专利名称：有效建立经诱导的多能干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及改善经诱导的多能干细胞(下文称为iPS细胞)的建立效率的方法和因此的试剂，更具体而言涉及使用GLIS家族的成员和Klf家族的成员改善iPS细胞的建立效率的方法和因此的试剂等。
背景技术：
近年来，小鼠和人iPS细胞已相继建立。Takahashi和Yamanaka通过将0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc基因转移到来自报道小鼠的成纤维细胞内诱导iPS细胞，其在所述报道小鼠中将新霉素抗性基因敲入到Fbxl5基因座内，并且迫使细胞表达该基因[Takahashi，K.和 Yamanaka，S.，Cell，126: 663-676(2006)]。Okita 等人成功建立了显示与胚胎干(ES)细胞的那些几乎相同的基因表达和后天修饰概况的iPS细胞(Nanog iPS细胞)，通过 产生具有绿色荧光蛋白(GFP)和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog的基因座内的转基因小鼠，所述Nanog的表达比Fbxl5的表达更局限于多能细胞中，迫使来自小鼠的成纤维细胞表达上述四种基因，并且选择其为嘌呤霉素抗性的细胞和GFP阳性细胞[Okita，K.等人，Nature,448: 313—317(2007)]。类似结果由其他团体获得[Wernig，Μ.等人，Nature，448:318-324(2007) ；Maherali,N.等人，Cell Stem Cell, I 55-70(2007)]。其后，揭示 iPS 细胞还可以用除c-Myc基因外的3种因子产生[Nakagawa, M.等人，Tfei. Biotethnol.，26··101-106(2008)]。此外，Takahashi等人[Takahashi，K.等k,Cell，131·. 861-872 (2007)]通过将与小鼠中使用的那些相同的4种基因引入人皮肤成纤维细胞内成功建立了 iPS细胞。另一方面，Yu等人使用Nanog和Lin28代替Klf4和c_Myc产生人iPS细胞[Yu, J.等人,Science,318: 1917-1920 (2007)] ο因此，已证实通过将限定因子转移到体细胞内，可以在人和小鼠中产生就多能性而言与ES细胞可比较的iPS细胞。自那以后，已作出广泛多样的尝试，以增加iPS细胞建立的效率，包括通过转移TERT和SV40大T抗原(称为人细胞永生化基因)连同四种因子0ct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc[Park, I. H.等k，Nature，451\ 141-146(2008)]建立的 iPS 细胞，伴随 Nanog和 Lin28 加入前述四种因子建立的 iPS 细胞[Liao，J.等k’Cell Research，18·. 600-603 (2008)]，和伴随UTFl加入前述四种或除c-Myc外的三种因子建立的iPS细胞[Zhao，Y.等人，CW7 StemCell，3·. 475-479(2008)]。然而，其中仍未达到良好改善的情况维持原状。发明概述
本发明人进行广泛研究，不仅在多能细胞例如ES细胞中特异性表达的基因中，还从更广泛范围的转录因子的基因文库中，寻找可以用于建立iPS细胞的基因作为用于Klf4的替代物。通过将属于GLIS家族的基因(例如GLIS1)、属于PTX家族的基因(例如PITX2)、或DMRT样家族B具有富含脯氨酸的C末端I基因(DMRTBl)，连同三种基因0ct3/4、Sox2和c-Myc —起转移到小鼠和人表皮成纤维细胞，本发明人因此成功地有效建立iPS细胞，并且将这些转录因子鉴定为能够在功能上取代Klf4的新核重编程物质(于2009年2月27日提交的美国临时申请号61/208，853，和于2009年9月8日提交的美国临时申请号61/276， 123)。接下来，本发明人研究与Klf4组合使用的这些Klf4替代因子GLISl、PITX2和DMRTBl对iPS细胞建立的作用。作为出乎意料的结果，当与Klf4组合时，PITX2和DMRTBl显示出完全无附加效应，而GLISl和Klf4的组合使用对小鼠和人细胞中的iPS细胞建立产生显著协同作用。本发明人基于这些发现进行进一步研究，并且已发展了本发明。相应地，本发明提供了下述
[I]改善iPS细胞建立效率的方法，其包括使下述(I)和(2)与体细胞接触
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。[2]根据上文[I]的方法，其中上文的物质⑴包括GLIS家族锌指I (GLISl)或编 码GLISl的核酸。[3]根据上文[I]或[2]的方法，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。[4]包含下述⑴和⑵的iPS细胞建立效率改进剂
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。[5]根据上文[4]的改进剂，其中上文的物质⑴包括GLISl或编码GLISl的核酸。[6]根据上文[4]或[5]的改进剂，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。[7]产生iPS细胞的方法，其包括使下述⑴、⑵和(3)与体细胞接触
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(3)通过与上文的物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。[8]根据上文[7]的方法，其中上文的物质(I)包括GLISl或编码GLISl的核酸。[9]根据上文[7]或[8]的方法，其中上文的物质⑵包括Klf4或编码Klf4的核酸。[10]根据上文[7] - [9]中任一项的方法，其中上文的核重编程物质(3)选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员、Nanog和编码其的核酸。[11]根据上文[7] - [9]中任一项的方法，其中上文的核重编程物质(3)包括0ct3/4或编码其的核酸。[12]根据上文[11]的方法，其中上文的核重编程物质(3)包括0ct3/4和Sox2或编码其的核酸。[13]根据上文[11]的方法，其中上文的核重编程物质(3)包括0ct3/4、Sox2和c-Myc或编码其的核酸。[14]用于来自体细胞的iPS细胞诱导的试剂，其包括下述⑴、⑵和(3):
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(3)通过与上文的物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。
[15]根据上文[14]的试剂，其中上文的物质⑴包括GLISl或编码GLISl的核酸。[16]根据上文[14]或[15]的试剂，其中上文的物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。[17]根据上文[14] - [16]中任一项的试剂，其中上文的核重编程物质(3)选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员、Nanog和编码其的核酸。[18]根据上文[14] - [16]中任一项的试剂，其中上文的核重编程物质(3)包括0ct3/4或编码其的核酸。[19]根据上文[18]的试剂，其中上文的核重编程物质(3)包括0ct3/4和Sox2或 编码其的核酸。[20]根据上文[18]的试剂，其中上文的核重编程物质(3)包括0ct3/4、Sox2和c-Myc或编码其的核酸。[21] iPS细胞，其包含下述(I)和(2):
(1)选自编码GLIS家族的成员的外源核酸的一种或多种核酸，
(2)选自编码Klf家族的成员的外源核酸的一种或多种核酸。[22]根据上文[21]的iPS细胞，其中将所述外源核酸整合到基因组中。[23]产生体细胞的方法，其包括处理根据上文[21]或[22]的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞。[24]产生体细胞的方法，其包括下述⑴和(2):
(1)通过根据上文[7]- [13]中任一项的方法产生iPS细胞的步骤，和
(2)处理通过上文步骤(I)获得的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞的步骤。[25]下述(I)和⑵改善iPS细胞建立效率的用途
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。[26]选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质改善iPS细胞建立效率的用途，其中该物质连同选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质一起与体细胞接触。[27]下述⑴、⑵和(3)产生iPS细胞的用途
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(3)通过与上文的物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。[28]下述(I)和(2)产生iPS细胞的用途
(1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，
(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，其中所述因子连同通过与上文的物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质一起与体细胞接触。[29] (I)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质产生iPS细胞的用途，其中所述物质连同(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质、和通过与上文的物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质一起与体细胞接触。[30]根据上文[21]或[22]的iPS细胞在产生体细胞中的用途。[31]根据上文[21]或[22]的iPS细胞，其中iPS细胞充当产生体细胞中的细胞来源。如上所述，本发明的iPS细胞建立效率改进剂能够显著改善来自体细胞的iPS细胞建立效率，并且因此在例如对于通过自体移植的人移植医学的应用中有用。附图简述
图I是显示用于通过功能缩小来自人Gateway 入门克隆(N. Goshima等人，Naturemethods, 2008)的入门克隆的步骤的示意图。
