筛选核酸配体的方法

专利名称：筛选核酸配体的方法
筛选核酸配体的方法
技术领域：
本发明涉及筛选核酸配体的方法，且尤其涉及筛选对靶物质具有亲和性且与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体的方法。
背景技术：
适体是指与靶物质特异性结合的核酸配体。在1990年，Gold等人首先建议其基本概念。已知通过使用利用对靶物质的结合亲和力作为指标的称之为SELEX方法的方法选择及获得适体的方法。短语〃通过指数富集的配体的系统性进化(the Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment) 〃缩写为〃SELEX〃。直到现在，已公开广泛的分子作为适体的靶物质。报道的靶物质的例包括，例如，各种蛋白，酶，肽，抗体，受体，激素，氨基酸，抗生素和其他各种化合物。利用对靶物质的结合亲和力作为指标的SELEX方法已常改善对靶物质的亲和性和特异性，由此实现各种特定目的。此外，对于利用与靶物质结合后的结构变化作为指标的方法，美国专利申请No. 07/960, 093公开了，通过使用SELEX和凝胶电泳的组合选择具有特定结构性质的核酸(例如，弯曲的DNA)。而且，已知使用结构-切换信号传导适体中的适体的体外选择，由此旨在获得利用与靶物质结合后的结构变化的传感器的适体。作为利用经历与靶物质结合后的结构变化的核酸配体的传感器，使用，例如，荧光报告子的方法发现是特别有用的。关于以上使用荧光报告子的方法，已开发各种方法。报道的方法的例包括基于适体的单生色团报告子方法，适体信标(基于适体的双生色团报告子方法),解毒物(DNA/DNA双链体至DNA/靶复合物结构-切换方法，QDNA),原位标记方法，嵌合适体方法，及荧光染色方法。与靶物质结合后核酸配体的结构变化提供影响传感器的SNR (信号-噪音比)或检测限的重要功能。强烈期望的是开发精确地调控结构变化的技术和获得结合靶物质导致结构变化的配体的简单，系统性和稳健的技术。引用文献专利文献PTL I :美国专利申请 No. 07/960，09非专利文献NPL I Nucleic Acids Research, 2000, vol. 28, No. 9, 1963-1968
发明内容一般而言，获得核酸配体的方法，以SELEX方法为代表，旨在通过利用对靶物质的结合亲和力作为指标从核酸候选配体库选择对靶物质具有更高亲和性的核酸配体。以上公开于美国专利申请No. 07/960, 093的方法提供利用从与靶物质结合后的结构变化得到的物理性质变化的选择。此方法可有效获得作为全核酸配体-靶物质复合分子的经历结构变化的核酸配体。但是，无法指明核酸序列的哪个部分经历与靶物质结合后的结构变化和/或哪个部分形成二级结构。该方法不利用与靶物质结合后特定特异性预设计的核酸序列之间的双链体形成作为结构变化的指标。在结构-切换信号传导适体的适体的体外选择中，通过利用对靶物质的结合亲和力和与靶物质结合后的结构变化的能力二者作为指标开发了在DNA/DNA双链体至DNA/靶复合物结构-切换方法(基于适体的双生色团报告子方法)中使用的传感器，通过选择能经历结构变化的适体获得的传感器。此方法预先加工多个结构域作为核酸候选配体库的保守的序列结构域。但是，各保守的序列结构域不提供互补序列，且不具有在保守的序列结构域之间形成分子内双链体的功能。此外，保守的序列结构域包括多个引物结合结构域(PBD)和中心-固定的序列基序。相比使用共同序列的稳健的和系统性(合理的)方法，在DNA/DNA双链体至DNA/靶复合物结构-切换方法中使用的此适体传感器是获得具有结构变化的能力而保持对靶物质的亲和性的标记的适体分子的方法。特别是，2种标记的-寡DNA (FDNA, QDNA)分别互补于中心-固定的序列基序及保守的引物结合结构域之一而形成双链体。接下来，FDNA和QDNA之间的距离在由与靶物质结合所致的结构变化后变化，或所述距离在FDNA解离后变化，然后检测靶物质。但是，此方法在与靶物质结合之后不调控结构变化(双链体形成)。此外，预测到，以上结构变化的程度不保持恒定，也被预测难以通过与靶物质结合调控FDNA的解离。因而，可不精确地调控FDNA和QDNA之间的距离。关于获得用于利用核酸配体中的结构变化的传感器的核酸配体(分子信标适体)序列的方法，通常使用的是如下方法，其包括由SELEX方法获得序列，然后通过再加工序列赋予结构变化的能力。例如，有对具有在与靶物质结合后经历结构变化(双链体形成)的能力的分子信标适体的报道。该方法可不赋予对靶物质的亲和性，由于序列在获得核酸配体后被再加工，以给序列赋予结构变化的能力。或者，注意到，造成依赖于相应序列的再加工的必要。由此，当前情况表明，以上方法不可认为是稳健的方法，因为需要对于获得的各核酸配体重复优化加工。此外，有通过作为解毒剂添加互补于由SELEX方法获得的核酸配体序列的序列来调控结构变化的感觉方法。但是，对靶物质的亲和性可变化，且个体配体也需要优化加工(例如，序列，序列长度，错配的插入，序列位置)。S卩，尚不存在通过利用核酸配体候选体库对靶物质的结合亲和力和在与靶物质结合后在已设计为保守的序列结构域的多个互补序列之中形成分子内双链体的结构变化的能力二者作为指标就核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法。为解决用以上-提及的常规技术的问题而密集研究的结果，本发明人发现，通过利用对靶物质的结合亲和力和结构变化能力二者作为指标筛选核酸配体的方法。本发明的筛选核酸配体的方法是就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法。所述方法包括下列步骤(a)制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域；(b)在靶物质缺失下使候选配体库接触支持部，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及去除不形成分子间双链体的核酸配体 ’及(C)通过在靶物质存在下使靶物质接触步骤(b)中获得的余下形成分子间双链体的核酸配体来解离分子间双链体，然后分离及收集具有通过与靶物质结合形成、的特定二级结构的核酸配体，其中方法包括至少一次步骤(b)及至少一次步骤(C)。