得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)的淀粉酶及其使用方法

专利名称：得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)的淀粉酶及其使用方法
技术领域：
本发明所公开的是涉及得自涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia spp.)的淀粉酶的组合物和方法。
背景技术：
淀粉由直链淀粉(15-30%w/w)和支链淀粉(70-85%w/w)的混合物组成。直链淀粉由a -I, 4-连接的葡萄糖单元的直链组成，分子量(MW)为约60，000至约800，000。支链淀粉是每24-30个葡萄糖单元含有a -I, 6分支点的支链聚合物；其MW可高达一亿。浓缩右旋糖浆形式的得自淀粉的糖目前通过酶催化法制备，该方法涉及(1)用a -淀粉酶将固体淀粉液化(或降低粘度)成平均聚合度为约7-10的糊精，以及(2)用淀粉葡萄糖苷酶(也称为葡萄糖淀粉酶或GA)将所得的液化淀粉(即淀粉水解物)糖化。所得的糖浆具有高葡萄糖含量。大部分商业生产的葡萄糖浆随后通过酶法异构化为称为异糖浆(isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。a -淀粉酶(EC 3. 2. I. I)通过随机裂解内部a -I, 4_糖苷键而水解淀粉、糖原和相关的多糖。多年以来，a-淀粉酶已用于多种不同的目的，包括淀粉液化、纺织脱浆、造纸和纸浆行业的淀粉改性以及用于酿造。这些酶也可用于在盘碟洗涤和衣物洗涤中除去淀粉污溃。衣物和盘碟污垢在组成上有很大差异，并因此在被有效和高效除去的能力方面大不相同。涅斯捷连科氏菌属是归类为放线菌纲放线菌目微球菌亚目微球菌科的革兰氏阳性菌。在2004年首次描述的新疆涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia xinjianensis)从中国新疆省高盐土壤样品中分离得到(Wen-Jun Li et al. (2004) Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 54:837-41)(李文军等人，2004年，《国际系统与进化微生物学杂志》，第54卷第837-841页)。新疆涅斯捷连科氏菌不被认为是产淀粉酶杆菌。事实上，模式菌株的菌种描述指示该生物体的淀粉水解反应呈阴性，从而表明未产生或未分泌淀粉酶。