图2概述用于制备用于从转录因子的入门克隆筛选体细胞重编程因子的转录因子文库的程序。图3是通过借助于逆转录病毒将总共4种不同基因即3种基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和G06 (基因密码名称GLIS1)、H08 (基因密码名称DMRTB1)或HlO (基因密码名称PITX2)转移到Nanog-GFP小鼠表皮成纤维细胞内获得的GFP阳性集落形态的照相表示。“Klf-G6-1”指示通过转移G06(基因密码名称GLIS1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H8-2”指示通过转移H08(基因密码名称DMRTB1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H10-l”和“Klf-ΗΙΟ”指示通过转移H10(基因密码名称PITX2)连同3种基因获得的iPS细胞克隆。PO显示在集落建立时获得的照片；P1显示关于第一代(24个孔)的照片；P2显示关于第二代(6个孔)的照片。对于每组三张照片，左侧小图显示GFP阳性集落的图像，中间小图显示相位差图像，并且右侧小图显示GFP阳性集落图像和相位差图像的重叠照片。仅Klf-HlO-I通过Reseed方法建立，而其他通过MSTO方法建立。图4是在集落建立时，通过借助于逆转录病毒将总共4种不同基因即3种基因(0ct3/4、Sox2、c-Myc)和H)9(基因密码名称:IRX6)、G06(基因密码名称:GLIS1)、H08(基因密码名称DMRTB1)或HlO (基因密码名称PITX2)转移到Nanog-GFP小鼠表皮成纤维细胞内获得的GFP阳性集落形态的照相表示。“Klf-F9”指示通过转移R)9(基因密码名称IRX6)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-G6-l”和“Klf-G6-2”指示通过转移G06(基因密码名称GLIS1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf-H8-l”和“Klf-H8-2”指示通过转移H08(基因密码名称DMRTB1)连同3种基因获得的iPS细胞克隆；“Klf_H10”指示通过转移HlO (基因密码名称PITX2)连同3种基因获得的iPS细胞克隆。“Reseed”显示通过Reseed方法获得的结果；“MST0”显示通过MSTO方法获得的结果。图5 是关于 G6-1 (Klf-G6-1)、H8_2 (Klf-H8_2)和 HlO (Klf-HlO) iPS 细胞克隆的基因组PCR结果的照相表示，其中“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，并且“质粒”指示通过扩增整合到PMXs内的每种基因制备的阳性对照。图6是除图5中所示的那种外，对HlO (Klf-HlO) iPS细胞克隆的基因组PCR结果的照相表示。在图6中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞，并且“质粒”指示通过扩增整合到PMXs内的每种基因制备的阳性对照。图7 是关于 G6-l(Klf-G6-l)、H8-2 (Klf-H8_2)和 HlO (Klf-HlO) iPS 细胞克隆的RT-PCR结果的照相表示，其中“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞；“ES”和“iPS”指示小鼠ES细胞和iPS细胞；“Sox2 RT-”是阴性对照。图8是除图7中所示的那种外，对HlO (Klf-HlO) iPS细胞克隆的RT-PCR结果的照相表示。在该图中，“皮肤”指示用作体细胞来源的成纤维细胞；“ES”和“iPS”指示小鼠ES细胞和iPS细胞；“Sox2 RT-”是阴性对照。图9是计数通过将2种因子(0ct3/4、Sox2)或3种因子(0ct3/4、Sox2、Klf4)与G6 (GLISl)、H8 (DMRTBl)或HlO (PITX2)的组合转移到Nanog-GFP小鼠表皮成纤维细胞内建立的iPS细胞(GFP阳性细胞)集落的结果的图示。概括了三次(对于仅对照四次)独立实验的结果。
图10显示在感染后22天来自所示因子转导的皮肤成纤维细胞的Nanog-GFP阳性集落数目。图11显示在感染后22天来自所示因子转导的皮肤成纤维细胞的Nanog-GFP阳性集落比。该图表显示三次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。林p〈0.01。 图12显示来自皮肤成纤维细胞(PO ;第O代)的Nanog-GFP阳性集落。荧光图像(左侧)；相位差图像(中间)；合并图像(右侧)。图13显示在感染后20天来自所示因子转导的MEFs的Nanog-GFP阳性集落数目。在感染3天后，将成纤维细胞再种植到饲养细胞上。图14显示在感染后20天来自所示因子转导的MEFs的Nanog-GFP阳性集落比。该图表代表三次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。**: p〈0.01。图15显示来自MEFs (PO ;第O代)的Nanog-GFP阳性集落。荧光图像(左侧);相位差图像(中间)；合并图像(右侧)。图16是计数通过将3种因子(0ct3/4、Sox2、c_Myc)与Klf4和/或G6 (GLISl)的组合转移到成年表皮成纤维细胞(HDF)内建立的iPS细胞(ES样细胞)集落的结果的图示，其中“104”和“105”分别指示关于再种植到饲养细胞上的5 X IO4细胞/100 mm皿和5 X IO5细胞/100 mm皿的结果。概括了三次独立实验的结果。图17是计数通过将3种因子(0ct3/4、Sox2、c_Myc)与Klf4和/或G6 (GLISl)的组合转移到成年表皮成纤维细胞(HDF)内建立的非iPS细胞(非ES样细胞)集落的结果的图示，其中“ 104”和“ 105”分别指示关于再种植到饲养细胞上的5 X IO4细胞/100 mm皿和5X IO5细胞/100 mm皿的结果。概括了三次独立实验的结果。图18是由0ct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4和G6建立的iPS集落(ES样集落)的相位差图像的照相表示。图19显示在感染后约30天来自所示因子转导的人表皮成纤维细胞(上5 X IO4细胞，下5 X IO5细胞)的ESC样集落数目。图20显示在感染后约30天来自所示因子转导的人表皮成纤维细胞(上5 X IO4细胞，下5 X IO5细胞)的ESC样集落比。该图表显示三次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。*: ρ〈0·05;**: ρ〈0·01。图21显示通过OSK + GLISl生成的人ESC样集落。图22显示在建立的人iPS克隆中转导基因的基因组-PCR分析。AHDF :成年表皮成纤维细胞。图23显示在通过OSK + GLISl生成的人iPSCs中ESC-标记基因的RT-PCR分析。AHDF :成年表皮成纤维细胞；201B7 :通过OSKM生成的人iPS克隆。图24显示如通过DNA微阵列测定的，比较在由OSK + GLISl生成的iPSCs和成年HDFs之间(上)、和在OSK + GLISl转导的iPSCs和OSKM转导的iPSCs之间(下)的总体基因表达的散布图。计算关联系数(R2)。图25显示由OSK + GLISl生成的人iPSCs的畸胎瘤形成。图26显示在多种小鼠组织中GLISl的表达。从每种小鼠组织中分离的总RNA通过定量RT-PCR进行检查。该图表显示四次独立实验的平均值伴随标准差(误差条)。图27显示在暴露于GLISl shRNAs的皮肤成纤维细胞中内源GLISl的定量RT-PCR分析。该图表显示二次独立实验的平均值伴随平均误差(误差条)。图28显示GLISl shRNAs对通过3种重编程因子(OSK)的iPSC建立效率的作用。 在OSK连同或不连同GLISl ShRNA转导到皮肤成纤维细胞内后四周，计数Nanog-GFP阳性集落的数目。发明详述
本发明提供了改善iPS细胞建立效率的方法，其包括在体细胞的核重编程步骤中，使
(I)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，和(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质(下文也称为本发明的建立效率改善因子)与体细胞接触。因为体细胞核重编程通过使核重编程物质与体细胞接触来达到，所以本发明还提供了产生iPS细胞的方法，其包括使(3)通过与上文的物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质(下文也简称为核重编程物质)连同上文的物质(I)和(2) —起与体细胞接触。此处，其中iPS细胞不能单独由上文的物质(3)(核重编程物质)建立，但当核重编程物质连同本发明的iPS细胞建立效率改善因子一起与体细胞接触时可以建立的情况，也视为“建立效率的改善”。(a)体细胞的来源
除哺乳动物起源(例如人、小鼠、猴、牛、猪、大鼠、犬等)的生殖细胞外的任何细胞可以用作原材料用于在本发明中产生iPS细胞。例子包括角质化上皮细胞(例如角质化的表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如舌浅表的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如肾上腺髓质细胞)、用于代谢或贮存的细胞(例如肝细胞)、构成界面的内膜上皮细胞(例如I型肺泡细胞)、闭膜管的内膜上皮细胞(例如血管内皮细胞)、具有转运能力的具有纤毛的细胞(例如气道上皮细胞)、用于细胞外基质分泌的细胞(例如成纤维细胞)、收缩细胞(例如平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞)、感觉相关细胞(例如杆状细胞)、自主神经系统神经元(例如胆碱能神经元)、感觉器官和外周神经元的支持细胞(例如卫星细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如星形胶质细胞)、色素细胞(例如视网膜色素上皮细胞)、其祖细胞(例如组织祖细胞)等。不存在关于细胞分化程度，从其中收集细胞的动物年龄等的限制；甚至未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可以类似地用作本发明中的体细胞来源。未分化的祖细胞的例子包括组织干细胞(成体干细胞)例如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和牙髓干细胞。作为体细胞来源的哺乳动物个体的选择并无特别限制；然而，当获得的iPS细胞待用于人中的再生医学时，从预防移植物排斥的观点来看，从具有与患者那种相同或基本上相同的HLA类型的患者或另一个人中收集体细胞是特别优选的。如本文使用的，当它们移植到使用免疫抑制剂等的患者时，“基本上相同的HLA类型”意指供体的HLA类型与患者那种匹配至移植细胞(其已通过诱导衍生自供体的体细胞的iPS细胞分化获得)可以移入的程度。例如，它包括其中主要HLAs (例如HLA-A、HLA-B和HLA-DR的三个主要基因座)是等同的(下文将应用相同含义)等的HLA类型。当获得的iPS细胞不施用于(移植到)人，而是用作例如用于筛选评估患者的药物敏感性或不良反应的细胞来源时，同样希望从具有与药物敏感性或不良反应关联的相同遗传多态性的患者或另一个人中收集体细胞。在实施核重编程的步骤前，从哺乳动物中分离的体细胞可以根据细胞的选择使用本身已知适合于其培养的培养基进行预培养。此类培养基的例子包括但不限于，含有约5 - 20%胎牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI1640培养基、199培养基、F12培养基等。当转移试剂例如阳离子脂质体例如用于使体细胞接触本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质(如果需要的话，和下文提 及的另一种iPS细胞建立效率改进剂)时，有时优选培养基已替换为无血清培养基，以便预防转移效率减少。 (b)本发明的iPS细胞建立效率改善因子
在本发明中，GLIS家族是具有五个C2H2 (Cys2-His2-类型)锌指区的Kruppel样锌指家族，其以其与 Gli 转录因子[Glis= Gli 相似的，Kim，Y. S.等人，7； Biol. Chem. ,^77(34),30901-30913(2002)]的相似性命名。GLIS家族的成员为(membered)正或负控制在胚胎发育过程中多种基因的表达的转录因子。这个基因家族的成员例子包括但不限于GLIS家族锌指I (GLISl)、GLIS2、GLIS3等，其中优先给予GLISl。应当指出GLISl是在小鼠ES细胞中不表达的基因。尽管在本发明中使用的GLIS家族的成员可以是衍生自任选选择的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、猴、牛、马、猪、犬等)的细胞或组织[例如，胸腺、骨髓、脾、脑、脊髓、心脏、骨骼肌、肾、肺、肝、胰腺或前列腺的细胞或组织、其相应前体细胞、干细胞或癌细胞等]的蛋白质或编码其的核酸，优先给予衍生自人或小鼠细胞或组织的那些。关于人和小鼠起源的GLIS家族成员的氣基酸序列和cDNA序列的/[目息可以根据表I中所示的NCBI登记号获得。本领域技术人员基于cDNA序列信息能够容易地分离编码各自蛋白质的核酸，且根据需要产生重组蛋白质。表I
'.....iwt-w—[a...............................................................................................................................................................I..... +S................................................................................................................................................]