此外，另一本发明的筛选核酸配体的方法是就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法。所述方法包括下列步骤(a’)制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域；(b’ )在靶物质存在下使候选配体库与支持部接触，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及收集不形成分子间双链体的核酸配体 ’及U，)自步骤(b’)中分离的及收集的核酸配体去除靶物质；及((1’)在靶物质缺失下使支持部与步骤(c’)中获得的去除靶物质的核酸配体接触，然后分离及收集在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的核酸配体。发明效果本发明可提供有效和系统性筛选对靶物质具有亲和性及与以上靶物质结合之后在保守的序列结构域中在彼此互补的多个预设计的序列之中形成特定分子内双链体的核酸配体的新方法。形成分子内双链体的保守的序列结构域可用于通过使用另一靶物质以类似方式筛选的情况，从而各种传感器装置可系统性地和容易生产。此外，根据本发明的方法获得的核酸配体可贡献于利用在与靶物质结合反应之后核酸配体的结构变化的各种领域的应用(例如，各种生物传感器，分子开关，诊断剂)。尤其是，以上配体作为标记的适体有效，其中将报告子分子(例如，荧光分子)加工为导入形成分子内双链体的区。例如，在基于适体的双生色团报告子方法中的适体传感器中，在与靶物质结合之后，2种类型的标记的分子之间的距离可精确地调控。而且，标记的适体的特征的例包括随着通过与靶物质结合后形成分子内双链体，与靶物质的复合物的更多稳定性。本发明的进一步特征会从以下例示实施方式的说明参照附图而显而易见。

图I图I是例证作为核酸配体候选体库制备的核酸序列区的示意性模式图。图2A图2A是例证本发明的分离步骤的示意性模式图。图2B图2B是例证本发明的分离步骤的示意性模式图。图2C图2C是例证本发明的分离步骤的示意性模式图。图3A图3A是例证核酸序列的预测的二级结构的分析结果的图。图3B图3B是例证核酸序列的预测的二级结构的分析结果的图。图3C图3C是例证核酸序列的预测的二级结构的分析结果的图。图3D图3D是例证核酸序列的预测的二级结构的分析结果的图。图3E图3E是例证核酸序列的预测的二级结构的分析结果的图。图3F图3F是例证核酸序列的预测的二级结构的分析结果的图。图4图4是例证显示分离步骤之后核酸扩增产物的丰度比的结果的图。实施方式在下文中，使用图，表，式和例来例证本发明的实施方式。此外，需知，这些图，表，式，例和描述仅用于例证，不用于限制本发明的范围。无需多言，另外的实施方式在本发明的范围之内，只要它们遵循本发明的要旨。第I实施方式根据本发明的第I实施方式筛选核酸配体的方法是就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法，所述方法包括下列步骤(a) (C)。特别是，所述方法包括下列步骤Ca)制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域；(b)在靶物质缺失下使候选配体库接触支持部，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持 部的表面，然后通过利用作为接触结果在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及去除不形成分子间双链体的核酸配体 ’及(C)通过在靶物质存在下使靶物质接触形成分子间双链体及在步骤(b)中获得的余下核酸配体来解离分子间双链体，然后分离及收集具有通过与靶物质结合形成的特定二级结构的核酸配体，其中方法包括至少一次步骤(b)及至少一次步骤(c )。或者，步骤(C)包括收集步骤(b)中获得的余下形成分子间双链体的核酸配体，使核酸配体与靶物质混合，并使混合物与支持部接触，然后通过利用不形成分子间双链体的现象分离及收集具有与靶物质结合后形成的特定二级结构的核酸配体。此外，在本发明中包括步骤(b)及步骤(C)的分离步骤可重复多次，并且次数不限制。例如，只要保持靶向的核酸序列群的分子数与未靶向的核酸配体群的分子数的比，或保持能鉴定靶向的核酸配体的分子数的比，从而实现筛选，则不限制次数。描述图的编号。参照数字I表示用于PCR的(正向)引物序列。参照数字2表示茎-形成区(互补于参照数字4)。参照数字3表示随机序列结构域。参照数字4表示茎-形成区(互补于参照数字2)。参照数字5表示用于PCR的(反向)引物序列。参照数字6表示基材。参照数字7表示链霉亲和素。参照数字8表示生物素。参照数字9表示包括茎-形成区的序列区。参照数字10表示靶物质。如图I和2A，2B和2C中例证，本实施方式的核酸配体包括用于结合靶物质10的随机序列结构域3，用于形式特定二级结构的保守的序列结构域2和4。此外，根据本发明的特定二级结构可仅在核酸配体与给定靶物质结合时形成。此外，互补地结合于保守的序列结构域中的至少一个的序列区布置在支持部9表面。使支持部接触在核酸配体候选体库中包括本发明的具有彼此互补的多个前保守的序列区(保守的序列结构域)的靶向的核酸配体的核酸配体候选体库。在此实施方式中，具有旨在的功能的核酸配体可通过利用候选配体库中保守的序列结构域之中形成分子内互补双链体的能力和与布置在支持部上的互补序列结构域形成分子间互补双链体的能力之间的差异来筛选。由于相比在分子间在分子内更容易形成互补双链体，当在靶物质缺失下(即，平衡偏倚)使候选配体库接触支持部时，在保守的序列结构域之中容易形成分子内互补双链体。特别是，相比与布置在支持部的表面上的互补序列结构域的分子间双链体的形成，分子内双链体形成的可能性高。通过使用此现象，可分离及去除在保守的序列结构域之中具有分子内双链体的核酸配体(未靶向的核酸配体)(图2A)。本发明的靶向的核酸配体是与布置在支持部的表面上的互补序列结构域形成分子间双链体的核酸(图2B)。通过在靶物质存在下使靶向的核酸配体与靶物质接触及彼此结合来从支持部的表面分离靶向的核酸配体(图2C)。因此，可筛选本发明的结合靶物质的靶向的核酸配体。此外，仅本发明的能形成特定二级结构的核酸配体结合靶物质。由此，仅从支持部分离本发明的形成了与布置在支持部的表面上的互补序列结构域结合的分子间双链体的靶向的核酸配体。