改善需Fe-S簇蛋白质的活性的制作方法

专利名称：改善需Fe-S簇蛋白质的活性的制作方法
改善需Fe-S簇蛋白质的活性相关串请的交叉引用本专利申请要求于2010年2月17日提交的美国专利临时申请61/305，333的权益，其全文以引用的方式并入本文。序列表信肩、本专利申请附带以电子方式提交的存于ASCII码文本文件CL4842sequencelisting. txt的序列表的内容,其全文以引用的方式并入本文。发明背景 发明领域本发明一般涉及微生物学和生物化学领域。具体地，本发明涉及重组宿主细胞，具体地酵母细胞，其包含二羟酸脱水酶多肽。本发明也涉及重组宿主细胞。由于增加了多肽的表达、细胞中Fe-S簇的生物合成活性的调控、或它们的组合的原因，所述宿主细胞具有增加的二羟酸脱水酶多肽比活性。本发明也包括使用所述宿主细胞的方法，以及在宿主细胞中鉴定多肽的方法，所述多肽增加了 Fe-S簇的生物合成途径中的通量。
背景技术：
铁-硫(Fe-S)簇作为辅因子或辅基，对这类含Fe-S簇蛋白质的正常功能是必需的。在此类含Fe-S簇蛋白质中，发现Fe-S簇有多个重要作用。当此类蛋白质在细胞中第一次合成时，他们缺乏对蛋白质正确功能所必需的Fe-S簇，被称为脱辅基蛋白质。Fe-S簇是在由参与Fe-S簇生物合成的蛋白质催化的一系列反应中形成的，并且传递给脱辅基蛋白质以形成功能的含Fe-S簇全蛋白质。一个需要有Fe-S簇才能具备正常功能的此类蛋白质是二羟酸脱水酶(DHAD)(E. C. 4. 2. I. 9)。DHAD催化2，3- 二羟基异戊酸被转化成α _酮异戊酸，并且2，3- 二羟基戊酸甲酯转化成α-酮戊酸甲酯。所述DHAD酶为天然存在的生物合成途径中的一部分，该生物合成途径产生支链氨基酸(即缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸)和泛酸(维生素Β5)。DHAD催化的2，3- 二羟基异戊酸被转化成α -酮异戊酸也是众多异丁醇生物合成途径中的一个普通步骤，其公开于美国专利公开申请公布US20070092957A1中，以引用方式并入本文。其中公开了例如用于生产异丁醇的重组微生物工程。高水平的DHAD酶活可期待增加来自生物合成途径的产品产量，其包括这种酶活性，包括例如增大的支链氨基酸、泛酸和异丁醇的微生物产量。异丁醇具体地用作燃料添加齐U，并且其易获得性可减少对于石化燃料的需求。然而，由于所有已知的DHAD酶需要Fe-S簇以具有功能，它们必须在具有可提供这些蛋白质所需Fe-S簇的遗传机制的宿主中表达。在酵母中，线粒体在Fe-S簇生物合成中起重要作用。如果DHAD在酵母细胞在酵母胞质溶胶中有功能地表达，需要一个系统来传输必需的Fe-S前体或来自线粒体的信号并将Fe-S簇装配到胞质溶胶中的脱辅基蛋白质上。在本发明人的工作之前，酵母是否能为位于细胞质中的任何DHAD提供Fe-S簇是前所未知的(由于新生酵母DHAD位于线粒体中)，更重要的是DHAD在细胞质中高水平表达时。
在某些条件下需Fe-S簇的脱辅基蛋白质合成速率可超过细胞为其合成并组装Fe-S簇的能力。在这些条件下积累的缺少簇的脱辅基蛋白质不能执行它们的正常功能。此类条件能包括I)特别大量表达需Fe-S簇的脱辅基蛋白质；2)自身Fe-S簇生物合成蛋白质表达水平高于正常；或3)宿主细胞合成Fe-S簇的能力处于减弱的状态。发明概述本文公开了惊人的发现如果Fe摄入、利用、和/或Fe-S簇生物合成蛋白质中的至少一项的水平发生改变，高水平表达需Fe-S簇的脱辅基蛋白质的重组宿主细胞能够为蛋白质提供与其结合的Fe-S簇。本文提供的是重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸，其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒。还提供了重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸，其中所述至少一种异源性多核苷酸在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。还提供了重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸，其中所述宿主细胞在编码影响铁代谢或Fe-S簇生物合成的内源性基因中包含至少一种缺失、突变、和/或取代。还提供了重组宿主细胞，其包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和编码影响铁代谢或Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中，所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自表7、8和9中基因。在实施方案中，所述编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、CCC1、FRA2和GRX3、以及它们的组合。在实施方案中，多肽是由组成型突变的多核苷酸编码的。在实施方案中，所述组成型突变选自AFTl L99A、AFT1L102A、AFTlC291F、AFTl C293F、以及它们的组合。在实施方案中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽是由多核苷酸编码的，其包含高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒。在实施方案中， 所述影响Fe-S簇生物合成的多肽是由在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次的多核苷酸编码的。在实施方案中，在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代，选自CCC1、FRA2和GRX3、以及它们的组合。在实施方案中，编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、它们的突变体、以及它们的组合。在实施方案中，编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸是以多拷贝表达的。在实施方案中，所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒。在实施方案中，所述至少一种异源性多核苷酸在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。在实施方案中，所述Fe-S簇生物合成相比于具有内源性Fe-S簇生物合成的重组宿主细胞是增加的。在实施方案中，所述宿主细胞为酵母宿主细胞。