Cl臟I Λ|c_ Κι ΜI
GlJSlm MT 193 I NP B7I726 | NM Ι 722! NP 7175-1 |
侧 IIJ _:1) I 細 II M):2) I _ I 細 H) Ml4) |
GL1S2■ 032575 | NI* II59ti4_ ()3118.1NP 1124131 |
....................................................................... ......................................................................................i......................................................................................i......................................................................................』.......................................................................................!
GIJSlN\IJ l042<liS 丨 NDWlIOSTffi | MiJ75-159I与上文显示的每种氨基酸序列具有90%或更多、优选95%或更多、更优选98%或更多、特别优选99%或更多同一性，且具有与野生型蛋白质那种等价的iPS细胞建立效率改善效应的天然或人工突变蛋白质，和编码其的核酸，也可以用作本发明的iPS细胞建立效率改善因子。此处，在改善iPS细胞建立效率中的效应可以通过比较在其中仅指定重编程因子(例如2种因子Oct3/4和Sox’由2种因子和c-Myc组成的3种因子等)转移至体细胞的情况，和其中除转移重编程因子外，还使本发明的iPS细胞建立效率改善因子与体细胞接触的情况之间出现的iPS细胞集落数目加以验证。关于本发明的GLIS家族的成员和编码其的核酸，可以单独使用属于该家族的任何一种因子，或可以组合使用两种或更多种。Klf(KrUppel样因子)家族的成员为控制多种生物学过程的转录因子，所述生物学过程例如增殖、分化、发生和细胞凋亡[McConnell, B. B.等)κ，Bioassays，29··549-557 (2007)]，但其功能仍有待详细阐明。这个基因家族的成员例子包括但不限于Κ1Π、Klf2.Klf4.Klf5等，其中优先给予Klf4。如上所述，GLIS家族具有五个C2H2类型锌指区，而Klf家族具有三个C2H2类型锌指区。 Yamanaka等人假设相同四种基因(0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc)可以用属于相同各自家族的其他基因代替，并且显示即使当Klf4替换为Klfl、Klf2或Klf5时，iPS 细胞也可以建立[W0 2007/069666 Al ；Nakagawa, Μ.等人，Nat. Biotethnol. ,26:101-106 (2008)]。当ES细胞用视黄酸处理以诱导其分化时，不仅Klf4而且Klf2和Klf5减少其表达。注意到这个事实，Jiang等人的团体近来同时敲低Klf2、Klf4和Klf5，并且发现在ES细胞中诱导分化，显示Klf家族成员中的至少一些，例如Klf2和Klf5，可以在ES细胞中在功能上代替 Klf4[Jiang，J.等人，Nat. Cell Biol. ,10: 353-360(2008)]。他们继续将Klf2或Klf5基因或其他转录因子或后生调节因子连同三种基因0ct3/4、Sox2和c_Myc一起转移到MEF内，证实Klf2和Klf5可以代替Klf4，并且发现Esrrb，类似于雌激素受体的孤儿核受体，也能够代替 Klf4 [Feng, B.等人，Nat. Cell Biol. ,11 197-203(2009)]。这些发现导致Klfl、Klf2、Klf5和甚至Esrrb也具有在本文给出的实施例中证实的Klf4效应(与GLIS家族组合使用的iPS细胞建立效率的改善)的观念。尽管在本发明中使用的Klf家族的成员可以是衍生自任选选择的哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、猴、牛、马、猪、犬等)的细胞或组织[例如，胸腺、骨髓、脾、脑、脊髓、心脏、骨骼肌、肾、肺、肝、胰腺或前列腺的细胞或组织、其相应前体细胞、干细胞或癌细胞等]的蛋白质或编码其的核酸，优先给予人或小鼠起源的那些。关于人和小鼠起源的Klf家族成员的氣基酸序列和cDNA序列的/[目息可以根据表2中所示的NCBI登记号获得。本领域技术人员基于cDNA序列信息能够容易地分离编码各自蛋白质的核酸，且根据需要产生重组蛋白质。表2
+ 1人丨密—《' KI φκ
'名_— € )ΚΑ丨蛋『傾丨丨斷「喊
KlflNMJM)ft563I NP_ W554I N MJU 0β5I NP_#J4 65
weS MJ) 16270丨 NPJ)f73S4丨 MM」M 452丨 NPJB2478
Klf4NMJW4235I NPJMMJ26I NMJHOe |
I η IO \o.5i (SI O IO N()(>) !SI (,)11) MO (SKO Ι1>
Km丨 NP—_|72Ι丨 NMJ)097 | NPJI33S卿
与上文显示的每种氨基酸序列具有90%或更多、优选95%或更多、更优选98%或更多、特别优选99%或更多同一性，且具有与野生型蛋白质那种等价的iPS细胞建立效率改善效应的天然或人工突变蛋白质，和编码其的核酸，也可以用作本发明的iPS细胞建立效率改善因子。关于本发明的Klf家族的成员和编码其的核酸，可以单独使用属于该家族的任何一种因子，或可以组合使用两种或更多种。假设经历核重编程的体细胞以足以改善建立效率的水平内源表达GLIS家族的成员或Klf家族的成员中任何一个的组成成分中的一种或多种，其为本发明的上述iPS细胞建立效率改善因子，除去内源表达的组成成分仅剩余组成成分的组合也可以包括在本发明中的“iPS细胞建立效率改善因子”的范围中。以蛋白质形式的本发明的iPS细胞建立效率改善因子转移至体细胞可以使用本身已知用于蛋白质转移到细胞内的方法来达到。此类方法包括例如使用蛋白质转移试剂的方法，使用蛋白质转移结构域(PTD)或细胞穿透肽(CPP)融合蛋白的方法，显微 注射法等。蛋白质转移试剂是商购可得的，包括基于阳离子脂质的那些，例如BioPOTER蛋白质递送试剂(Gene Therapy Systems)、Pro-Ject 蛋白质转移试剂(PIERCE)和ProVectin(IMGENEX);基于脂质的那些，例如 Profect-1 (Targeting Systems);基于膜可穿透妝的那些，例如 Penetrain Peptide (Q biogene)和 Chariot Kit (Active Motif),利用HVJ包膜(灭活的日本血凝素病毒)的GenomONE (ISHIHARA SANGYO KAISHA,LTD.)等。转移可以根据与这些试剂附着的方案来达到，通常程序如下所述。将本发明的蛋白质的iPS细胞建立效率改善因子在合适溶剂(例如缓冲溶液例如PBS或HEPES)中稀释，加入转移试齐IJ，将混合物在室温温育约5 - 15分钟，以形成复合物，在将培养基更换为无血清培养基后，将这种混合物加入细胞中，并且将细胞在37°C温育一至数小时。其后，将培养基去除且替换为含血清培养基。开发的PTDs包括使用蛋白质的跨细胞结构域的那些，例如果蝇衍生的AntP、HIV衍生的 TAT(Frankel, A.等人，Cell 55,1189-93 (1988)或 Green, Μ. & Loewenstein,P. M. 1179-88(1988))、Penetratin (Derossi，D.等人，7； Biol. Chem. 269,10444-50(1994))、Buforin II (Park, C. B.等Proc. Natl Acad. Sci. USA 97，8245-50 (2000))、Transportan (Pooga, M. f^kFASEB J. 12,67-77 (1998))、MAP (模型两亲妝)(Oehlke, J. ^kBiochim. Biophys. Acta. 1414,127-39 (1998)) > K-FGF (Lin, Y.Z.等人7； Biol. Chem.之邓，14255-14258 (1995))、Ku70 (Sawada，M.等人舱iareBiol. 5", 352-7 (2003))、月元病毒(Lundberg, P.等)κ Biochem. Biophys. Res. Coimun.之划，85-90 (2002))、pVEC(Elmqui st，A.等 k Exp. Cell Res.之你，237-44 (2001))、Pep-I (Morris, M. C.等人Tfeiare Biotechnol. 19,1173-6 (2001)) > Pep-7 (Gao, C.等人Bioorg. Med. Chem. 10,4057-65 (2002)) > SynBl (Rousselle, C.等人Pharmacol.57,679-86 (2000)), HN-I (Hong, F. D. & Clayman, G L. Cancer Res.仰，6551-6 (2000))、和HSV衍生的VP22。衍生自PTDs的CPPs包括聚精氨酸例如I IR {Cell Stem Cell,4, 381-384(2009))和 9R(CW7 Stem CWA A 472-476 (2009))。制备掺入本发明的iPS细胞建立效率改善因子的cDNA和PTD序列或CPP序列的融合蛋白表达载体，并且使用该载体执行重组表达。将融合蛋白回收且用于转移。转移可以以与上文相同的方式执行，除了不加入蛋白质转移试剂外。显微注射，将蛋白质溶液置于具有约I μ m的尖端直径的玻璃针中且将溶液注射到细胞内的方法，确保蛋白质转移到细胞内。