此外，本文中的短语"在靶物质存在下"是指在具有游离靶物质的条件或在具有结合到支持部的靶物质的条件中存在。相反，短语"在靶物质缺失下"是指既不在具有游离靶物质的条件存在，也不在具有结合到支持部的靶物质的条件存在。第2实施方式相反，在靶物质存在下进行相同的过程致使在靶向的核酸配体与待分离、富集及收集的靶物质结合后核酸配体在保守的序列结构域之中形成分子内双链体结构。因此，根据本发明的第2实施方式的筛选核酸配体的方法是就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法，所述方法包括下列步骤(a’ ) (d’)。 特别是，所述方法包括下列步骤(a’ )制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域；(b’ )在靶物质存在下使候选配体库与支持部接触，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及收集不形成分子间双链体的核酸配体；(c’ )自步骤(b’)中分离的及收集的核酸配体去除靶物质；及(d’)在靶物质缺失下使支持部与步骤(c’)中获得的去除靶物质的核酸配体接触，然后分离及收集在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的核酸配体。第3 第5实施方式本发明的第3实施方式提供组合常规SELEX方法的筛选。特别是，该实施方式还在步骤(b)或(b’ )之前包括以下步骤使候选配体库与靶物质接触，从而对靶物质具有更高亲和性的核酸配体形成核酸配体-靶物质复合物；去除不形成复合物的核酸配体；自复合物仅分离及收集具有更高亲和性的核酸配体；及扩增具有更高亲和性的核酸配体以产生富集的核酸配体的候选配体库。此外，该实施方式还在步骤(d)或(d’ )之后包括以下步骤使靶物质与形成特定二级结构的去除靶物质的核酸配体接触，步骤(d)或(d’)中获得的核酸配体，从而对靶物质具有更高亲和性的核酸配体形成核酸配体-靶物质复合物；去除不形成复合物的核酸配体；自复合物仅分离及收集具有更高亲和性的核酸配体；及扩增核酸配体以富集具有更高亲和性的核酸配体。本发明的第4实施方式提供鉴定形成特定二级结构的核酸配体的序列的方法，所述配体根据以上3种筛选方法的实施方式获得。此实施方式特别在下列实施例中描述。本发明的第5实施方式提供用于就与靶物质结合后形成特定二级结构由此进行以上相应实施方式的核酸配体筛选核酸配体候选体库的试剂盒。该试剂盒包括核酸配体候选体库，其包括用于形成特定二级结构的保守的序列结构域和随机序列结构域；及支持部，与保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在其表面。以下是在本发明中使用的支持部等的描述。除非另外描述，它们可应用于全部实施方式。支持部/固定作为本实施方式的支持部的材料，可采用用于DNA微阵列和核酸纯化的支持部材料。它们的例包括塑料，无机聚合物，金属，金属氧化物，天然的聚合物，它们的复合材料等。塑料的特定例包括聚乙烯，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚丙烯，聚酰胺，苯酚树脂，环氧树脂，聚碳二亚胺树脂，聚酰亚胺和丙烯酸树脂等。此外，无机聚合物的特定例包括玻璃，石英，碳，硅胶，石墨等。此外，金属和金属氧化物的特定例包括金，钼，银，铜，铁，铝，磁体，铁素体，矾土，氧化硅，顺磁体，磷灰石等。天然的聚合物的例包括聚氨基酸，纤维素，壳多糖，壳聚糖，藻酸酯和其衍生物。本实施方式的支持部的形状不特别限制。固定核酸的官能团可导入支持部的表面材料，但其可不导入。在该情况中，固定可直接通过物理吸附进行。固定核酸(例如，DNA)的常规知道的方法可在本发明中用于各种支持部表面。有随机固定(例如，利用核酸的疏 水性的物理吸附，利用源于主链磷酸酯的负电荷的静电吸附)由于对于支持部/分子的更低结合亲和力而无法保留一定量的固定的可能性。因此，对于低-分子量核酸(寡聚体)的固定，可使用化学键。尤其是，核酸末端可固定于其上。例如，对于核酸直接固定到金的情况，可使用末端硫醇化的核酸。当将羧酸基导入支持部的表面时，与末端胺基化的核酸的脱水和缩合致使固定进行。而且，当链霉亲和素或亲和素固定于支持部的表面时，可使用末端生物素化的核酸。为了辅助核酸候选配体库与固定于支持部的核酸(保守的序列)的反应，可在支持部和保守的序列之间插入接头。接头的插入允许在支持部的固相反应期间待还原的分子的位阻。此外，接头的长度和种类可依赖于反应效率适当选择。而且，为了辅助反应，支持部可加工成微粒。微粒化致使表面积变大，由于更低反应体积，在高浓度条件下的反应和假-液相反应伴随搅拌，这应具有促进效应。此外，可使用微粒，以便简化分离步骤。使用的例包括微粒的离心，用微粒-包装的柱纯化，使用磁体分离和恢复等。作为从结合于支持部的核酸分离游离核酸的技术，可采用常规知道的技术。此外，从游离靶物质纯化结合于核酸的支持部的技术也可以类似方式采用常规知道的技术。核酸配体、核酸配体候选体库、及核酸根据本实施方式的术语〃核酸配体〃是指在化学感觉中具有期望效果的人工核酸。核酸配体常被称为〃适体"。本文所用术语〃适体〃是与〃核酸配体〃具有相同的含义的术语，除非另外特别描述。期望效果的例包括，但不限于，与靶物质结合，催化性地改变靶物质，抑制靶物质的效应，促进靶物质与其他分子的反应等。在一实施方式中，这些效应通过特异于靶物质的亲和性发挥。该靶物质是非结合于核酸配体的核酸的化合物，所述结合由主要依赖于Watson/Crick氏碱基对或三联体结合的机理介导。S卩，一个核酸与另一核酸杂交的那些未包括在本申请中。根据本实施方式的〃核酸配体候选体库〃(在下文中，可称之为〃核酸候选配体库")是具有各种序列的核酸的混合物，包括期望的适体的混合物。核酸配体候选体库可源于天然地存在的核酸或其部分，化学合成的核酸，酶学地合成的核酸或由以上技术的组合产生的核酸。本实施方式的核酸配体候选体库中包括的适体具有发挥以上期望效果的通用序列(例如，随机序列结构域)，及相邻于随机序列结构域的多个保守的序列结构域。保守的序列结构域数是至少2。各结构域具有彼此互补的序列，其提供形成核酸的分子内双链体的前提。对于结构域数是3或更大的情况，配体可具有，但不限于，作为组合彼此互补的至少一对序列结构域。根据本实施方式的"特定二级结构"是指在保守的序列结构域中的不同互补序列之中形成的至少分子内双链体。结构包括形成包括邻近布置的通用序列的分子内双链体的那些。此外，源于双链体的三级结构不特别限制。限定以上随机序列结构域的序列或核苷酸可被保守的序列结构域分隔。随机序列结构域中的核苷酸数可依赖于核酸配体候选体库的库中分子数和实际筛选系统的体积，浓度等测定。例如，保守的序列结构域可设计为插入在随机序列结构域的两侧，从而随机序列结构域夹在其间。该设计可确保一维定位，其中分子内保守的序列结构域位置远离。该定位致使由筛选获得的适体经历与靶物质相互作用后的结构变化。通过结构变化，保守的序列结构域可预期形成分子内双链体，并彼此最接近。
