专利名称：蛋白激酶Mnk2a的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白激酶Mnk2a的新用途。
发明背景帕金森氏病(Parkinson's disease,PD)是中枢神经系统常见的神经退行性变性疾病， 其发病率在神经变性疾病中居第二，仅次于Alzheimer病(老年痴呆症)。PD患者的主要病理改变为中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元变性坏死和病人脑内Lew小体(Lewy ’s body, LB)的形成。但是，导致多巴胺能细胞选择性凋亡和路易小体形成的机制尚不清楚。
一般认为α -synuclein过表达或突变会引起α -synuclein聚集从而产生细胞毒性，导致多巴胺能神经元的选择性凋亡，而这种α-synuclein聚集物正是黑质中的路易小体(LB)的主要成分，但是什么机制引发了 α-synuclein聚集形成了有毒性的物质，目前研究尚不清楚。已有的研究显示α-synuclein的磷酸化在这个聚集过程中具有很重要的作用。尤其是第1 位丝氨酸的磷酸化，它是唯一广泛分布于帕金森病患者大脑中的位点，这暗示着α-synuclein 1 位丝氨酸的磷酸化在PD发病过程中起着一定的作用。
如今，已发现的可以磷酸化α -synuclein丝氨酸第1 位的激酶有酪蛋白激酶 (CKl和CK2)以及G蛋白偶联受体激酶家族(GRK2，GRK3, GRK5和GRK6)等，涉及到PD发病过程的机制有泛素-蛋白酶体系统，线粒体功能障碍和氧化应激等，然而对于导致PD发病的相关基因和分子机制仍没有很全面的论述。发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白激酶Mnl^a在制备治疗帕金森氏病药物中的应用。
本发明主要包括构建细胞表达质粒载体pcDNA3. 1_ α -synuclein, pcDNA3. 1-α -synuclein_S129A 以及 pcDNA3. 1-Mnk2a_myc ；western 检测 α -synuclein 蛋白表达水平和其1 位丝氨酸磷酸化的水平；免疫细胞荧光的手段检测MriMa对 α -synucleinl29丝氨酸的磷酸化在SH-5Y-5Y细胞内表现出来的生理学变化。
果蝇蛋白激酶LK6可以通过ERK信号通路调节α-synuclein 1 位丝氨酸的磷酸化，本发明们克隆了 LK6的人源同源基因Mnk^i即MAI3K相互作用的激酶-2的一个可变剪接体。通过western手段鉴定出MnMa可以通过ERK信号通路调节α-Synucleinl29 位丝氨酸的磷酸化，于此同时，通过细胞免疫荧光的手段检测到在人神经母细胞瘤细胞 (SH-5Y-5Y)核内，Mnk^i会加剧类似于路易士小体的α -synuclein颗粒状聚集物的形成。 这为全面研究PD的发病病因提供了进一步的依据和作用机制。
图1为HEK293T细胞内α -synuclein的表达水平和磷酸化的情况图2为Mnk^^i α -synucleinU9位丝氨酸磷酸化水平的鉴定。其中A为Western-blot 结果，蛋白总量一致，α-synuclein作为内参；B为α-synuclein第1 位丝氨酸磷酸化的变化的统计图(p<0. 05)。
图3为MnMa对α -Synucleinl29位丝氨酸磷酸化的作用导致SH-5Y-5Y细胞内 α-synuclein颗粒状聚集物的形成.(A)细胞免疫荧光图。(B)过表达a-synuclein以及Mnk2a与α-synuclein，细胞核内小颗粒数目变化统计图(**P<0. 001 ；*P<0. 01)。
图4为MnMa通过ERK信号通路磷酸化α -synuclein的129位丝氨酸。其中A 为Western-blot结果，蛋白总量一致，α-synuclein作为内参；B为α-synuclein第129 位丝氨酸磷酸化的变化的统计图(P<0. 05)。
具体实施方式
实施例一检测MnMa对α -Synucleinl29位丝氨酸磷酸化的效果1. ^ ii i(； # pcDNA3. 1-α-synuclein, pcDNA3. 1-α-Synuclein-S129A ( α -synucleinl29位的丝氨酸突变为丙氨酸)以及pcDNA3. 1-Mnk2a_myc的构建用特定引物做PCR分别从表达人源α -synuclein的果蝇中克隆出α -synuclein以及α -synuclein-S129A基因，从HEK293T细胞内克隆出MnMa基因，然后分别构建到 pcDNA3. 1与pcDNA3. 1-myc空载中，送出去测序，将测序结果与目的基因序列进行比较，证实构建的载体成功。
用于克隆Mnk2a目的基因的上游引物序列为5’ -cccaagcttaccatgcccgccagccag cccattg -3'下游弓丨物序列为5' -ccgctcgagtcaggcgtggtctcccaccag-3， Mnk2a目的基因的全长序列为atgcccgccagccagcccattgacatcccggacgccaagaagaggggcaagaagaagaagcgcggccgggcc accgacagcttctcgggcaggtttgaagacgtctaccagctgcaggaagatgtgctgggggagggcgctcatgcccg agtgcagacctgcatcaacctgatcaccagccaggagtacgccgtcaagatcattgagaagcagccaggccacattc ggagcagggttttcagggaggtggagatgctgtaccagtgccagggacacaggaacgtcctagagctgattgagttc