蛋白质转移的其他有用方法包括电穿孔、半完整细胞法[Kano,F.等人ifeiAotfe inMolecular Biology，第 >22 卷，357-365 (2006)]、使用 Wr_t 肽的转移[Kondo，E.等人，Cancer Ther. 3 (12)，1623-1630 (2004)]等。蛋白质转移操作可以执行一次或多次任选选择的次数(例如一次或多次至10次或更少、或一次或多次至5次或更少等)。优选地，转移操作可以重复执行两次或更多次(例如3次或4次)。关于重复转移操作的时间间隔是例如6 - 48小时，优选12 - 24小时。当强调iPS细胞建立效率时，优选本发明的iPS细胞建立效率改善因子不作为蛋 白质使用，而是以编码其的核酸的形式使用。核酸可以是DNA或RNA，并且可以是DNA/RNA嵌合体，其中优先给予DNA。核酸可以是双链或单链的。在双链的情况下，同样可以是双链DNA、双链RNA、或DNA/RNA杂交物。优选地，核酸是双链DNA，优选cDNA。本发明的基于核酸的iPS细胞建立效率改善因子可以根据常规方法，克隆自例如衍生自人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、猴、猪、犬等)的细胞或组织[例如，胸腺、骨髓、脾、脑、脊髓、心脏、骨骼肌、肾、肺、肝、胰腺或前列腺的细胞或组织、其相应前体细胞、干细胞或癌细胞等]的cDNA。本发明的iPS细胞建立效率改善因子转移至体细胞可以使用本身已知用于基因转移至细胞的方法来达到。将编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸插入包含能够在宿主体细胞中起作用的启动子的合适表达载体内。有用的表达载体包括例如病毒载体例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和仙台病毒、用于在动物细胞中表达的质粒(例如 pAl-1 l、pXTl、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo)等。待使用的载体的类型可以根据待获得的iPS细胞的预期用途适当选择。有用的载体包括腺病毒载体、质粒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。在表达载体中使用的启动子的例子包括EFla启动子、CAG启动子、SRa启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫洛尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等，其中优先给予EFl a启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SR a启动子等。需要时，除启动子外，表达载体还可以含有增强子、多腺苷酸化信号、可选标记基因、SV40复制起点等。可选标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因等。关于编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸，任何一种都可以单独整合到表达载体上，并且以组合的某些可以整合到一种表达载体上。此外，一种或多种核酸可以连同一种或多种重编程基因一起整合到一种表达载体上。在上述程序中，当本发明的iPS细胞建立效率改善因子和重编程因子的基因组合整合到一种表达载体时，这些基因可以优选经由使得多顺反子表达成为可能的序列整合到表达载体内。使用使得多顺反子表达成为可能的序列使得能够更有效地表达在一种表达载体中整合的多种基因。使得多顺反子表达成为可能的有用序列包括例如口蹄疫病毒的2A序列(SEQ ID NO:9 ；PLoS ONE 3，e2532，2008，Stem Cells 25，1707，2007)、IRES 序列(美国专利号4，937，190)等，其中优先给予2A序列。包含编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸的表达载体可以根据载体的选择通过本身已知的技术引入细胞内。在病毒载体的情况下，例如，将含有核酸的质粒引入合适的包装细胞(例如Plat-E细胞)或补充细胞系(例如293细胞)内，将在培养上清液中产生的病毒载体回收，并且通过适合于病毒载体的方法将载体感染至细胞。例如，使用逆转录病毒载体的特定方法公开于W02007/69666，6fe77，126,663-676 (2006)和Cell，131,861-872(2007)中。使用慢病毒载体的特定方法公开于1917-1920 (2007)中。当iPS细胞用作细胞来源用于再生医学时，本发明的iPS细胞建立效率改善因子的表达(再激活)或其中外源基因潜在整合的位点附近存在的内源基因的激活，增加由iPS细胞衍生的分化细胞再生的组织中癌发生的危险。因此，编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸优选是瞬时表达的，而不整合到细胞的染色体内。从这个观点来看，其整合到染色体内是罕见的腺病毒载体的使用是优选的。使用腺病毒载体的特定方法在^,945-949(2008)中描述。因为腺伴随病毒载体在整合到染色体内的频率中也是低的，并且就细胞毒性和炎症可诱导性而言低于腺病毒载体，所以它可以作为另一种优选载 体提及。因为仙台病毒载体能够稳定存在于染色体外，并且可以根据需要使用SiRNA降解且去除，所以它也是优选利用的。关于仙台病毒载体，可以使用7； Biol. Chem. ,282,27383-27391 (2007) ,/￥oc. Jpn. Acad.，Ser. S 滞，348-362 (2009)或 JP-B-3602058 中描述的那种。当使用逆转录病毒载体或慢病毒载体时，即使转基因的沉默已发生，它也可能变得再激活。因此，例如，可以优选使用当变得不需要时，其中编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸使用Cre-IoxP系统切掉的方法。即，具有预先安排在核酸两个末端上的IoxP序列，将iPS细胞诱导，其后使用质粒载体或腺病毒载体允许Cre重组酶作用于细胞，并且可以切掉由IoxP序列夹心的区域。因为LTR U3区域的增强子-启动子序列可能通过插入突变上调其附近的宿主基因，所以更优选避免通过基因组中剩余的IoxP序列外的LTR的内源基因的表达调节而不是切掉，使用通过缺失该序列制备的3’自灭活的(SIN)LTR，或用例如SV40的多腺苷酸化序列代替该序列。使用Cre-IoxP序列和SIN LTR的特定方法公开于Soldner 等人，CWA 964-977 (2009)，Chang 等人，汾e Cells,27\ 1042-1049(2009)
由
寸T O同时，作为非病毒载体，质粒载体可以使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等转移到细胞内。使用质粒作为载体的特定方法在例如Science，322,949-953 (2008)等中描述。当使用质粒载体、腺病毒载体等时，转染可以执行一次或多次任选选择的次数(例如一次至10次、或一次至5次等)。当将两个或更多个种类的表达载体引入体细胞内时，优选将这些所有种类的表达载体同时引入体细胞内；然而，即使在这种情况下，转染也可以执行一次或多次任选选择的次数(例如一次至10次、一次至5次等)，优选转染可以重复执行两次或更多次(例如3次或4次)。此外，当使用腺病毒或质粒时，转基因可以整合到染色体内；因此，最终需要通过DNA印迹或PCR证实基因插入染色体内的不存在。为此，如同上述Cre-IoxP系统，使用其中转基因整合到染色体内的方法可以是有利的，其后去除基因。在另一个优选模式的实施方案中，可以使用其中转基因使用转座子整合到染色体内的方法，其后使用质粒载体或腺病毒载体允许转座酶作用于细胞，以便从染色体中完全消除转基因。作为优选转座子的例子，可以提及piggyBac,衍生自鳞翅目昆虫的转座子等。使用piggyBac转座子的特定方法公开于 Kaji, K.等)k. Nature，458·. 771-775 (2009), Wolt jen 等人，yfeitfre，766-770(2009)中。另一种优选的非整合型载体是附加型载体，其能够在染色体外自复制。使用附加型载体的特定方法公开于Yu等K’Science’ 324, 797-801 (2009)中。需要时，通过将编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸插入具有IoxP序列的附加型载体内可以构建表达载体，所述IoxP序列以相同方向置于对于附加型载体复制必需的载体组成成分的5’和3’侧上，并且这可以转移至体细胞。