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保守的序列结构域的长度(保守的序列结构域长度)不特别限制，但可为在不存在靶物质的条件下不主要在保守的序列结构域之中形成分子内双链体的长度。例如，进行本发明的步骤(a)，及就作为输入量处理的总核酸配体候选体库量估计在步骤(a)之后收集的核酸配体候选体库量。然后，可适当测定提供适当的筛选用回收率的保守的序列结构域长度。尤其是选择完美互补序列，且于室温在生理条件下，保守的序列结构域长度是5聚体和10聚体之间。保守的序列结构域长度可依赖于筛选的温度，盐浓度和pH及序列Tm值，等适当修饰。例如，用于核酸的二级结构预测的软件(例如，mfold)可以特定程度预测是否二级结构在特定特异性核酸配体中在加工的保守的序列结构域中容易形成。此外，保守的序列可不是完美互补。例如，保守的序列可包括错配喊基对，诸如G_G, G-T, G-A, A-A, A-C, C-C, C-T和T-T。在此情况中，保守的序列长度不限制。保守的序列结构域长度不代表在具有靶物质与根据本发明获得的核酸配体的相互作用的条件下实际上形成双链体的核苷酸数。结构分析(例如，NMR分析)致使在与靶物质实际结合期间适体中待分析的保守的序列结构域之中形成双链体的核苷酸数和位置。如果必需，最终核酸配体可通过下列步骤产生。首先，鉴定根据本发明获得的一种或更多核酸配体。接下来，分析与靶物质结合时的适体结构。然后，测定在包括与靶物质结合的区及加工的保守的序列结构域的区的近端的实际双链体-形成位点。保守的序列结构域可涉及通过与靶物质结合代表的期望效果。但是，作为各种序列设计的序列区可从各种靶物质的系统性筛选的观点来看为适合的。此外，根据本实施方式的〃核酸〃是指(单链或双链)DNA和RNA，或其化学修饰的分子之一。修饰的例包括，但不限于，3’和5’修饰，诸如封头。例还包括磷酸化，胺化，生物素化，硫醇化，荧光标记等。对于本发明的筛选方法中获得的适体应用适合的修饰可预先进行。此外，修饰可沿着序列进行到中途。尤其是，修饰的例包括提供另外的化学基团的那些，由此，核酸配体或全核酸配体的核苷酸合并另外的电荷，极化率，氢键合，静电相互作用和流动性。这些修饰致使对靶物质的亲和性的变异及结合能力增加。该修饰的例包括，但不限于，在位置2’的糖修饰，在第5位的嘧啶修饰，在第8位的嘌呤修饰，在环外胺的修饰，4-硫脲苷取代和5-溴-或5-碘-尿嘧啶取代，或还包括主链修饰，甲基化，罕见碱基配对组合(例如，异构化碱基的异胞苷和异胍组合)等。当在本发明中进行扩增步骤时，可选择所述允许扩增的修饰方法。反应条件期望用于在本发明的筛选方法中的步骤的条件设置为条件与适体的实际使用条件相同(例如，溶液条件(例如，温度，PH，盐浓度，添加剂))。尤其是，其可包括，可在相同的条件(例如，溶液条件(例如，温度，PH，盐浓度))下进行个体分离步骤和接触游离靶物质的步骤。关于向支持部添加非特异性吸附抑制物，条件可与实际使用的那些不同。靶物质本实施方式的靶物质是指期望且是目标对象的化合物或分子。靶物质可为广泛的分子(例如，以蛋白，低-分子量化合物诸如代谢物为代表的生物聚合体)。靶物质的特定例可包括，但不是特别限于，蛋白，肽，碳水化合物，糖，糖蛋白，激素，抗体，代谢物，过渡态
类似物，辅因子，抑制物，药物，营养物等。即，只要能结合核酸配体并形成与配体的相互作用，靶物质不具有特定限制，且可依赖于其目的适当选择。与SELEX方法组合具有更多对靶物质的亲和性的核酸序列可从核酸配体候选体库通过使用还包括下列本发明的筛选核酸配体的方法中的步骤的方法得到。特别是，在步骤(b)或(b’)之前还包括下列步骤(i) (iv)。步骤(i)是使祀物质与候选配体库接触的步骤，由此通过对靶物质具有更高亲和性的核酸配体形成核酸配体-靶物质复合物。步骤(ii)是去除不形成复合物的核酸配体的步骤。步骤(i i i )是自复合物仅分离及收集具有更高亲和性的核酸配体的步骤。步骤(iv)是通过扩增具有更高亲和性的核酸配体产生富集的核酸配体候选体库的步骤。以上步骤落入称之为SELEX方法名下。可将本申请方法与常规知道的SELEX方法或其改良的方法组合。组合中的组合方式和步骤顺序不特别限制。作为一实施方式，首先，进行SELEX方法。然后，获得具有更高亲和性的核酸配体候选体库。那之后，在靶物质缺失下分离及去除本发明的未靶向的在保守的序列结构域之中具有分子内双链体的核酸配体。最终，分离及收集在游离靶物质存在下在保守的序列结构域之中形成分子内双链体的本发明的靶向的核酸。此外，在本发明的步骤(d)或(d’)之后，可包括下列步骤(I) (IV)。步骤(I)是使靶物质与形成特定二级结构的去除靶物质的核酸配体接触的步骤，步骤(d)或步骤(d’ )中获得的配体，由此由对靶物质具有更高亲和性的核酸配体形成核酸配体-靶物质复合物。步骤(II)是去除不形成复合物的核酸配体的步骤。步骤(III)是自复合物仅分离及收集具有更高亲和性的核酸配体的步骤。步骤(IV)是通过扩增富集具有更高亲和性的核酸配体的步骤。从如尽可能减少收集期间的损失或减少偏移的具有更少步骤数的方法的观点来看，该组合对于筛选单元是期望的。分离步骤可与SELEX方法重复相同的次数，但数不特别限制。例如，对于最后一轮SELEX方法中获得的核酸候选配体库，靶向的核酸序列可通过利用双链体-形成能力中的差异(一旦有)重复分离步骤来获得。此外，利用双链体-形成能力中的差异的分离步骤数可依赖于其目的各自确定。分离步骤数可各不同。当组合SELEX方法时，利用双链体-形成能力的分离步骤的反应条件(例如，温度，pH，盐浓度)可与使核酸配体-靶物质复合物形成的SELEX方法中步骤的那些相同。