在实施方案中，所述酵母宿主细胞选自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)和毕赤酵母属(Pichia)。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以< 10_5的E值匹配表12的序型隐蔽马尔科夫模型的氨基酸序列，其中所述多肽还包含全部3个保守的半胱氨酸，它们对应于变异链球菌(Streptococcus mutans)DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201，所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID N0:168。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽与SEQ ID NO :168或SEQ ID NO :232具有至少约90%的氨基酸序列同一性。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性大于对照宿主细胞的约5倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；大于对照宿主细胞的约8倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；或大于对照宿主细胞的约10倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性大于对照宿主细胞的约3倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；以及大于对照宿主细胞的约6倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性大于约O. 25U/mg ;大于约O. 3U/mg ;大于约O. 5U/mg ;大于约I. OU/ mg ;大于约I. 5U/mg ;大于约2. OU/mg ;大于约3. OU/mg ;大于约4. OU/mg ;大于约5. OU/mg ； 大于约6. OU/mg ;大于约7. OU/mg ;大于约8. OU/mg ;大于约9. OU/mg ;大于约10. OU/mg ;大于约20. OU/mg ;和大于约50. OU/mg ο在实施方案中，所述重组宿主细胞产生异丁醇，并且在在实施方案中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。本文还提供了制备产品的方法，所述方法包括提供重组宿主细胞；并在产生所述产物的条件下，将重组宿主细胞与发酵培养基中发酵碳底物接触；其中所述产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-I-丁醇、3-甲基-I-丁醇、异丁醇、以及它们的组合。在实施方案中，所述方法还包括任选地回收所述产品。在实施方案中，所述方法还包括回收所述产品。还提供了制备异丁醇的各种方法，所述方法包括提供重组宿主细胞；在产生异丁醇的条件下，将重组宿主细胞与发酵培养基中发酵碳底物接触。在实施方案中，所述方法还包括任选地回收所述异丁醇。在实施方案中，所述方法还包括回收所述异丁醇。还提供了将2，3- 二羟基异戊酸转化成α _酮异戊酸的各种方法，包括提供重组宿主细胞；使重组宿主细胞在2，3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸的条件下生长。在实施方案中，相比于包含至少一种编码具有二羟酸脱水酶活性的异源性多核苷酸的对照重组宿主细胞，所述2，3_ 二羟基异戊酸至α-酮异戊酸的转化的增加量选自(a)至少约5%;(b)至少约10% ； (c)至少约15% ； (d)至少约20% ； (e)至少约25% ； (f)至少约30% ； (g)至少约35% ； (h)至少约40% ；⑴至少约45% ； (j)至少约50% ； (k)至少约60% ；⑴至少约70% ； (m)至少约80% ； (η)至少约90% ;和(ο)至少约95%。还提供了增加重组宿主细胞中具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽的比活性的各种方法，包括提供重组宿主细胞；并使重组宿主细胞在具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长，有功能的形式具有大于缺乏所述异源性多肽的相同的宿主细胞的比活性。还提供了提高宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径的通量的各种方法，所述方法包括提供重组宿主细胞；并使重组宿主细胞在宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径的通量增加的条件下生长。提供了包含需Fe-S族蛋白质的重组宿主细胞；改变所述宿主细胞中影响Fe-S族生物合成的多肽的表达或活性；并且使重组宿主细胞在增加需Fe-S簇蛋白质的活性的条件下生长。在实施方案中，所述活性增加量选自大于约10% ;大于约20% ;大于约30% ；大于约40% ;大于约50% ;大于约60% ;大于约70% ;大于约80% ;大于约90% ;和大于约95%、98%、或99%。在实施方案中，活性的增加量选自大于约5倍；大于约8倍；大于约10倍。在实施方案中，活性的增加量选自大于约3倍和大于约6倍。宿主细胞中增加Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法，包括改变影响Fe-S簇生物合成的多肽表达或活性；测量异源性需Fe-S簇蛋白质的活性；并且比较多肽存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性与多肽不存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性，其中所述异源性需Fe-S簇蛋白质活性的增加表明Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。