附加型载体的例子包括包含对于自复制所需的衍生自EBV、SV40等的序列作为载体组分的载体。对于自复制所需的载体组分通过复制起点和编码结合复制起点以控制复制的蛋白质的基因具体例示；例子包括用于EBV的复制起点oriP和EBNA-I基因、和用于SV40的复制起点ori和SV40大T抗原基因。附加型表达载体含有控制编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸转录的启动子。使用的启动子可以是如上所述的。需要时，附加型表达载体可以进一步含有如上所述的增强子、多腺苷酸化信号、选择标记基因等。选择标记基因的例子包括二氢叶酸还原酶基因、新霉素抗性基因等。除噬菌体Pl衍生的野生型IoxP序列(SEQ ID NO: 10)夕卜，在本发明中有用的IoxP序列包括，当以相同方向置于侧接对于转基因复制所需的载体组分的位置上时，能够通过重组缺失侧面为IoxP序列的序列的任选选择的突变型IoxP序列。此类突变型IoxP序列的例子包括在5’重复中突变的lox71(SEQ ID N0:11)、在3’重复中突变的lox66 (SEQ IDNO: 12)、以及在间隔物部分中突变的lOX2272和1οχ511。尽管置于载体组分的5’和3’侧上的两个IoxP序列可以是等同或不等同的，但在间隔物部分中突变的两个突变型IoxP序列必须是等同的(例如一对loX2272序列、一对1οχ511序列)。优先给予在5’重复中突变的突变型IoxP序列(例如1οχ71)、和在3’重复中突变的突变型IoxP序列(例如1οχ66)的组合。在这种情况下，由于重组在染色体上剩余的IoxP序列具有在5’侧和3’侧上在重复中的双重突变，并且因此不太可能由Cre重组酶识别，从而减少由于不需要的重组引起染色体中的缺失突变的危险。当突变型IoxP序列1οχ71和1οχ66组合使用时，各自可以置于上述载体组分的5’和3’侧的任何上，但突变型IoxP序列以这样的方向插入，从而使得突变位点将位于各自IoxP序列的外部末端是必需的。两个IoxP序列各自以相同方向置于对于转基因复制必需的载体组成成分(即复制起点、或编码结合复制起点以控制复制的蛋白质的基因序列)的5’和3’侧上。侧面为IoxP序列的载体组成成分可以是复制起点、或编码结合复制起点以控制复制的蛋白质的基因序列、或两者。附加型载体可以使用脂转染法、脂质体法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、基因枪法等引入细胞内。具体地，例如，可以使用在797-801(2009)中和其他地方描述的方法。
对于转基因复制所需的载体组分是否已从iPS细胞中去除可以通过执行DNA印迹分析或PCR分析加以证实，使用包含在载体组分中和/或在IoxP序列附近的核苷酸序列的核酸作为探针或引物，用从iPS细胞中分离的附加体部分作为模板，且测定条带的存在或不存在或所检测条带的长度。附加体部分可以通过本领域显而易见的方法进行制备；例如，可以使用在797-801(2009)中和其他地方描述的方法。(C)核重编程物质
在本发明中，“核重编程物质”指当转移至体细胞时，或当连同本发明的建立效率改善因子[(I)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，和(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质]一起与体细胞接触时，能够诱导由体细胞诱导iPS细胞的任何一种或多种物质，其可以由任何物质例如蛋白质因子或编码其的核酸(包括整合到载体中的形式)、或低分子化合物组成。作为其为蛋白质因子或编码其的核酸的已知核重编程物质，例如，下述组合是优选的(下文，仅显示关于蛋白质因子的名称)。(I) 0ct3/4> Klf4> c-Myc
(2)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2(Sox2可替换为 Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7 或 Soxl8 ；Klf4可替换为Klfl、Klf2或Klf5 ;c-Myc可替换为T58A (活性突变体)或L-Myc)
(3)0ct3/4、Klf4> c-Myc> Sox2、Fbxl5、Nanog、ERas> TclI
(4)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、SV40 大 T 抗原(下文 SV40LT)
(5)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT, HPV16 E6
(6)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT, HPV16 E7
(7)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT、HPV16E6、HPV16 E7
(8)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、TERT, Bmil
[对于关于上文所示因子的更多信息，参见WO 2007/069666 (对于关于在上文的组合
(2)中 Sox2 替换为 Soxl8 和 Klf4 替换为 Klfl 或Klf5 的信息,参见Tfeiare Biotechnology,26,101-106(2008));对于组合 “0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2”，还参 β Cell, 126,663-676(2006)，Cell, 2J2,861-872 (2007)等;对于组合 “0ct3/4、Klf2 (或 Klf5)、c-Myc,Sox2”，还参见舱i. Cell Biol. ,77,197-203(2009);对于组合“0ct3/4、Klf4、c_Myc、Sox2、hTERT、SV40 LT ”，还参见舱141-146(2008).]
(9)0ct3/4、Klf4、Sox2 (參% Nature Biotechnology, 26,101-106 (2008))
(10)0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28 (参见 Science, 318,1917-1920 (2007))
(11)0ct3/4、Sox2、Nanog、Lin28、hTERT、SV40LT(参见 Stem Ce I Is,26,1998-2005(2008))
(12)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Lin28(SMCW7Research 7^(2008)600-603)
(13)0ct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、SV40LT (参见 Stem Ce I Is, 26,1998-2005 (2008))
(14)0ct3/4、Klf4(参I Nature 454: 646-650 (2008) , Cell Stem Cell, 2,525-528(2008)))
(15)0ct3/4、c-Myc(参见舱iare 必￥: 646-650 (2008))
(16)0ct3/4、Sox2(参见舱141-146(2008)，W02008/118820)
(17)0ct3/4、Sox2、Nanog (参见 W02008/118820)
(18)0ct3/4、Sox2、Lin28 (参见 W02008/118820)(19)Oct3/4> Sox2、c-Myc> Esrrb (此处，Esrrb 可以用 Essrrg 代替，参见yfei· CellBiol.，77，197-203(2009))
(20)Oct3/4、Sox2、Esrrb (参见舱i. Cell Biol. , 77,197-203 (2009))
(21)Oct3/4、Klf4、L-Myc(参见 /"roc. Natl. Acad. Sci. USA., 107(32),14152-14157(2010))
(22)0ct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc, Lin28 (参见 W02011/016588)
(23)0ct3/4、Nanog
(24)0ct3/4(^77136 \ 411-419 (2009)、08436，在线公开的doi:10. 1038(2009)
(25)0ct3/4、Klf4、c-Myc,Sox2、Nanog、Lin28、SV40LT (参见 Science，324·.797-801(2009))
在上文的(1)-(25)中，0ct3/4可以替换为Oct家族的另一个成员，例如OctlA、0ct6等。Sox2(或Soxl、Sox3、Soxl5、Soxl7、Soxl8)可以替换为Sox家族的另一个成员，例如Sox7等。此外，假设c-Myc或Lin28包括在上文的组合(1)-(25)中作为核重编程物质，L-Myc或Lin28B可以分别代替c_Myc或Lin28使用。当上文的因子(1)-(25)的组合包括Klf家族的成员时，与本发明的iPS细胞建立效率改善因子组合使用的“核重编程物质”适当地是含有除Klf家族的这些成员外的因子的那种。当上文的组合(1)-(25)不包括Klf家族的成员时，与本发明的iPS细胞建立效率改善因子组合使用的核重编程物质可以是因子的组合。除上述核重编程物质外，进一步包含另一种任选选择的物质的组合也适当地用作本发明中的“核重编程物质”。假设经历核重编程的体细胞以足以引起核重编程的水平内源表达上文的(1)-(25)中任何一个的组成成分中的一种或多种，除去一种或多种组成成分的仅剩余组成成分的组合也可以包括在本发明中的“核重编程物质”的范围中。在这些组合中，例如选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员和Nanog中的一种或多种物质是优选的核重编程物质，其中更大的优先给予0ct3/4 和 Sox2 的组合，0ct3/4、Sox2 和 c_Myc 的组合，0ct3/4、Sox2 和 L-Myc 的组合，或0ct3/4、Sox2、L-Myc 和 Lin28 的组合。虽然促进iPS细胞的建立，但c-Myc还促进非iPS转化的细胞(部分重编程的细胞、无能(nullipotent)转化的细胞)的生成。本发明人不仅证实共表达GLISl与0ct3/4、Sox2和Klf4显著促进来自小鼠和人成年皮肤成纤维细胞的iPS细胞建立，还揭示与c-Myc不同，GLISl不促进非iPS转化的细胞的上述发生。因此，特别优选使用GLISl而不使用O-Myc0关于上述每种蛋白质因子的小鼠和人cDNA序列的信息根据WO 2007/069666 (在该出版物中，Nanog描述为ECAT4。关于Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg和L-Myc的小鼠和人cDNA序列信息可以分别通过参考下述NCBI登记号获得)中提及的NCBI登记号可获得；本领域技术人员能够容易地分离这些cDNAs。 基因名称小鼠人 Lin28 NM_145833 NM_024674 Lin28b NM_001031772 NM_001004317EsrrbNM_011934NM_004452