添加剂(例如，向支持部的对于靶物质或核酸候选配体库的非特异性吸附抑制物)可适当变化，因为它们依赖于支持部和其表面官能团的类型，靶物质类型等。通过SELEX方法获得具有更高对靶物质的亲和性的核酸序列的原理可用于本申请，且不特别限制。一般而言，在SELEX方法中，进行这样的步骤，其使候选配体库与靶物质接触，由此由相比步骤(i)中获得的候选配体库具有更高对靶物质的亲和性的核酸序列形成核酸配体-靶物质复合物。接下来，将靶物质固定于固体支持物，并使与核酸候选配体库反应。然后，过程包括反应之后洗涤及收集形成复合物的核酸候选配体库。通过改变在反应期间的严格度并在此过程洗涤，可获得具有更高亲和性的核酸序列。严格度包括反应期间的温度，缓冲剂PH，盐浓度，添加剂及洗涤等，且可依赖于其目的修饰。以上固体支持物被定义为致使靶物质经共价键或非-共价键连接的任何表面。固体支持物的例包括，但不限于，膜，塑料，顺磁珠，负荷的纸，尼龙，Langmuir-Blodgett膜,官能化的玻璃，锗，硅，PTFE，聚苯乙烯，砷化镓，金和银。可为本领域技术人员知道的任何其他物质，所述物质包括能具有布置在表面的官能团(例如，氨基，羧基，氢硫基，羟基)的那 些。这些表面的例包括任何拓扑学表面，包括，但不限于，球形表面，具沟的表面和球面。相反，通过不使用固体支持物接触游离靶物质而使复合物形成，之后是通过利用来自复合物的物理性质自余下核酸候选配体库分级分离是可能的。例如，可利用等温电泳和层析。本文所述的扩增步骤可采用常规知道的方法，及，例如，可通过PCR方法达到。核酸候选配体库由PCR方法扩增。然后，例如，自双链体，由PCR方法使用生物素化的引物扩增之后，可用链霉亲和素柱分离及去除由扩增形成的双链体中核酸配体序列的相反链(互补链)。扩增步骤及其后的分离和纯化步骤不限于以上描述的方法。当进行扩增步骤时，核酸候选配体库的序列包括通用序列结构域(例如，随机序列结构域)及保守的序列结构域，以及引物序列结构域，其是保守的序列，用于扩增。被称之为PCR扩增的引物序列结构域可在核酸候选配体库的两端加工。引物序列结构域不特别限制。但是，可选择不容易与上述保守的序列结构域形成二级结构的序列。此允许PCR扩增有效进行。用于预测核酸的二级结构的软件(例如，mfold软件)可用作测定方法。引物序列结构域可通过设置部分通用序列结构域作为一些模型序列，设置为保守的序列结构域和用于扩增的引物序列结构域，并检查保守的序列结构域和用于扩增的引物序列结构域之间二级结构的形成的能力来选择。此外，可将保守的序列结构域的全区或其部分用作用于扩增的引物序列结构域的部分。一实施方式可包括布置保守的序列结构域，如通用序列(随机序列)夹在其间，且用于扩增的引物序列结构域是还布置在保守的序列结构域两端(图I)。一实施方式可还包括，将部分保守的序列结构域用作引物序列结构域，以减少对用于扩增的引物序列结构域的核酸配体结构的贡献。核酸序列可插入相应序列结构域之间作为接头部分。适体传感器和另外的使用根据本发明获得的核酸配体被认为是以高精确度进行药物递送的多功能药物或物质，鉴定为能与涉及，例如，特定代谢通路，或涉及蛋白的代谢物特异性相互作用的核酸配体的配体。而且，认为能与模拟反应中间体的分子特异性相互作用的适体的鉴定致使经历不稳定反应中间体的多步骤反应有效进行。此外，通过将配体吸附或附接于石英结晶单元，表面等离子体共振基材，电极或表面声波装置来可将核酸配体用作所谓的生物传感器。尤其是，使用的例可包括生物-传感器，分子开关，信号转导分子等，其利用根据本申请的与靶物质结合后的特定结构变化。
实施例尽管以下详细描述本发明的实施例，但本发明不限于这些实施例。实施例I首先，进行下列实验，由此展示在靶物质存在或缺失下的分离，利用分子内茎区的二级结构-形成能力的分离，如描述于图2A，2B和2C。将序列加入chl-47适体序列(SEQ ID NO: I)的两端，所述chl-47适体序列是对于靶物质(胆 酸)的适体序列，描述于Nucleic Acids Research, 2000，vol. 28，No. 9，1963-1968，以产生标准胆酸适体序列(SEQID N0:2)。以上SEQ ID NO:2设置为标准胆酸适体序列，并通过使用用于预测核酸二级结构的软件(mfold软件)在于20°C具有5mM的Mg2+和300mM的Na+条件下使经历结构预测。预测描述于图3A和3B的2种类型的结构作为对于胆酸的标准适体的稳定的二级结构。两种结构包括包含茎区，第I茎-环区和第2茎-环区的三联体结构(即，3-式连接)，与公开于以上之前报道的出版物的那些类似。当考虑以上之前报道的出版物时，结合于胆酸的区预测为3-式连接位点。SEQ ID NO: I :5’ -GATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTC-3，SEQ ID NO: 2 :5，-CAATTGATCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGTCAGATAGTATGTTCATCAG-3’描述于图3A和3B的茎区各具有具有9bp或IObp的区。为了展示本发明的原理，茎区的长度被适当缩短，由此在恒定温度改变茎-形成能力。然后，进行由本发明的分离步骤的分离。在茎区中从图I中区2和区4的两端各删除2bp和3bp的序列(在区2和区4之间形成)设计为茎缺失组(SEQ ID N0:3和4)。将2种类型的结构(图3C和3D)预测为具有2bp缺失的序列的稳定的二级结构。而且，将2种类型的结构(图3E和3F)预测为具有3bp缺失的序列的稳定的二级结构。接下来，预测相应序列的二级结构，及将图I中区2和区4之间形成的茎的碱基对长度总结于表I。表I例证了缺失组的序列和茎区的预测的长度之间的关系，从而认识茎长度和稳定的结构中的差异。然后，通过使用标准胆酸适体序列和其缺失组序列进行下列实验。SEQ ID NO: 3 :5，-CAATTTCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3’SEQ ID NO: 4 :5’-CAATTCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGAGATAGTATGTTCATCAG-3’表I由niFOLD预测..