本文提供了增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法，所述方法包括改变影响Fe-S簇生物合成的多肽表达或活性；测定具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性；并且比较多肽的表达或活性存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性与多肽的表达或活性不存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性，其中所述异源具有二羟酸脱水酶活性的多肽活性的增加表明Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。在实施方案中，影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性改变包含缺失、突变、取代、表达、上调、下调、改变细胞定位、改变蛋白质的状态、和/或加入辅因子。在实施方案中，需Fe-S簇蛋白质具有二羟酸脱水酶活性，并且其中所述具有二羟酸脱水酶活性的需Fe-S簇蛋白质具有匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其具有< 10_5的E值。其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸，它们对应于变异链球菌的氨基酸序列中的位点56、129和201，变异链球菌对应于SEQ ID N0:168。在实施方案中，所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为选自表7、8和9中的基因。还提供了包含至少一种编码多肽的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多肽由本文提供的方法鉴定。在实施方案中，所述宿主细胞还包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。在实施方案中，所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的异源性多核苷酸以多拷贝表达。在实施方案中，所述异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。在实施方案中，所述异源性多核苷酸在重组宿主细胞中整合至少一次。在实施方案中，所述宿主细胞为酵母宿主细胞。在实施方案中，所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。在实施方案中，所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以<10_5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列。其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸，它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201，变异链球菌DHAD酶对应于SEQ IDNO :168。在实施方案中，所述重组宿主细胞产生的产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I- 丁醇、异丁醇、以及它们的组合。在实施方案中，重组宿主细胞产生异丁醇。在实施方案中，所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。在实施方案中，所述异丁醇生物合成途径包含由宿主细胞中异源性多核苷酸编码的至少一种多肽。在实施方案中，所述异丁醇生物合成途径包含条由宿主细胞中异源性多核苷酸编码的至少两个多肽。在实施方案中，本发明的具有二羟酸脱水酶活性的多肽单体具有选自下列的Fe-S簇加载(a)至少约10% ； (b)至少约15% ； (C)至少约20% ； (d)至少约25% ； (e)至少约30% ； (f)至少约35% ； (g)至少约40% ； (h)至少约45% ；⑴至少约50% ； (j)至少约60% ； (k)至少约70% ；⑴至少约80% ； (m)至少约90% ;和(η)至少约95%。附图简述图IA描绘了用于过表达来自变异链球菌(S. mutans)的IIvD基因的载体的载体图谱。
图IB描绘了用于过表达来自变异链球菌染色体上的IlvD基因的整合载体的载体图谱。图2描绘了用于克隆AFTl或AFTl突变体和其它受关注基因的着丝粒载体的载体图谱。图3描绘了纯化的变异链球菌DHAD的紫外-可见吸收光谱。图4描绘了纯化的变异链球菌DHAD的EPR光谱。图5描绘了生物合成异丁醇的生物合成途径。图6A描绘了维捏兰德固氮菌(Azotobacter vinelandii)nif基因的不意图。图6B描绘了附加的维涅兰德固氮菌nif基因的示意图。图6C描绘了其中NFU作为过硫化物还原酶的公式的示意图。图7描绘了幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)nif基因的示意图。图8描绘了大肠杆菌(E. coli)isc基因的示意图。图9描绘了大肠杆菌suf基因的示意图。

图10描绘了胞质溶胶的[2Fe_2S]生物合成和组装系统的示意图。图11描绘了用于过表达来自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的IIvD基因的载体的载体图谱。表12是基于检测功能的酶计的二羟酸脱水酶的序型HMM表，检测是按照于2009年9月29日提交的美国专利公开12/569,636的描述准备的。表12是在此以电子版形式提交的，并且以引用方式并入本文。发明详述本文描述了一种增加与Fe-S簇一起加载的需Fe-S簇蛋白质分数的方法。也描述了重组宿主细胞，其中表达功能的需Fe-S簇的蛋白质，如DHAD酶和异源铁摄入、利用、或Fe-S簇生物合成蛋白质其中至少一种；还有重组宿主细胞，其中表达功能的DHAD酶并在涉及铁利用或Fe-S簇生物合成的天然蛋白质中的至少一种缺失、突变、和/或取代；或包含它们的组合的重组宿主细胞。此外，本发明描述了一种在宿主细胞中增加Fe-S簇生物合成途径的通量的蛋白质的鉴定方法。所述还有一种改变需Fe-S簇蛋白质活性的多肽的鉴定方法。
除非另外规定，本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的意思。如发生矛盾，将以包括所述定义的本专利申请为准。此外，除非上下文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。为所有目的，所有的出版物、专利、以及本文提及的其它参考资料均全文以引用方式并入本文。为了进一步限定本发明，本文提供了以下术语和定义。如本文所用，术语“包含”、“包含”、“包括”、“包括”、“具有”、“具有”、“含有”或“含