EsrrgNM_011935NM_001438
L-MycNM_008506NM_00103308I。用于作为核重编程物质使用的蛋白质因子可以通过下述进行制备将所获得的cDNA插入合适的表达载体内，将载体引入宿主细胞内，且从培养细胞或其条件化培养基中回收重组蛋白质因子。同时，当编码蛋白质因子的核酸用作核重编程物质时，将所获得的cDNA插入病毒载体、附加型载体或质粒载体内，其方式与本发明的基于核酸的iPS细胞建立效率改善因子的上述情况相同，以构建对其实施核重编程步骤的表达载体。需要时，也可以利用上述Cre-IoxP系统或piggyBac转座子系统。当编码两种或更多种蛋白质因子的两种或更多种核酸作为核重编程物质转移至细胞时，不同的核酸可以通过分开的载体携带，或多个核酸可以串联连接以获得多顺反子载体。在后面一种情况下，为了允许有效的多顺反子表达，希望将口蹄疫病毒的2A自切割肽插入核酸之间(参见例如，Science, 322,949-953,2008)。 当物质是蛋白质因子时，核重编程物质与体细胞的接触可以(a)以与本发明的上述蛋白质iPS细胞建立效率改善因子相同的方式达到，或当物质是编码蛋白质因子的核酸时，(b)以与本发明的上述基于核酸的iPS细胞建立效率改善因子相同的方式达到。(c)当核重编程物质是低分子化合物时，与体细胞的接触可以通过下述来达到将低分子化合物以合适浓度溶解于水性或非水溶剂中，将溶液加入适合于培养从人或其他哺乳动物中分离的体细胞的培养基[含有约5 - 20%胎牛血清(FCS)的最小必需培养基(MEM)、达尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、RPMI 1640培养基、199培养基、F12培养基等]中，从而使得核重编程物质浓度将落入足以引起体细胞中的核重编程且不引起细胞毒性的范围中，且将细胞培养给定时期。核重编程物质浓度取决于使用的核重编程物质种类而改变，并且适当地选择在约O. InM -约100 nM的范围上。接触的持续时间并无特别限制，只要它足以引起细胞的核重编程；通常，核重编程物质可以允许共存在于培养基中，直至阳性集落出现。(d)其他iPS细胞津立效率改讲剂
近年来，改善常规低的iPS细胞建立效率的多种物质已相继提出。当连同本发明的上述iPS细胞建立效率改善因子一起与体细胞接触时，其他iPS细胞建立效率改进剂预期进一步升高iPS细胞建立效率。其他iPS细胞建立效率改进剂的例子包括但不限于，除了 VPA外的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂[例如低分子抑制剂例如曲古抑菌素A(TSA)、丁酸钠、MC 1293和M344，基于核酸的表达抑制剂例如针对HDAC的siRNAs和shRNAs (例如HDACI siRNASmartpooI (Millipore)、针对 HDACl 的 HuSH 29 聚体 shRNA 构建体(OriGene)等)等]，蛋白质甲基转移酶抑制剂[例如5’ -氮杂胞苷(5’ -azaC) [Nat. Biotechnol. r26{l):795-797(2008)]，G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如低分子抑制剂例如BIX-01294 (CW7Stem Cell, 2·. 525-528 (2008))、基于核酸的表达抑制剂例如针对G9a的siRNAs和shRNAs [例如 G9a siRNA (人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等]，L-通道 |丐激动剂(例如 Bayk8644) [Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008) ]，p53 抑制剂[例如针对 p53的 siRNA、shRNA、显性失活突变体等{Cell Stem J, 475-479 (2008)) ；Nature 460，1132-1135 (2009)) ]，Wnt 信号传导激活物(例如可溶性 Wnt3a) [Cell Stem Cell, 3,132-135 (2008) ]，2i/LIF [2i是丝裂原激活蛋白质激酶信号传导和糖原合酶激酶_3的抑制剂，PloS Biology, 6 (10)，2237-2247 (2008) ]，ES 细胞特异性 miRNA[例如 miR-302-367徽(Mol. Cell. Biol. doi:10. 1128/MCB. 00398-08) ；miR-302 W (2008) 14: I - 10)；miR-291-3p、miR-294 和 miR-295 0Vat Biotechnol. 27: 459-461 (2009)]等。如上所述，基于核酸的表达抑制剂可以是容纳编码siRNA或shRNA的DNA的表达载体的形式。在核重编程物质的上述组成成分中，例如SV40大T也可以包括在iPS细胞建立效率改进剂的范围中，因为它们是对于体细胞的核重编程非必需的辅助因子。虽然核重编程的机制仍不明了，但除对于核重编程必需的因子外，辅助因子视为核重编程物质还是iPS细胞建立效率改进剂无关紧要。因此，因为体细胞核重编程过程视为起因于核重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂与体细胞接触的总体事件，所以它看起来不一定是对于本领域技术人员区分两者必需的。当改进剂分别是(a)蛋白质因子、(b)编码蛋白质因子的核酸、或(C)低分子化合物时，iPS细胞建立效率改进剂与体细胞的接触可以以与本发明的上述iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质相同的方式来达到。 iPS细胞建立效率改进剂包括本发明的iPS细胞建立效率改善因子可以与核重编程物质同时与体细胞接触，并且任何一种可以预先接触，只要与在不存在该物质的情况下获得的效率相比较，来自体细胞的iPS细胞建立效率显著改善。在一个实施方案中，例如，当核重编程物质是编码蛋白质因子的核酸并且iPS细胞建立效率改进剂是化学抑制剂时，在基因转移处理后将细胞培养给定时间长度后，iPS细胞建立效率改进剂可以加入培养基中，因为核重编程物质涉及从基因转移处理到蛋白质因子的大量表达的给定时滞长度，而iPS细胞建立效率改进剂能够快速作用于细胞。在另一个实施方案中，当核重编程物质和iPS细胞建立效率改进剂都以病毒或质粒载体的形式使用时，例如，两者可以同时引入细胞内。(e)通过培养条件改善津立效率
iPS细胞建立效率可以进一步通过在低氧条件下在用于体细胞的核重编程过程中培养细胞得到改善(参见CW7 Stem化77、5、第237-241页(2009))。如本文提及的，术语“低氧条件”意指在细胞培养时的环境氧浓度显著低于大气中的那种。特别地，可以提及涉及比在5-10% C02/95-90%空气气氛(其通常用于普通细胞培养)中的环境氧浓度更低的氧浓度的条件；例子包括涉及18%或更少的环境氧浓度的条件。优选地，环境氧浓度是15%或更少(例如14%或更少、13%或更少、12%或更少、11%或更少等)、10%或更少(例如9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少等)、或5%或更少(例如4%或更少、3%或更少、2%或更少等)。环境氧浓度优选是O. 1%或更多(例如O. 2%或更多、O. 3%或更多、O. 4%或更多等)、
O.5%或更多(例如O. 6%或更多、O. 7%或更多、O. 8%或更多、O. 95%或更多等)、或1%或更多(例如I. 1%或更多、I. 2%或更多、I. 3%或更多、I. 4%或更多等)。尽管可以使用在细胞环境中产生低氧状态的任何方法，但最容易的方法是在允许调整氧浓度的CO2温箱中培养细胞，并且这代表合适情况。允许调整氧浓度的CO2温箱是从多个制造商商购可得的(例如由 Thermo scientific, Ikemoto Scientific Technology,Juji Field, Wakenyaku制造的用于低氧培养的CO2温箱等)。在低氧条件下开始细胞培养的时间并无特别限制，只要与正常氧浓度相比较(20%)，iPS细胞建立效率未阻止得到改善。尽管培养可以在体细胞与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质接触前、或与接触同时或在接触后开始，但优选例如在低氧条件下的培养正好在体细胞与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质接触后、或在接触后的给定时间间隔[例如I - 10(例如2、3、4、5、6、7、8或9)天]后开始。在低氧条件下细胞培养的持续时间并无特别限制，只要与正常氧浓度相比较(20%)，iPS细胞建立效率未阻止得到改善；例子包括但不限于3天或更多、5天或更多、7天或更多或10天或更多、和50天或更少、40天或更少、35天或更少或30天或更少等的时期。在低氧条件下优选的培养持续时间取决于环境氧浓度而改变；本领域技术人员可以根据使用的氧浓度适当地调整培养的持续时间。在本发明的一个实施方案中，如果iPS细胞候选集落用药物抗性作为指数进行选择，那么优选在开始药物选择前从低氧条件恢复正常氧浓度。此外，用于在低氧条件下的细胞培养的优选开始时间和优选培养持续时间还取决于使用的核重编程物质的选择、在正常氧浓度下的iPS细胞建立效率等而改变。
(f)iPS细胞的选择和鉴定