__(图丨中区2和区4之间形成的)茎区长度^_
3bp 缺失 6; 7bp__- 4.66, - 4.87 kcal/mol
2bp 缺失 ~ O, 6bp__-15.22, -15.03 kcal/mol
标准序列 I 9，iObp-16,14, -16.32 kcal/mol实施例2在实施例I中设计的序列在SIGMA Genosys Inc中合成为寡聚体。通过使用PCR用引物序列(SEQ ID NO: 5和6)检查PCR条件。结果显示，将生产自TAKARA BIO Inc.的TAKARA LA Taq用作酶(根据流程的反应溶液)，且对于反应条件，进行于98°C变性10s，于55°C退火30s，及于72°C延伸15s的25次的循环。最终，将一个循环(于72°C持续Imin)力口 入条件。以上条件设为PCR条件以扩增各序列至具有几乎相当的量，及在后续使用。SEQ ID N0:5 :5’ -GAGGGCAGCGATAGC-3’SEQ ID N0:6 :5’ -GTGCTGATGAACATACTATCT-3’实施例3通过利用茎区中分子内二级结构(双链体)_形成能力作为指标展示，各种序列的丰度比改变。为此目的，将互补于各序列(标准胆酸适体序列，具有2bp或3bp缺失的序列)的莖区的5’-生物素化的寡序列(SEQ ID NO: 7，8和9)在SIGMA Genosys Inc中合成为寡聚体。在 TTK 缓冲剂(IOOmM Tris-HCl (pH8. 0),0. l%Tween20, IM KCl)中制备具有 50 μ M的终浓度的各生物素化的寡DNA。将自Bangs Laboratories, Inc.生产的固定了链霉亲和素的珠(Img)用TTK缓冲剂洗涤两次。接下来，去除缓冲剂，并将具有50 μ M或25 μ I的浓度的各种生物素化的寡DNA加入不同管。然后，使混合物于室温伴随搅拌反应I小时。用分光光度计测定(在260nm处)反应之后上清液的吸光度，及确证，几乎全部量的输入的DNA被固定。然后，用磁体收集珠，以去除上清液，并将50 μ I的0. 15Ν NaOH加入去除非-特异性吸附的DNA。将珠用TT缓冲剂(250mM Tris-HCl (pH8. 0),0. l%Tween20)充分洗涤。那之后，将珠悬浮于TTE缓冲剂(250mM Tris-HCl (pH8. 0),0. l%Tween20, 20mMEDTA)，及于80°C温育lOmin，以去除不稳定链霉亲和素。最终，将珠用核酸分离用缓冲剂(50mM Tris-HCl (pH7. 6),300mM NaCl, 30mM KCl, 5mM MgCl2)洗涤 5 次，并悬浮于新鲜核酸分离用缓冲剂。用分光光度计测量(在427nm处)吸光度，并估计其上固定生物素化的DNA序列的相应珠的浓度。SEQ ID N0:7 :5’ -CTGCCCTCGATCAATTG-3’SEQ ID N0:8 :5’ -CTGCCCTCGAAATTG-3’SEQ ID N0:9 :5’ -CTGCCCTCGAATTG-3’实施例4首先，各称重50 μ g的如在实施例3中制备的固定了相应生物素化的寡DNA的珠。接下来，用核酸分离用缓冲剂制备对应于各DNA的适体序列至具有IOOnM的终浓度和50 μ I的体积。通过于96°C处理IOmin变性之后，使混合物于室温缓慢冷却。然后，将混合物与50 μ g的以上固定的珠混合，并在具有20°C温度的温育器中伴随搅拌反应I小时。反应之后立即将珠和上清液分离并通过使用磁体收集。关于珠，用核酸分离用缓冲剂洗涤两次之后，将它们悬浮于新鲜核酸分离用缓冲剂，以于80°C反应lOmin。最终，立即分离上清液并通过使用磁体从珠收集。实施例5首先，各称重50 μ g的如在实施例3中制备的固定了相应生物素化的寡DNA的珠。接下来，用IOmM含有胆酸的核酸分离用缓冲剂制备对应于各DNA的适体序列至具有IOOnM的终浓度和50 μ I的体积。通过于96°C处理IOmin变性之后，使混合物于室温缓慢冷却。然后，将混合物与50μ g的以上固定的珠混合，并在具有20°C温度的温育器中伴随搅拌反应I小时。反应之后立即将珠和上清液分离并通过使用磁体收集。用核酸分离用缓冲剂洗涤两次之后，将珠悬浮于新鲜核酸分离用缓冲剂，以于80°C反应lOmin。最终，立即分离上清液并通过使用磁体从珠收集。实施例6将在实施例4和5中收集的DNA样品由Promega Wizard SV Gel和PCR清洁系统(根据流程)纯化，并在实施例2的PCR条件下扩增，除了循环数改变为30次之外。然后，通过电泳和EtBr染色检查扩增条带。由ImageJ (NIH开发的开放资源图像处理软件)计算条带强度。将标准胆酸适体序列的扩增条带强度设为1，并关于上清液样品，与对应固定的珠反应之后，将相应缺失序列(2bp，3bp)与标准序列比较，以计算缺失序列的条带强度(图4)。结果展示，在各序列与固定了生物素化的DNA的珠反应之后，对于在实施例4中收集的上清液样品观察到强度减小。尤其是，减小对于2bp缺失序列大。在各序列与固定了生物素化的DNA的珠反应之后，对于在实施例5中收集的上清液样品也以类似方式观察到强度减小。但是，发现强度减小小于实施例4。这些结果伴随茎长度和稳定的结构之间的关系，如描述于表1，展示茎区-形成能力在胆酸缺失下依赖于相比标准序列的长度的缺失组的长度而降低(实施例4)。结果，与互补链在珠上形成分子间双链体的频度增加。这因此提示，上清DNA浓度降低。在胆酸存在下恢复上清液中DNA的浓度(扩增条带强度)(实施例5)。由此，通过胆酸与缺失组DNA结合辅助茎区中分子内双链体形成，由此降低在珠上与互补链形成分子间双链体的频度。这因此提示，上清DNA的浓度增加。而且，在缺失组(2bp，3bp)中，在胆酸存在下2bp缺失的强度恢复更大。关于在胆酸缺失下稳定的结构，如显示于表l，2bp缺失导致结构具有Obp (全结构的AG=-15. 22kcal/mol)和6bp (-15. 03kcal/mol)的茎长度，及 3bp 缺失导致结构具有 6bp (全结构的 ΔG=-14. 66kcal/mol)和 7bp (-14. 87kcal/mol)的茎长度。