有”或它们的任何其它变型将被理解为是指包括指定的整数或整数组 但不排除任何其它整数或整数组。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备所固有的元素。此外，除非另外特别说明，否则“或”是指包含性的或，而不是指排他性的或。例如，以下任一项均表示满足条件A或B :A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“由组成”或诸如“由组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，但是无附加整数或整数组可加入到指定的方法、结构或组合物中。如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语“基本上由组成”或诸如“基本上由组成”的不同时态的变型表明包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括未显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见M. P. E. P. § 2111. 03。此外，涉及元素或组分实例(即出现)的数目在本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在为非限制性的。因此，“一个”或“一种”应被理解为包括一种或至少一种，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。如本文所用，术语“发明”或“本发明”为非限制性术语，并且不旨在意指本发明的任何单独实施方案，而是涵盖如本专利申请所述的所有可能的实施方案。如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下程序而发生的用数字表示的量的变化在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测定和液体处理操作；通过这些程序中非故意的误差；通过用于产生组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等。术语“约”还包括由于对于起因于特定起始混合物的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求包括量的等同量。在一个实施方案中，术语“约”是指在报告数值10%范围内，优选地在报告数值5%范围内。术语“异丁醇生物合成途径”是指一种由丙酮酸生成异丁醇的酶(催化)途径。术语“兼性厌氧菌”是指能够在有氧和无氧环境中生长的微生物。术语“碳底物”或“能发酵的碳底物”是指本发明的宿主生物体能够代谢的碳源，和尤其选自单糖、寡糖、多糖和单碳底物或它们的混合物的碳源。术语“Fe-S簇生物合成”是指Fe_S簇的生物合成，包括，例如，Fe-S簇的组装和加载。术语“Fe-S簇生物合成基因”、“Fe-S簇生物合成蛋白质”或“Fe_S簇生物合成途径”是指那些多核苷酸/基因和编码的多肽，其涉及Fe-S簇生物合成，包括，例如，Fe-S簇的组装和加载。术语“铁摄入和利用”是指能够影响Fe-S簇生物合成如铁传感、摄入、利用和自稳态的过程。“铁摄入和利用基因”是指那些多核苷酸/基因和编码的多肽，其涉及铁传感、摄入、利用和自稳态。这些多核苷酸/基因中的一部分包含在“Fe Regulon”中，其在文献中已经有过描述并在后面有进一步说明。如本文所用，铁摄入和利用基因和Fe-S簇生物合成基因能够编码影响Fe-S簇生物合成的多肽。如本文所用术语“比活性”定义为一定量蛋白质的活性单位。因此，所述比活性不是直接测定的而是通过计算得到的用I)酶样品的活性，单位/ml除以2)该样本中的蛋白质浓度，因此所述比活性表示为单位/mg。纯的、完全活性的酶样品的比活性是这种酶的特性。蛋白质混合物的比活性是量度由感兴趣的活性酶组成的样品中的蛋白质相对分数。本发明所述多肽的比活性可选自大于约O. 25U/mg ;大于约O. 3U/mg ;大于约O. 4U/mg ;大于约O. 5U/mg ;大于约O. 6U/mg ;大于约O. 7U/mg ;大于约O. 8U/mg ;大于约O. 9U/mg ；大于约I. OU/mg ;大于约I. 5U/mg ;大于约2. OU/mg ;大于约2. 5U/mg ;大于约3. OU/mg ;大于约3. 5U/mg ;大于约4. OU/mg ;大于约5. 5U/mg ;大于约5. OU/mg ;大于约6. OU/mg ;大于 约6. 5U/mg ;大于约7. OU/mg ;大于约7. 5U/mg ;大于约8. OU/mg ;大于约8. 5U/mg ;大于约9. OU/mg ;大于约 9. 5U/mg ;大于约 10. OU/mg ;大于约 20. OU/mg ;或大于约 50. OU/mg。在一个实施方案中，本发明的多肽的比活性大于约0. 25U/mg。在另一个实施方案中，所述比活性大于约I. OU/mg。在另一个实施方案中，所述比活性大于约2. OU/mg或大于约3. OU/mg。术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸，和指核酸分子或核酸构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸能够包含全长cDNA序列的核苷酸序列，或其片段，包括非翻译的5'和3'端序列和编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核糖核酸或多脱氧核糖核酸组成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多核苷酸能够由单链和双链DNA构成，其为单链和双链区域的混合物；单链和双链RNA，其为单链和双链区域的混合物；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典型地双链或单链和双链区域的混合物。“多核苷酸”包含了化学地、酶学地、或代谢地改性的形式。多核苷酸序列可意为“分离的”，其中它从天然的环境中移除出来。例如，包含在载体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括异源宿主细胞拥有的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核酸还包括此类人工合成生产的分子。DNA聚合物分离的多核苷酸片段形式可由一个或更多个cDNA、基因组DNA或合成DNA片段构成。术语“基因”是指多核苷酸，其能够表达为特异性蛋白质，任选地包括在编码序列前面的(5'非编码序列)和后面的(3'非编码序列)调节序列。“天然基因”是指天然存在的具有其自己的调控序列的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因，包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。