在与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质(和另一种iPS细胞建立效率改进剂)接触前，细胞可以例如在适合于培养ES细胞的条件下进行培养。在小鼠细胞的情况下，用作为分化抑制因子的白血病抑制因子(LIF)加入普通培养基执行培养。同时，在人细胞的情况下，希望碱性成纤维细胞生长因子(LIF)和/或干细胞因子(SCF)代替LIF加入。通常，细胞在作为饲养细胞、用放射或抗生素处理以终止细胞分裂的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的共存下培养。通常，STO细胞等通常用作MEFs，但对于诱导iPS细胞，通常使用 SNL 细胞[McMahon，A. P. & Bradley, A. Cell 62，1073 - 1085(1990)]等。与饲养细胞的共培养可以在与本发明的iPS细胞建立效率改善因子和核重编程物质接触前、在接触时或在接触后(例如1-10天后)开始。iPS细胞的候选集落可以通过用药物抗性和报道分子活性作为指示剂的方法，并且还通过基于形态学的肉眼检测的方法进行选择。作为前者的例子，使用重组细胞选择对于药物抗性和/或报道分子活性阳性的集落，其中药物抗性基因和/或报道基因靶向在多能细胞中特异性高度表达的基因的基因座(例如Fbxl5、Nanog、0ct3/4等，优选Nanog或0ct3/4)。作为此类重组细胞的例子，可以提及其中β geo (其编码β -半乳糖苷酶和新霉素磷酸转移酶的融合蛋白)基因敲入Fbxl5基因基因座中的小鼠衍生的MEF和TTF (Takahashi & Yamanaka, 7激，663-676 (2006))，或其中绿色荧光蛋白(GFP)基因和嘌呤霉素抗性基因整合到Nanog基因基因座中的转基因小鼠衍生的MEF和TTF (Okita等人，tore，《S，313-317 (2007))等。同时，通过形态学的肉眼检查用于选择候选集落的方法包括例如由Takahashi等人在7J7，861-872 (2007)中描述的方法。尽管使用报道细胞的方法是方便和有效的，但当iPS细胞制备用于人治疗的目的时，通过肉眼检查的集落选择从安全性观点来看是希望的。所选集落的细胞作为iPS细胞的鉴定可以如上所述通过对于Nanog(或0ct3/4)报道分子的阳性应答(嘌呤霉素抗性、GFP阳性等)，以及通过可见ES细胞样集落的形成加以证实；然而，为了增加准确度，可以执行测试例如碱性磷酸酶染色，分析多种ES细胞特异性基因的表达，和将所选细胞转移至小鼠且证实畸胎瘤形成。
当编码本发明的iPS细胞建立效率改善因子的核酸转移至体细胞时，所获得的iPS细胞是不同于常规已知iPS细胞的新细胞，因为在其中含有外源核酸。特别地，如果当外源核酸使用逆转录病毒、慢病毒等转移至体细胞，那么外源核酸通常整合到所获得的iPS细胞的基因组中，从而使得含有外源核酸的特征稳定保留。(r)关于iPS细胞的使用应用
因此建立的iPS细胞可以用于多种目的。例如，通过利用就多能干细胞例如ES细胞而言报道的分化诱导的方法(例如分化诱导的方法包括对于神经干细胞在JP-A-2002-291469中描述的方法，对于胰腺干样细胞在JP-A-2004-121165中描述的方法，和对于造血细胞在JP-T-2003-505006中描述的方法；通过胚状体形成的分化诱导的方法包括在JP-T-2003-523766中描述的方法)，可以由iPS细胞诱导分化成多种细胞(例如心肌细胞、血细胞、神经细胞、血管内皮细胞、胰岛素分泌细胞等)。因此，使用从相同或基本上相同的HLA类型的患者或另一个人中收集的体细胞诱导iPS细胞将使得通过自体移植的干细胞疗法成为可能，其中iPS细胞分化成所需细胞(即，患者的受累器官的细胞，对疾病具有疗效的细胞等)，将其移植给患者。此外，因为认为由iPS细胞分化的功能细胞(例如肝 细胞)比相应的现有细胞系更好地反映在体内功能细胞的实际状态，所以它们还可以适当地用于体外筛选药物候选化合物的有效性和毒性等。本发明在下文借助于下述实施例进一步详细描述，然而，本发明决不限于下述实施例。
实施例参考实施例I :筛选新重编程因子
通过图I中所示的方法，广泛人基因的约20000个克隆基于由Goshima等人生成的人Gateway 入门克隆进行排序(使用由N. Goshima等人在舱iare eiAoofe, 2008中描述的文库；由Y. Maruyama等人在Acid Res. , 2009中公开的数据库)。具体地，针对用NCBI RefSeq登记的37900个序列(24200种基因)，对人Gateway 入门克隆中的含有全长ORF的约50000个克隆实施BLASTP搜索，其中标准是80%或更多的覆盖度和95%或更多的氨基酸同一性。因此构建由不涉及N类型和F类型各自中的序列重叠的约20000个入门克隆组成的子文库，所述N类型具有其在3’末端上的终止密码子，所述F类型缺乏终止密码子。这些约20000个排序的入门克隆通过生物信息学技术分类成蛋白质激酶、蛋白质磷酸酶、转录因子、GPCRs及其他克隆；构建由转录因子的入门克隆组成的子文库(覆盖超过50%的所有人转录因子)(图I)。如图2中所示，通过与pMXs-GW目的载体的LR反应对于来自转录因子的这个子文库的每个入门克隆制备表达克隆DNA。将这种反应液转移至大肠埃希杆菌(Escherichia coli)DH5 α，随后将其克隆以构建转录因子表达文库(用于重编程因子筛选的转录因子表达文库)。人0ct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc基因各自也整合到相同PMXs-Gff内，以构建各自的表达克隆。由这种DNA生成重组逆转录病毒且用于下述实验中。使用来自Nanog-GFP 小鼠[Okita 等k,Nature, 448, 313-317 (2007)]的表皮成纤维细胞执行诱导iPS细胞的实验。该实验使用两个系统进行涉及在用作饲养细胞的MSTO上的逆转录病毒感染的系统(用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞)[下文MSTO法，CWA 2激，663-676(2006)]，和涉及感染而不使用饲养细胞，随后为细胞再种植和在MSTO上的后续培养的系统[下文Reseed法，舱tore Biotech.，26，第101-106页(2008)]。对于第一次筛选，使用24孔板诱导iPS细胞。将Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞种植到明胶(Reseed法)或MSTO(MSTC^i)上。第二天，将成纤维细胞用由多种质粒制备的逆转录病毒感染(第O天)。具体地，将成纤维细胞用三种基因0ct3/4、SoX2和c-Myc和选自上述转录因子文库的一种基因以1:1:1:1的比感染。对于阴性对照，将成纤维细胞用三种基因0ct3/4、Sox2和c-Myc以1:1:1的比感染。对于阳性对照，将成纤维细胞用四种基因 0ct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 以 1:1:1:1 的比感染。将成纤维细胞用10% FBS/DMEM培养直至在感染后第2天，并且在第3天和以后用ES培养基[Cell, 126，663-676 (2006)]培养。当成纤维细胞最初种植到明胶(Reseed法)上时，在第3天时将它们再种植到MSTO上。其后，在每两天将培养基替换为相同培养基的新鲜供应的同时，在第21天时开始嘌呤霉素选择，并且在第28天时检查细胞。因此，GFP阳性集落在掺入连同三种基因一起转移的每种基因[样品F09 (基因密码名称IRX6)、样品G06 (基因密码名称GLIS1)、样品H08 (基因密码名称DMRTB1)、和样品HlO (基因密码名称PITX2)]的孔中出现，证实小鼠iPS细胞的建立。当再次使用6孔板尝试iPS诱 导时，GFP阳性集落同样出现；获得再现性。在集落形成和第一代和第二代时获得的GFP阳性iPS细胞集落的照片图像和相位差图像显示于图3和4中。这些结果证实这四种因子作为能够代替Klf4的新重编程因子的鉴定。当使用MEF (小鼠胚胎成纤维细胞)或HDF (人表皮成纤维细胞)代替成年小鼠皮肤成纤维细胞执行相同实验时，同样建立iPS细胞(GFP阳性集落)。参考实施例2 :建立的小鼠iPS细胞的分析
使用 Gentra Puregene Cell Kit (QIAGEN)提取基因组，并且使用 PCR 酶(Takara ExTaq)和在参考实施例I中建立的iPS细胞执行基因组-PCR。结果显示于图5和6中。在建立的所有iPS细胞中，证实在基因组上仅转基因的存在和在基因组上其他基因的不存在。对于G6-1克隆(基因密码名称GLIS1)，用于转移的c-Myc不插入基因组上(图5)。因为逆转录病毒载体直到插入基因组上才稳定表达，所以认为这个克隆G6-1已建立，具有仅三种因子0ct3/4、Sox2和GLISl的表达。接下来，使用Rever Tra Ace试剂盒(Takara)执行RT-PCR分析。结果显示于图7和8中。在参考实施例I中建立的所有iPS细胞表达ES细胞特异性标记基因Nanog、0ct3/4,Sox2,Rexl和ECATl。这些结果证实使用新重编程因子建立的细胞作为iPS细胞的鉴定。实施例I:用组合使用的G6和Klf4建立小鼠iPS细胞
(a)组合使用的G6和Klf4对小鼠iPS细胞的建立效率的作用
进行研究以测定当使用与Klf4组合的在参考实施例I中鉴定的G6(基因密码名称GLIS1)、H8(基因密码名称:DMRTB1)和HlO (基因密码名称:PITX2)(其为能够代替Klf4的新重编程因子)时，iPS细胞是否可以建立。使用如参考实施例I中的Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞通过Reseed法进行实验。用于基因转移的基因的组合显示于下文。(I) 0ct3/4、Sox2
(2)0ct3/4、Sox2、G6(基因密码名称GLIS1)
(3)0ct3/4、Sox2、H8(基因密码名称:DMRTBI)(4)0ct3/4、Sox2、H10(基因密码名称PITX2)
(5)0ct3/4、Sox2、Klf4
(6)0ct3/4、Sox2、Klf4、G6
(7)0ct3/4、Sox2、Klf4、H8