考虑到此，2bp缺失允许分子内茎区通过结合于胆酸而恢复，从而在胆酸缺失下稳定的结构被认为显著移位。实施例7接下来，设计图I中示意性显示的核酸候选配体库的序列(SEQID NOilO和11)和对照序列(SEQ ID NO: 12)，且它们作为寡聚体合成。SEQ ID NO: 10通过随机化对于胆酸的chl-47适体序列(SEQID NO: I)的仅第2茎-环区及通过在随机化的序列的两端添加PCR用引物序列来构建。SEQ、 ID NO: 11通过随机化对于胆酸的chl-47适体序列(SEQ ID NO: I)的第I和第2茎-环区及通过在随机化的序列的两端添加PCR用引物序列来构建。对照序列通过在对于胆酸的chl-47适体序列的两端添加PCR用引物序列来构建。作为寡聚体以类似方式合成用于SELEX方法的PCR引物序列(SEQ ID NO: 13和14)。设计SEQ ID NO: 13,由此扩增实际适体序列链，并在5’端生物素化。SEQ ID N0:10 :5’-GTACCAGCTTATTCAATTTCGAGGGCAGCGATAGCTGNNNNNNNNNNNNNNNNNCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3’SEQ ID NO: 11 :5’-GTACCAGCTTATTCAATTTCGAGGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3，SEQ ID NO: 12 :5’-GTACCAGCTTATTCAATTTCGAGGGCAGCGATAGCTGGGCTAATAAGGTTAGCCCCATCGGAGATAGTATGTTCATCAG-3’SEQ ID NO: 13:5’ -gtaccagctt attcaattt-3’SEQ ID NO: 14:5，-ctgatgaaca tactatctc-3’实施例8将模型靶物质，胆酸，固定于96-孔板，其通过使用下列过程生产，由此进行SELEX方法。首先，向生产自Sumitomo Bakelite Inc.的胺基化的96-孔板(Sumi Ion ELISA板)添加ImM的光交联基团接头，生产自Thermo Scientific Inc.的NHS-LC-二氮杂环丙烯(6-(4, 4’ -叠氮戊酰胺基)己酸琥珀酰亚胺酯)和200 μ I/孔的PBS (磷酸盐缓冲液)缓冲齐U。然后，使氨基与NHS于室温在暗条件下伴随搅拌反应I小时。反应之后，去除反应溶液，并添加200 μ I的IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. O)。接下来，将混合物于室温处理5min，以灭活未反应的NHS。然后，去除溶液，并将板用PBS良好洗涤3次，以添加200 μ I的O. 5mM含有胆酸的溶液(H20)。用真空干燥器干燥之后，将板直接放置在365nm UV灯(15wX 2)下，以进行交联反应15min。那之后，将板用PBS良好洗涤。最终，将板用水漂洗，并在N2气体下干燥，以用干燥器中的挡板保存板，直到其使用。此方法允许胆酸无取向地固定，且不需要将特定官能团用于固定。此过程尤其是对于小分子进行SELEX方法中非常有用的，且二氮杂环丙烯的卡宾物种具有非常有力的反应性，且适合于各种低-分子量化合物的固定。实施例9用结合缓冲剂(50mMTris-HCl (pH7. 6),300mM NaCl, 30mMKCl, 5mMMgCl2, 0. 01%Tween20, 0. 1%PEG8000)制备如在实施例7中生产的具有IOOnM的浓度的核酸候选配体库。使候选配体库在95°C变性5min,且不搅拌地于室温放置30min。根据实施例3生产固定了生物素化的DNA(SEQ ID NO:8)的珠。接下来，根据实施例4使以上核酸候选配体库与固定的珠反应。将上述实施例4的核酸分离用缓冲剂变为在此实施例中的结合缓冲剂。将反应温度变为25°C。待在此步骤中获得的结合珠的级分(核酸候选配体库)用在下列实施例中。如果需要，此步骤可重复几次。实施例10将在实施例9中收集的候选配体库于95°C变性5min，及不搅拌地于室温放置30min。接下来，将100 μ I的候选配体库加入在实施例8中制备的固定了胆酸的板，并伴随搅拌于25V反应I小时。然后，将板用结合缓冲剂良好洗涤，并加入100 μ I的5mM含有胆酸的溶液(结合缓冲剂)，以伴随搅拌处理板30min。而且，将板于95°C处理5min，然后洗脱结合于固定的胆酸的核酸候选配体库。将洗脱的混合物由Promega Wizard SV Gel和PCR清洁系统(根据流程)纯化，并溶于50 μ I的无菌水。那之后，通过使用用于SELEX方法的PCR引物序列(SEQ ID NO: 13和14)进行PCR。
使用TAKARA LA Taq(反应溶液根据流程)，而对于反应条件，进行于94°C变性30s，于48°C退火30s，及于72°C延伸15s的30次的循环。在最后，进行一个循环(于72°C持续lmin)。扩增的DNA由Wizard SV Gel和PCR清洁系统(根据流程)纯化，及通过使用生产自Bangs Laboratories, Inc.(根据流程)的固定了链霉亲和素的珠收集仅生物素化的核酸候选配体库。此步骤定义为一个循环，并重复10个循环。实施例11使用在实施例3中生产的固定了生物素化的DNA (SEQ ID N0:8)的珠以根据实施例5的方式处理在实施例10中收集的核酸候选配体库。在实施例5的步骤中，将核酸分离用缓冲剂变为结合缓冲剂，并将温度从20°C变为25°C。收集此步骤的上清液级分。此步骤可重复几次。接下来，由Wizard SV Gel和PCR清洁系统(Promega Inc.)(根据流程)进行缓冲剂取代和纯化，并在用于SELEX方法的PCR条件下，通过使用未生物素化的引物序列进行PCR。那之后，克隆扩增的DNA，并随机测定挑选的克隆的核苷酸序列。获得如通过SELEX方法富集的结合于胆酸的适体的DNA序列群。