如本文所用，“编码区”是指由翻译为氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA、或TAA)不翻译为氨基酸，它可被考虑作为编码区域的一部分，但任何侧翼序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、以及等等，不是编码区域的一部分。本发明的两个或更多个编码区域能存在于单种多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上；或在独立的多种多核苷酸构建体中，例如，在独立的(不同的)载体中。此外，任何载体可包含单个编码区域，或可包含两个或更多个编码区域。此外，本发明的载体、多核苷酸、或核酸可编码异源编码区域。术语“内源性”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指在生物体基因组中天然位置的原生的多核苷酸或基因，或是由基因组这个位置转录和翻译的原生的多肽。术语“异源性”在用于提及多核苷酸、基因、或多肽时是指在宿主生物体中没有正常地发现的多核苷酸、基因、或多肽。“异源”也包括原生的编码区域、或它们的一部分，即以不同于对应的原生基因的一种形式重新导入源生物体，例如，不在所述生物体基因组中的原生位置上。所述异源性多核苷酸或基因可通过例如基因转移的方式导入宿主生物体。异源性基因可包括原生的编码区域，其带有重新导入所述原生宿主的非原生调节区域。“转基因”是已通过转化程序导入基因组内的基因。
术语“重组基因表达元件”是指表达一个或多个特异性蛋白质的核苷酸片段，其包括前面的调控序列(5'非编码序列)和之后的(3'终止序列)蛋白质编码序列。嵌合基因是重组基因表达元件。操纵子的编码区域可形成重组基因表达元件，一起的还有可操作地连接的启动子和终止区域。“调控序列”是指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部、或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且能影响相关的编码序列的转录、RNA加工或RNA稳定性、或翻译。调控序列可包括启动子、增强子、操纵子、阻遏子、转录终止信号、翻译引导序列、内含子、多聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可来源于天然基因的全部、或由天然存在的不同启动子的不同元件组合而成、或甚至包含合成的核酸片段。本领域的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引起基因表达的启动子称为“组成型启动子”。另一方面，“诱导型启动子”在所述启动子被启动子特异的信号或分子诱导或打开时导致基因表达。还应认识到因为在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调控序列。术语“表达”如本文所用是指表达和积累来源于本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA。表达也可指将mRNA翻译成多肽。这个过程包括表达的核苷酸、基因、或包括在细胞内多肽的功能存在的任何表现，没有限制，基因敲出以及瞬时表达和稳定表达。术语“过表达”如本文所用是指表达高于相同或相关多核苷酸或基因的内源性表达。如异源性多核苷酸或基因的表达高于可比的内源性基因，或高于以非过表达多核苷酸或基因方式导入的相同的多核苷酸或基因，则这种异源性多核苷酸或基因就是过表达的。例如，多核苷酸能在宿主细胞中以低拷贝数的质粒表达，其仅存在于非常有限或少数的拷贝中，并且相同的多核苷酸能在宿主细胞中以高拷贝数的质粒或能够被调控的拷贝数的质粒过表达，其以多个拷贝形式存在。任何方式都能用于过表达多核苷酸，只要它增加多核苷酸在宿主细胞中的拷贝。除了使用高拷贝数的质粒，或能调控拷贝数质粒，多核苷酸能通过染色体上多次整合而过表达。在重组宿主细胞中本发明的多肽的表达或过表达，能按照技术人员已知的任何数量的方法来量化，并且能以例如细胞总蛋白质百分数来表示。所述总蛋白质的百分数能大于细胞总蛋白质的约O. 001%的量；大于细胞总蛋白质的约O. 01% ;大于细胞总蛋白质的约O. 1% ;大于细胞总蛋白质的约O. 5% ;大于细胞总蛋白质的约 I. 0% ;大于细胞总蛋白质的约2. 0% ;大于细胞总蛋白质的约3% ;大于细胞总蛋白质的约4. 0% ;大于细胞总蛋白质的约5% ;大于细胞总蛋白质的约6. 0% ;大于细胞总蛋白质的约7. 0% ;大于细胞总蛋白质的约8.0% ;大于细胞总蛋白质的约9. 0% ;大于细胞总蛋白质的约10% ;或大于细胞总蛋白质的约20%。在一个实施方案中，多肽的表达量大于总细胞蛋白质的约O. 5%。在另一个实施方案中，多肽的表达量大于总细胞蛋白质的约I. O %或大于总细胞蛋白质的约2. 0%。如本为所用术语“转化”指转移核酸片段到宿主生物中，获得有选择或无选择的基因稳定遗传。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体。如本文所用，术语“质粒”和“载体”是指通常携带有不属于细胞中心代谢的部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这类元件可以是源自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或线性或环状的单链或双链DNA或RNA的核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已连接或重组进入一种独特构建体中，该独特构建体能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列与相应的3'末端非翻译序列一起引入细胞中。如本文所用术语“密码子简并性”是指在遗传密码中核苷酸序列允许变化的性质，这种变化不影响编码多肽中的氨基酸序列。技术人员非常了解具体宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。如它是指用于转化各种宿主的基因或编码区域的核酸分子，术语“密码子优化的”是指在基因或编码区域的核酸分子中的密码子改变，反映了在没有改变DNA编码的多肽情况下宿主生物典型的密码子使用情况。此类优化包括将至少一种、或多于一种、或显著的数目的密码子替换为在那种生物体中使用频率更高的一种或多种密码子。在包含编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列中的差异使得在编码所述基因的序列中发生突变。因为每个密码子由三个核苷酸组成，并且包含DNA的核苷酸限于四个特定碱基，有64个可能的核苷酸组合，它们中的61个编码氨基酸(剩余的三个密码子编码翻译终止信号)。示出哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文表I中示出。因此，许多氨基酸由多于一种密码子编码。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四个核苷酸三联体编码，丝氨酸和精氨酸由六个核苷酸三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一个核苷酸三联体编码。这种简并性允许DNA碱基组合发生广泛的改变，并且不改变由该DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。表I 准基因编码
