的基因型 NCBI登录号NG_009031中位置68974(即SEQ ID NO 28中的位置934)处的多态性位点；和 NCBI 登录号 NG_009031 中位置 4780 至 4786 ( S卩 SEQ ID NO 1 中的位置 4780-4786)处的多聚胸腺嘧啶区。
2.根据权利要求I的方法，其包括确定下列基因型 NCBI登录号NG_009031中位置68974(即SEQ ID NO 28中的位置934)处的多态性位点；和 NCBI 登录号 NG_009031 中位置 4780 至 4786(即 SEQ ID NO 1 中位置 4780-4786)处的多聚胸腺嘧啶区。
3.根据权利要求1-2任ー项的方法，其还包括确定BChE基因中下列改变的基因型，或者与所述改变连锁不平衡的多态性的基因型 位置3687处的多态性位点， 位置4206处的多态性位点，和 位置4443处的多态性位点，所述位置參照NCBI登录号NG_009031 (即分别为SEQ IDNO 1 的位置 3687、4206 和 4443)。
4.根据权利要求3的方法，其包括确定下列基因型 位置3687处的多态性位点， 位置4206处的多态性位点，和 位置4443处的多态性位点，所述位置參照NCBI登录号NG_009031 (即分别为SEQ IDNO 1 的位置 3687、4206 和 4443)。
5.根据权利要求1-2任ー项的方法，其中基因型是 对于两个等位基因，位置4780至4786处的7个胸腺嘧啶；和 位置68974处，对于ー个等位基因是鸟嘌呤并且对于另ー个等位基因是腺嘌呤； 该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区別。
6.根据权利要求3-4任ー项的方法，其中基因型是 对于ー个等位基因，位置68974处是腺嘌呤； 对于ー个等位基因，位置4780至4786处是8个胸腺嘧啶； 对于两个等位基因，位置3687处均是腺嘌呤； 位置4206处，对于ー个等位基因是腺嘌呤并且对于另ー个等位基因是鸟嘌呤；和 位置4443处，对于两个等位基因均是胞嘧啶； 该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区別。
7.根据权利要求3-4任ー项的方法，其中基因型是 位置68974处，对于ー个等位基因是腺嘌呤并且对于另ー个等位基因是鸟嘌呤； 对于两个等位基因，位置4780至4786处均是七个胸腺嘧啶； 对于两个等位基因，位置3687处均是腺嘌呤； 对于两个等位基因，位置4206处均是腺嘌呤；和 位置4443处，对于ー个等位基因是胞嘧啶；该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区別。
8.根据权利要求1-7任ー项的方法，其中基因型的确定通过选自由以下各项组成的群组的技术之ー完成引物特异性多重PCR然后检测、多重等位基因特异性引物延伸、基于微列阵的方法和动态等位基因特异性杂交。
9.根据权利要求8的方法，其中所述确定是通过引物特异性多重PCR扩增然后检测来完成的。
10.根据权利要求1-9任ー项的方法，其中所述生物学样本是血液样本。
11.用于实施权利要求1-10任一项所述方法的试剂盒，其包含用于确定BChE基因改变的基因型的适当手段。
12.根据权利要求11的试剂盒，其包含用于实施引物特异性多重PCR的适当手段。
13.权利要求10-12任一项所定义的试剂盒用于诊断路易体痴呆的用途。
14.NCBI登录号NG_009031中位置68974(即SEQ ID NO 28中位置934)处的多态性位点，与BChE基因中的ー个或多个改变的组合作为用于诊断路易体痴呆的标记的用途，所述ー个或多个改变选自位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区、位置3687处的多态性位点、位置4206处的多态性位点和位置4443处的多态性位点，所述位置參照NCBI登录号NG_009031 (即分别是 SEQ ID NO 1 中的位置 3687、4206、4443 和 4780-4786)。
15.根据权利要求14的用途，其中位置68974处的多态性位点与位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区组合使用。
16.根据权利要求14的用途，其中位置68974处的多态性位点与位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区、位置3687处的多态性位点、位置4206处的多态性位点和位置4443处的多态性位点组合使用。
全文摘要
已经发现了BChE基因中的特异性改变，这种特异性改变允许确定患者是否患有路易体痴呆(DLB)，并且使得可以将其与阿尔茨海默病区别开来。本发明提供了用于诊断DLB的体外方法，包括在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因的下列改变的基因型NCBI登录号NG_009031位置68974处的多态性位点(即SEQ ID NO28中的位置934)，和多态性位点3687、4206、4443、以及位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区，所述位置参照对应于人BChE基因核苷酸序列的NCBI登录号NG_009031(即分别为SEQ ID NO1中的位置3687、4206和4443)。
文档编号C12Q1/68GK102869786SQ201180011143
公开日2013年1月9日 申请日期2011年2月24日 优先权日2010年2月24日
发明者K·拜尔, M·多明戈萨巴特, A·阿利茨费尔南德斯 申请人:巴塞罗那自治大学, 日耳曼人特里亚斯艾普霍尔健康科学研究院基金会