ttcgaggaggaggaccgcttctacctggtgtttgagaagatgcggggaggctccatcctgagccacatccacaagcg ccggcacttcaacgagctggaggccagcgtggtggtgcaggacgtggccagcgccttggactttctgcataacaaag gcatcgcccacagggacctaaagccggaaaacatcctctgtgagcaccccaaccaggtctcccccgtgaagatctgt gacttcgacctgggcagcggcatcaaactcaacggggactgetcccctatctccaccccggagctgctcactccgtg cggctcggcggagtacatggccccggaggtagtggaggccttcagcgaggaggctagcatctacgacaagcgctgcg acctgtggagcctgggcgtcatcttgtatatcctactcagcggctacccgcccttcgtgggccgctgtggcagcgac tgcggctgggaccgcggcgaggcctgccctgcctgccagaacatgctgtttgagagcatccaggagggcaagtacga gttccccgacaaggactgggcccacatctcctgcgctgccaaagacctcatctccaagctgctggtccgtgacgcca agcagaggctgagtgccgcccaagtcctgcagcacccctgggttcaggggtgcgccccggagaacaccttgcccact cccatggtcctgcagaggaacagctgtgccaaagacctcacgtccttcgcggctgaggccattgccatgaaccggca gctggcccagcacgacgaggacctggctgaggaggaggccgcggggcagggccagcccgtcctggtccgagctacct cacgctgcctgcagctgtctccaccctcccagtccaagctggcgcagcggcggcaaagggccagtctgtcctcggcc ccagtggtcctggtgggagaccacgcctga表达载体使用的是空载pcDNA3. 1-myc，双酶切位点分别是Hind III，Β ο I。
2.转染构建好的表达载体进入HEK293T细胞将构建好的表达载体转染到HEK293T细胞内，培养48小时后，抽蛋白做western分析。具体步骤为a).比较不做任何处理的HEK293T细胞和单独转染α -synuclein的细胞 α -synuclein蛋白的表达量以及其1 位丝氨酸磷酸化的改变。实验结果表明HEK293T细胞内α-synuclein蛋白的表达量较低检测不到，并且HEK293T细胞内本身存在着可以磷酸化a-SynucleinU9位丝氨酸的激酶。结果见图1。
b).比较共转染表达载体a -synuclein与Mnk2a以及单独转染表达载体 a-synuclein的细胞蛋白在a-synucleinU9位的磷酸化情况。结果显示共转染MnMa和 α -synuclein后，Mnk2a使α -synuclein的1 位丝氨酸的磷酸化水平提高了 1. 41倍。 实验结果表明Mnk^i可以使α -Synucleinl29位丝氨酸磷酸化。结果见图2。
3. 细胞免疫荧光检测用α -synuclein的抗体检测细胞内α -synuclein的表达量以及分布情况，其荧光标记物为FITC绿色荧光蛋白。转染的细胞为人神经母细胞瘤细胞(SH-5Y-5Y)，共转染表达载体α-synuclein与Mnk2a明显比单独转染表达载体α-synuclein在细胞核内形成的α-synuclein颗粒的数量多，而共转染表达载体 α -synuClein-S129A与Mnk^i并没有在细胞核内出现类似的颗粒状聚集物。实验结果表明 Mnk2a促进了 α -Synucleinl29位的磷酸化以及这种磷酸化作用会加剧类似于路易士小体的α-synuclein颗粒状聚集物的形成。结果见图3。
实施例二 检测ERK信号通路参与调节MnMa对α -Synucleinl29位的磷酸化作用使用ERK信号通路的激活剂PMA和抑制剂PD98059分别对共转染了表达载体 α -synuclein与Mnk2a的细胞进行处理，然后抽提细胞蛋白，用于western手段分析。使用了 PMA处理的细胞α -synuclein第1 位丝氨酸磷酸化的水平提高了 1. 65倍，使用了 PD98059处理的细胞α -synuclein第1 位丝氨酸磷酸化的水平降低了 0. 80倍，而PMA的激活作用可以被PD98059处理后显著的降低。实验结果表明，MriMa可能是通过ERK信号通路来调节α-synuclein第1 位丝氨酸的磷酸化。结果参见图4。
权利要求
1. 一种蛋白激酶MriMa在制备治疗帕金森氏病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白激酶Mnk2a的新用途，本发明通过western手段鉴定出Mnk2a可以通过ERK信号通路调节α-synuclein129位丝氨酸的磷酸化，于此同时，通过细胞免疫荧光的手段检测到在人神经母细胞瘤细胞(SH-5Y-5Y)核内，Mnk2a会加剧类似于路易士小体的α-synuclein颗粒状聚集物的形成。这为全面研究PD的发病病因提供了进一步的依据和作用机制。
文档编号A61P25/16GK102526713SQ20121000810
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月12日 优先权日2011年5月18日
发明者夏莹, 文铁桥 申请人:上海大学