权利要求
1.重组宿主细胞，包含 (a)编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和 (b)(i)在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代；和/或 ( )编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
2.权利要求I的重组宿主细胞，其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸 (a)包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒；或 (b)在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
3.重组宿主细胞，包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸，其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
4.重组宿主细胞，包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸，其中所述至少一种异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
5.权利要求I或2的重组宿主细胞，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自表8和9中基因的基因编码。
6.权利要求I或2的重组宿主细胞，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自表7中基因的基因编码。
7.权利要求5或6的重组宿主细胞，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、以及它们的组合的基因编码。
8.权利要求7的重组宿主细胞，其中所述多肽由组成型突变体多核苷酸编码。
9.权利要求8的重组宿主细胞，其中所述组成型突变体选自AFT1L99A、AFT1L102A、AFT1C291F、AFT1C293F、以及它们的组合。
10.权利要求I或2的重组宿主细胞，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、或 CCCl。
11.权利要求I或2的重组宿主细胞，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽为AFTl、AFT2、FRA2、或 CCCl。
12.权利要求I或2的重组宿主细胞，其中在编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的内源性基因中的至少一种缺失、突变、和/或取代选自FRA2、GRX3、CCC1、以及它们的组合。
13.权利要求I或2的重组宿主细胞，其中编码影响Fe-S簇生物合成的多肽的至少一种异源性多核苷酸选自AFT1、AFT2、以及它们的组合。
14.权利要求I的重组宿主细胞，其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸以多拷贝表达。
15.权利要求14的重组宿主细胞，其中所述至少一种异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
16.权利要求14的重组宿主细胞，其中所述至少一种异源性多核苷酸在所述重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
17.权利要求1、2、或5-16中任一项的重组宿主细胞，其中相比于具有内源性Fe-S簇生物合成的重组宿主细胞，所述Fe-S簇生物合成增加。
18.权利要求1-17中任一项的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
19.权利要求18的重组宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
20.权利要求1-19中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。
21.权利要求1-20中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以< 10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸，它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201，所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO :168。
22.权利要求1-21中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO :168或SEQ ID NO :232具有至少约90%的同一1f生。
23.权利要求1-22中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性 (a)大于对照宿主细胞的约5倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸； (b)大于对照宿主细胞的约8倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和 (c)大于对照宿主细胞的约10倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