实施例12从得到的结合于胆酸的适体的DNA序列除去用于SELEX方法的PCR弓丨物序列。作为寡聚体合成得到的序列，并通过使用SPR和ITC，等评价其结合于胆酸的性质。实施例13从得到的结合于胆酸的适体的DNA序列除去用于SELEX方法的PCR引物序列。作为寡聚体合成将荧光FAM (激发495nm，发射520nm)和荧光ROX (激发590nm，发射610nm)连接到得到的序列的两端的序列。用荧光分光光度计测定添加胆酸之前及之后的FRET(荧光共振能量转移)。在FAM激发时，确证在胆酸存在下ROX的荧光强度增加的现象。实施例14获得在胆酸存在或缺失结合于胆酸的适体的DNA序列的CD谱。然后，测定在胆酸存在下形成双链体之后的⑶谱变化。实施例15将结合于胆酸的适体的DNA序列群与通过未使用固定了生物素化的DNA (SEQ IDN0:8)的珠进行分离步骤的SELEX方法获得的DNA序列群比较。确证源于根据本发明的方法获得的序列群的结合于胆酸的适体在FRET中具有增加的效率和大的CD谱变化。这表明，本发明赋予与靶物质结合后预加工的茎区之间形成分子内双链体的结构变化能力，且表明，对胆酸具有结合亲和力的适体分子可通过本发明的筛选方法有效获得。此外，得到的本发明的适体分子应尤其是具有作为用于荧光感觉的捕获分子的效应。从前述实施例鉴定了本发明的形成特定二级结构的核酸配体序列。工业实用性通过本筛选方法鉴定的核酸配体致使在与靶物质相互作用之后在预加工的保守的结构域之间形成分子内双链体。可将它们尤其是用作利用此结构变化的生物传感器，分子开关和信号转导分子。例如，将荧光报告子分子导入通过与靶物质结合形成的分子内双链体的特定位点致使达到稳定的信号。此外，复合物应稳定化，因为分子内双链体在与靶物质结合之后形成，从而可实现具有更高结合亲和力的核酸配体。此外，用于导入荧光报告子分子的位点可还以通过进行靶物质与根据本方法获得的核酸配体的复合物的结构分析的方式精确地设计。此外，根据本发明的方法，即便靶物质改变，仍可类似地利用保守的序列。由此，所述方法是获得核酸配体的系统性方法。所述方法在操作多物质的情况中，诸如在允许传感器阵列及允许在本体系统中检测多个不同种类的情况中具有显著的优势。此外，在本发明的筛选方法中，通过利用对靶物质的结合亲和力和结构变化能力二者作为指标获得核酸配体，由此,关注由于再加工失去对靶物质的结合亲和力，由此给配体赋予结构变化能力。 本申请要求2010年2月26日提交的日本专利申请No. 2010-043559，和2011年I 月31日提交的No. 2011-018651的权利，将它们通过引用整体并入本文。
权利要求
1.就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法，所述方法包括 (a)制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域； (b)在靶物质缺失下使库与支持部接触，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及去除不形成分子间双链体的核酸配体；以及 (C)通过在靶物质存在下使靶物质与(b)中获得的余下形成分子间双链体的核酸配体接触来解离分子间双链体，然后分离及收集具有通过与靶物质结合形成的特定二级结构的核酸配体， 其中方法包括至少一次(b)及至少一次(C)。
2.权利要求I的筛选方法，其中(C)包括 收集(b)中获得的余下形成分子间双链体的核酸配体，使核酸配体与靶物质混合，并使混合物与支持部接触，然后通过利用不形成分子间双链体的现象分离及收集具有与靶物质结合后形成的特定二级结构的核酸配体。
3.权利要求I的筛选方法，还在(c)之后包括，(d)从收集的形成特定二级结构的核酸配体去除靶物质。
4.权利要求I的筛选方法，还在(b)之前包括 使库与靶物质接触，从而对靶物质具有更高亲和性的核酸配体形成核酸配体-靶物质复合物； 去除不形成复合物的核酸配体； 自复合物仅分离及收集具有更高亲和性的核酸配体；以及 扩增具有更高亲和性的核酸配体以产生富集的核酸配体候选体库。
5.权利要求3的筛选方法，还在(d)之后包括 使靶物质与形成特定二级结构的去除靶物质的核酸配体接触，(c)中获得的核酸配体，从而对靶物质具有更高亲和性的核酸配体形成核酸配体-靶物质复合物； 去除不形成复合物的核酸配体； 自复合物仅分离及收集具有更高亲和性的核酸配体；以及 扩增核酸配体以富集具有更高亲和性的核酸配体。
6.就与靶物质结合后形成特定二级结构的核酸配体筛选核酸配体候选体库的方法，所述方法包括 Ca')制备核酸配体候选体库，所述核酸配体包括用于结合靶物质的随机序列结构域及用于形成特定二级结构的保守的序列结构域； (b’ )在靶物质存在下使库与支持部接触，其中与包括在核酸配体中的保守的序列结构域中的至少一个互补地结合的互补序列结构域布置在支持部的表面，然后通过利用在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的现象分离及收集不形成分子间双链体的核酸配体； (c’ )自(b’)中分离的及收集的核酸配体去除靶物质；以及(d’)在靶物质缺失下使支持部与(c’)中获得的去除靶物质的核酸配体接触，然后分离及收集在支持部的表面核酸配体和互补序列结构域之间形成分子间双链体的核酸配体。
7.鉴定形成特定二级结构的核酸配体的序列的方法，其中所述配体根据权利要求I获得。
全文摘要
本发明提供就核酸配体筛选候选体库的方法，所述方法包括下列步骤(a)制备核酸配体候选体库；(b)在靶物质缺失下使库与支持部接触，所述支持部与包括在配体中的保守的序列结构域中的至少一个结合，然后分离及移出不形成分子间双链体的配体；及(c)通过在靶物质存在下使靶物质接触步骤(b)中获得的余下形成分子间双链体的配体来解离分子间双链体，然后分离及收集具有通过与靶物质结合形成的特定二级结构的配体，其中方法包括至少一次步骤(b)及至少一次步骤(c)。
文档编号C12Q1/68GK102791883SQ20118001029
公开日2012年11月21日 申请日期2011年2月23日 优先权日2010年2月26日
发明者伊比井崇向, 畠山哲 申请人:佳能株式会社