(8)Oct3/4、Sox2、Klf4、H10。通过将逆转录病毒载体(pMXs-0ct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-G6、pMXs-H8、pMXs-ΗΙΟ)分开转移至 Plat-E 细胞(Morita，S.等人，Gene Ther. 7,1063-1066)制备用于重编程的逆转录病毒，所述Plat-E细胞在前一天已经以2. 5 X IO6细胞/100 mm培养皿(Falcon)种植。使用的培养肉汤是DMEM/10% FCS [补充有10%胎牛血清的DMEM(Nacalaitesque)，并且细胞在37°C、5% CO2下培养。
为了促进载体转移，将27 μ L FuGene6转染试剂置于300 μ L Opti-MEM IReduced-Serum Medium(Invitrogen)中，并且允许细胞在室温静置5分钟。随后，加入9μ g每种表达载体，并且允许细胞在室温进一步静置15分钟，这之后将它们加入Plat-E培养肉汤中。在第2天时，将Plat-E上清液替换为培养基的新鲜供应。在第3天时，将培养上清液回收且通过O. 45 μ m无菌滤器(Whatman)过滤,并且将聚凝胺(Nacalai)以4 μ g/mL加入以获得病毒液体。通过从小鼠背/腹部皮肤中取出真皮，并且在明胶覆盖的皿上培养，获得使用的Nanog-GFP小鼠皮肤成纤维细胞。使用的培养肉汤是DMEM/10% FCS，并且将成纤维细胞以8. O X IO5细胞/皿种植至100 mm皿(Falcon)，并且在37 °C、5% CO2下培养。第二天，将每种逆转录病毒液体[上文的组合(1)-(8)中的任何]加入，以通过过夜感染转移基因。在病毒感染后第二天时，将逆转录病毒液体去除且替换为DMEM/10% FCS，并且使用DMEM/10% FCS培养细胞直至感染后第3天。在感染后第3天时，将培养基去除，并且通过加入10 mL PBS将细胞洗涤。在PBS去除后，将0. 25%胰蛋白酶/I mM EDTA(Invitrogen)加入，并且允许反应在37°C进行约5分钟。在细胞浮起后，通过加入ES细胞培养基[补充有15%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)、100 μ M非必需氨基酸(Invitrogen)、100 μ M 2-疏基乙醇(Invitrogen)、50 U/mL 青霉素(Invitrogen)和 50 Ug/mL 链霉素(Invitrogen)的DMEM(Nacalai Tesque)]将它们悬浮,并且种植至具有先前对其种植的饲养细胞的100 mm皿。使用的饲养细胞是用丝裂霉素C处理以终止其细胞分裂的SNL细胞[McMahon, A. P. & Bradley, A. CW7，62，1073 - 1085 (1990)]。在每两天将ES 细胞培养基替换为相同培养基的新鲜供应的同时，继续培养直至可见集落出现；在感染后26 - 28天，计数GFP阳性集落。三次独立实验的结果显示于表3和图9中(图9是表3中所示结果的图示；四次独立实验的结果仅对于对照显示)。"CU
权利要求
1.一种改善iPS细胞建立效率的方法，其包括使下述(I)和(2)与体细胞接触 (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。
2.根据权利要求I的方法，其中上文的所述物质(I)包括GLIS家族锌指I(GLISl)或编码GLISl的核酸。
3.根据权利要求I或2的方法，其中上文的所述物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。
4.一种iPS细胞建立效率改进剂，其包含下述(I)和(2): (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。
5.根据权利要求4的改进剂，其中上文的所述物质(I)包括GLISl或编码GLISl的核酸。
6.根据权利要求4或5的改进剂，其中上文的所述物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。
7.—种产生iPS细胞的方法，其包括使下述(I)、(2)和(3)与体细胞接触 (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (3)通过与上文的所述物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。
8.根据权利要求7的方法，其中上文的所述物质(I)包括GLISl或编码GLISl的核酸。
9.根据权利要求7或8的方法，其中上文的所述物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。
10.根据权利要求7- 9中任一项的方法，其中上文的所述核重编程物质(3)选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员、Nanog和编码其的核酸。
11.根据权利要求7- 9中任一项的方法，其中上文的所述核重编程物质(3)包括0ct3/4或编码其的核酸。
12.根据权利要求11的方法，其中上文的所述核重编程物质(3)包括0ct3/4和Sox2或编码其的核酸。
13.根据权利要求11的方法，其中上文的所述核重编程物质(3)包括0ct3/4、Sox2和C-Myc或编码其的核酸。
14.一种用于从体细胞的iPS细胞诱导的试剂，其包括下述(I)、(2)和(3): (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (3)通过与上文的所述物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。
15.根据权利要求14的试剂，其中上文的所述物质(I)包括GLISl或编码GLISl的核酸。
16.根据权利要求14或15的试剂，其中上文的所述物质(2)包括Klf4或编码Klf4的核酸。
17.根据权利要求14- 16中任一项的试剂，其中上文的所述核重编程物质(3)选自Oct家族的成员、Sox家族的成员、Myc家族的成员、Lin28家族的成员、Nanog和编码其的核酸。
18.根据权利要求14- 16中任一项的试剂，其中上文的所述核重编程物质(3)包括0ct3/4或编码其的核酸。
19.根据权利要求18的试剂，其中上文的所述核重编程物质(3)包括0ct3/4和Sox2或编码其的核酸。
20.根据权利要求18的试剂，其中上文的所述核重编程物质(3)包括0ct3/4、Sox2和C-Myc或编码其的核酸。
21.—种iPS细胞，其包含下述⑴和⑵ (1)选自编码GLIS家族的成员的外源核酸的一种或多种核酸， (2)选自编码Klf家族的成员的外源核酸的一种或多种核酸。
22.根据权利要求21的iPS细胞，其中将所述外源核酸整合到基因组中。
23.—种产生体细胞的方法，其包括处理根据权利要求21或22的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞。
24.一种产生体细胞的方法，其包括下述(I)和(2): (1)通过根据权利要求7- 13中任一项的方法产生iPS细胞的步骤，和 (2)处理通过上文的步骤(I)获得的iPS细胞，以诱导其分化成体细胞的步骤。
25.下述(I)和(2)改善iPS细胞建立效率的用途 (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质。
26.选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质改善iPS细胞建立效率的用途，其中所述物质连同选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质一起与体细胞接触。
27.下述⑴、⑵和(3)产生iPS细胞的用途 (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (3)通过与上文的所述物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质。
28.下述⑴和⑵产生iPS细胞的用途 (1)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质， (2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质，其中所述因子连同通过与上文的所述物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质一起与体细胞接触。
29.(I)选自GLIS家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质产生iPS细胞的用途，其中所述物质连同(2)选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质、和通过与上文的所述物质(I)和(2)组合能够由体细胞诱导iPS细胞的核重编程物质一起与体细胞接触。
30.根据权利要求21或22的iPS细胞在产生体细胞中的用途。
31.根据权利要求21或22的iPS细胞，其中所述iPS细胞充当产生体细胞中的细胞来 源。
全文摘要
提供的是改善iPS细胞建立效率的方法，其包括使选自GLIS家族的成员(例如GLIS1)和编码其的核酸的一种或多种物质、和选自Klf家族的成员和编码其的核酸的一种或多种物质与体细胞接触的步骤，可以通过该方法获得的、包含编码GLIS家族的成员或Klf家族的成员的外源核酸的iPS细胞，和通过诱导iPS细胞分化产生体细胞的方法。
文档编号C12N5/0735GK102782122SQ201180009618
公开日2012年11月14日 申请日期2011年2月16日 优先权日2010年2月16日
发明者五岛直树, 前川桃子, 山中伸弥, 望月宏美, 河村义史 申请人:国立大学法人京都大学, 日本生物信息协会, 独立行政法人产业技术综合研究所