24.权利要求1-22中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性(a)大于约O. 25U/mg ；(b)大于约O. 3U/mg ；(c)大于约O. 5U/mg ；(d)大于约I. OU/mg ；(e)大于约I. 5U/mg ；(f)大于约2. OU/mg ；(g)大于约3. OU/mg ；(h)大于约4. OU/mg ；(i)大于约5. OU/mg ；(j)大于约 6. OU/mg ；(k)大于约 7. OU/mg ；(I)大于约 8. OU/mg ；(m)大于约 9. OU/mg ；(η)大于约 10. OU/mg ； (o)大于约20. OU/mg ;和 (P)大于约 50. OU/mg ο
25.权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
26.权利要求25的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
27.制备产物的方法，包括 (a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞； (b)在产生所述产物的条件下，使(a)的重组宿主细胞与发酵培养基中的可发酵碳底物接触； 其中所述产物选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-I- 丁醇、3-甲基-I- 丁醇、异丁醇、以及它们的组合。
28.制备异丁醇的方法，包括 (a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞； (b)在产生异丁醇的条件下，使(a)的重组宿主细胞与发酵培养基中的可发酵碳底物接触。
29.用于将2，3-二羟基异戊酸转化成α-酮异戊酸的方法，包括 (a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主；以及 (b)使(a)的重组宿主细胞在2，3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸的条件下生长， 其中2，3-二羟基异戊酸被转化成α-酮异戊酸。
30.用于增加重组宿主细胞中的具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽的比活性的方法，包括 (a)提供权利要求1-24中任一项的重组宿主细胞；以及 (b)使(a)的重组宿主细胞在具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽以有功能的形式表达的条件下生长，所述有功能的形式具有大于缺乏所述异源性多肽的相同宿主细胞的比活性。
31.用于增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的方法，包括 (a)提供权利要求3-24中任一项的重组宿主细胞；以及 (b)使(a)的重组宿主细胞在所述宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量增加的条件下生长。
32.增加重组宿主细胞中的需Fe-S簇蛋白质的活性的方法，包括 (a)提供包含需Fe-S簇蛋白质的重组宿主细胞； (b)改变所述宿主细胞中影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性；以及 (C)使(b)的重组宿主细胞在需Fe-S簇蛋白质的活性增加的条件下生长。
33.权利要求32的方法，其中所述活性的增加量选自 (a)大于约10%； (b)大于约20%； (c)大于约30%； (d)大于约40%； (e)大于约50%； (f)大于约60%； (g)大于约70%； (h)大于约80%；(i)大于约90% ;和 (j)大于约95%。
34.权利要求32的方法，其中所述活性的增加量选自 (a)大于约5倍； (b)大于约8倍；和 (c)大于约10倍。
35.增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法，包括 (a)改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性； (b)测量异源性需Fe-S簇蛋白质的活性；以及 (C)比较在步骤(a)的多肽存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性与在步骤(a)的多肽不存在改变的表达或活性时测量的异源性需Fe-S簇蛋白质的活性， 其中所述异源性需Fe-S簇蛋白质活性的增加表明所述Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
36.增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的鉴定方法，包括 (a)改变影响Fe-S簇生物合成的多肽的表达或活性； (b)测量具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性；以及 (C)比较在步骤(a)的多肽的表达或活性存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性与在步骤(a)的多肽的表达或活性不存在改变时测量的具有二羟酸脱水酶活性的多肽的活性， 其中具有二羟酸脱水酶活性的多肽活性的增加表明所述Fe-S簇生物合成途径中的通量的增加。
37.权利要求30-36中任一项的方法，其中影响Fe-S簇生物合成的多肽的所述表达或活性改变包括缺失、突变、取代、表达、上调、下调、改变细胞定位、改变蛋白质的状态、和/或加入辅因子。
38.权利要求32-37中任一项的方法，其中所述需Fe-S簇蛋白质具有二羟酸脱水酶活性，并且其中所述具有二羟酸脱水酶活性的需Fe-S簇蛋白质具有以< 10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸，它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201，所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO 168o
39.权利要求32-38中任一项的方法，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由选自AFT1、AFT2、FRA2、GRX3、CCC1、以及它们的组合的基因编码。
40.重组宿主细胞，包含至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码由权利要求35-37中任一项的方法鉴定的多肽。
41.权利要求40的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
42.权利要求41的重组宿主细胞，其中所述编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的异源性多核苷酸以多拷贝表达。
43.权利要求41的重组宿主细胞，其中所述异源性多核苷酸包含高拷贝数的质粒或具有能够被调节的拷贝数的质粒。
44.权利要求41的重组宿主细胞，其中所述异源性多核苷酸在重组宿主细胞DNA中被整合至少一次。
45.权利要求35或36的方法，其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
46.权利要求45的方法，其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
47.权利要求28-39中任一项的方法，其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
48.权利要求47的方法，其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
49.权利要求40-44中任一项的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞为酵母宿主细胞。
50.权利要求49的重组宿主细胞，其中所述酵母宿主细胞选自糖酵母属、裂殖酵母属、汉逊酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、耶氏酵母属、伊萨酵母属和毕赤酵母属。
51.权利要求40-44或49-50中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达。
52.权利要求40-44或49-50中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的异源性多肽具有以< 10-5的E值匹配表12的序型HMM的氨基酸序列，其中所述多肽还包含全部三个保守的半胱氨酸，它们对应于变异链球菌DHAD酶的氨基酸序列中的位点56、129和201，所述变异链球菌DHAD酶对应于SEQ ID NO :168。
53.权利要求40-44或49-50中任一项的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞产生选自支链氨基酸、泛酸、2-甲基-I-丁醇、3-甲基-I-丁醇、异丁醇、以及它们的组合的产物。
54.权利要求53的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞产生异丁醇。
55.权利要求54的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含异丁醇生物合成途径。
56.权利要求1-22中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽具有选自下列的比活性 (a)大于对照宿主细胞的约3倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸；和 (b)大于对照宿主细胞的约6倍，所述对照宿主细胞包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸。
57.权利要求32的方法，其中所述活性的增加量选自 (a)大于约3倍；和 (b)大于约6倍。
58.权利要求1-22、40-44、或49-50中任一项的重组宿主细胞，其中所述具有二羟酸脱水酶活性的多肽的单体具有选自下列的Fe-S簇加载 (a)至少约10%； (b)至少约15%； (c)至少约20%； (d)至少约25%； (e)至少约30%；(f)至少约35%； (g)至少约40%； (h)至少约45%； ⑴至少约50% ； (j)至少约60% ； (k)至少约70% ； (I)至少约80% ； (m)至少约90% ;和 (η)至少约95%。
59.权利要求29的方法，其中相比于包含编码具有二羟酸脱水酶活性的多肽的至少一种异源性多核苷酸的对照宿主细胞，所述2，3-二羟基异戊酸至α -酮异戊酸的转化的增加量选自 (a)至少约5%； (b)至少约10%； (C)至少约15% ； (d)至少约20%； (e)至少约25%； (f)至少约30%； (g)至少约35%； (h)至少约40%； (i)至少约45%； (j)至少约50% ； (k)至少约60% ； (I)至少约70% ； (m)至少约80% ； (η)至少约90% ;和 (ο)至少约95%。
60.权利要求1、2、或5-26中任一项的重组宿主细胞，其中所述影响Fe-S簇生物合成的多肽由下列基因编码ARN1、ARN2、ATX1、CCC2、C0T1、ENB1、FET3、FET5、FIT1、FIT2、FIT3、FRE1、FRE2、FRE3、FRE4、FRE5、FRE6、FTH1、FTR1、HMX1、SIT1、SMF3、TIS11、VHT1、AFT1、AFT2、AM1、ARH1、ATM1、BUD32、CAD1、CCC1、CFD1、CIA1、CMK1、CTH1、CTI6、CYC8、DAP1、DRE2、ERV1、ESA1、FET4、FRA1、FRA2、GEF1、GGC1、GRX1、GRX2、GRX4、GRX5、HDA1、IBA57、ISA1、ISA2、ISU1、ISU2、JACl、MGEl、MRS3、MRS4、MSN5、NARl、NFSl、NFUl、NHP6a、NHP6b、PSEl、SMFl、SNFl、SNF2、SNF3、SNF4、SSQ1、HM12、TUP1、NP 011911. 1、VPS41、YAP5、YFH1、YRA1、ZPR1、iscAnif、nifU、nifS、cysEl、cysE2> iscS、iscU、iscA、hscB、hscA、Fdx> sufS、sufE> cysE3> sufS2> iscA2、Nfu、nfuA、nfuV> nfu、sufA、sufB、sufC、sufD、sufEl、sufS2、或 sufE2。
61.测量具有二羟酸脱水酶活性的多肽形式的浓度的方法，包括 (a)使用第一层析程序从粗提物中分离含所述多肽的级份； (b)使用第二层析程序从(a)中分离包含所述多肽的一种形式的级份；以及(C)测量(b)中获得的所述多肽的所述形式的浓度。·
全文摘要
本发明涉及重组宿主细胞，具体地为酵母细胞，其包含二羟酸脱水酶多肽。本发明还涉及具有增加的二羟酸脱水酶比活性的重组宿主细胞，比活性的增加是所述多肽表达的增加、细胞Fe-S簇生物合成的调制、或它们的组合的结果。本发明还包括使用所述宿主细胞的方法，以及用于鉴定增加宿主细胞中的Fe-S簇生物合成途径中的通量的多肽的方法。
文档编号C12N1/19GK102782119SQ201180010056
公开日2012年11月14日 申请日期2011年2月17日 优先权日2010年2月17日
发明者B.J.保罗, D.弗林特, R.W.叶 申请人:布特马斯先进生物燃料有限责任公司