发明内容
本发明的组合物和方法涉及得自涅斯捷连科氏菌的阿尔法(a )-淀粉酶和相关的a -淀粉酶，它们在本文中统称为AmyNEST。在一个方面，提供了分离的AmyNEST多肽。在一些实施例中，AmyNEST多肽在异源生物体中表达。在特定的实施例中，AmyNEST多肽作为分泌的多肽在异源生物体中表达。在一些实施方案中，AmyNEST多肽与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。在一些实施例中，AmyNEST多肽与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含碳水化合物结合模块(CBM) 25 (I)和/或CBM 25(2)的氨基酸序列。在一些实施例中，AmyNEST多肽与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含与CBM 25 (I)和/或CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。在特定的实施例中，AmyNEST多肽包含与CBM 25(1)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列以及与CBM 25 (2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，在AmyNEST多肽中与CBM 25(1)和CBM 25 (2)相关的氨基酸序列通过连接基分隔开。在一些实施例中，提供了包含与序列标识号11的氨基酸序列具有至少60%氨基酸序列同一性的氨基酸序列的AmyNEST多肽。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一性。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。在特定的实施例中，该多肽与序列标识号11的氨基酸序列具有至少95%的氨基酸序列同一丨丨生。在一些实施例中，该多肽包含碳水化合物结合模块(CBM) 25 (I)的氨基酸序列(序列标识号12)和/或CBM 25(2)的氨基酸序列(序列标识号13)。在特定的实施例中，该多肽包含CBM 25(1)的氨基酸序列和CBM25(2)的氨基酸序列，这两者通过具有序列标识号19的氨基酸序列的连接基分隔开。在一些实施例中，该多肽具有a -淀粉酶活性，其可例如通过本文所述的检测分析法测定。在另一方面，提供了包含AmyNEST多肽的组合物。在一些实施例中，该组合物为清 洁组合物。在一些实施例中，该组合物有效除去衣物、盘碟或织物的淀粉污溃。在另一方面，提供了一种用于从表面除去淀粉污溃的方法，所述方法包括在存在包含有效量的AmyNEST多肽的水性组合物的情况下温育该表面，让多肽水解存在于淀粉污溃中的淀粉组分，以形成溶于水性组合物的较小的淀粉源分子，从而从该表面上除去淀粉污溃。在一些实施例中，该表面为纺织物表面。在一些实施例中，该表面在盘碟上。在一些实施例中，该表面为弄脏的硬质表面。在另一方面，提供了具有淀粉酶活性的多肽的表达方法，包括构建表达载体，该表达载体包含多核苷酸，该多核苷酸编码连接到编码AmyNEST多肽的多核苷酸的信号序列；
将该表达载体引入宿主细胞，表达该多肽；回收表达的多肽。在一些实施例中，将AmyNEST多肽引入异源宿主细胞。在一些实施例中，将AmyNEST多肽作为分泌多肽而表达。在另一方面，提供了包含编码AmyNEST多肽的多核苷酸序列的载体。编码AmyNEST多肽的序列可以可操作地连接到启动子或连接到其他控制元件。在另一方面，提供了包含编码AmyNEST多肽的多核苷酸的宿主细胞或包含这种多核苷酸的载体。分离的宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。分离的宿主细胞可以为杆菌(如枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B. Ientus)、短芽胞杆菌(B. brevis)、嗜热脂肪地芽抱杆菌(Geobacillus stearothermophiIus)(之前称为 Bacillus stearothermophilus)、嗜喊芽抱杆菌(B. alkalophilus)、解淀粉芽抱杆菌 (B. amyIoIiquefaciens)、凝结芽抱杆菌(B. coagulans)、环状芽抱杆菌(B. circulans)、B. lautus、苏云金芽抱杆菌(B. thuringiensis)、变铅青链霉菌(Streptomyces Iividans)、S. murinus 或大肠埃希氏菌(Escherichia coli))。另一方面构思了包含AmyNEST多肽的洗涤添加剂，其中该洗涤添加剂的形式任选地为不起尘颗粒、微粒、稳定化液体、凝胶或受保护的酶。洗涤添加剂中的多肽可为上述截短的多肽。该洗涤添加剂可含有每克洗涤添加剂约0.02mg至约200mg的多肽。该洗涤添加剂还可包含选自蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶以及任何它们的组合的酶。另一方面构思了包含任何所述洗涤添加剂的洗涤剂组合物。洗涤剂组合物可任选地包含如下的一种或多种物质表面活性剂、漂白体系或漂白剂、洗涤剂助洗剂、聚合物、稳定剂、织物调理剂、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐剂、染料、香料、污垢悬浮剂、晦暗抑制剂、荧光增白剂或杀菌剂。洗涤剂组合物可包含或进一步包含另外的酶，其中该酶为蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、氧化酶、淀粉分解酶、纤维素酶、聚酯酶或任何它们的组合。在其他实施例中，该组合物为洗涤添加剂。另一方面构思了包含AmyNEST多肽的手动或自动盘碟洗涤剂组合物。还有一方面构思了洗涤盘碟的方法，包括将本文所述的手动或自动盘碟洗涤剂施用到有需要的盘碟(一个或多个)上。洗涤盘碟的方法构思了添加盘碟洗涤剂的量使得洗涤液体包含本文所述多肽的量为约0. Olppm至约4ppm。另一方面构思了包含本文所述的洗涤添加剂的衣物洗涤剂组合物。还有一方面构思了清洁纺织物的方法，包括在具有本文所述的洗涤剂组合物的溶液中洗涤弄脏的纺织物。该方法还构思了在溶液中含有本文所述的多肽，其在溶液中的量为约0. 01至约2ppm。通过本发明的描述和附图，所述组合物和方法的这些方面和其他方面以及实施例将显而易见。


图I为载体pRANGER-BTB3_Cat的质粒图谱。图2为示出AmyNEST蛋白质组织的示意图，其示出了催化结构域和两个碳水化合物结合模块(CBM)。图3为考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶的图象，其示出60、50和27kDa处的三条主带。图4为pHPLT的质粒图谱。图5为pHPLT-AmyNEST的质粒图谱。图6 不出 CS-28 米淀粉微样本(microswatches)上的 AmyNEST 在 pH 8 (HEPES 缓冲液)下的清洁性能。
图7示出CS-28米淀粉微样本上的AmyNEST在pH 10 (CAPS缓冲液)下的清洁性倉泛。图8列出文中提到的序列。序列的简要说明序列标识号I为新疆涅斯捷连科氏菌B4. 2S6 16S rRNA基因的部分核苷酸序列。
序列标识号2为引物pRANGER-FW的核苷酸序列。序列标识号3为引物pRANGER-RV的核苷酸序列。序列标识号4为引物Nest-Insert3_RV的核苷酸序列。序列标识号5为引物Nest-Insert3_FW的核苷酸序列。序列标识号6为引物Nest-add-Fw的核苷酸序列。序列标识号7为新疆涅斯捷连科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶基因的核苷酸序列。序列标识号8为编码新疆涅斯捷连科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶成熟蛋白的核苷酸序列。序列标识号9为新疆涅斯捷连科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶前体蛋白的氨基酸序列，包括24-氨基酸信号序列。序列标识号10为新疆涅斯捷连科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶信号肽的氨基酸序列序列标识号11为新疆涅斯捷连科氏菌B4. 2S6 a -淀粉酶成熟蛋白的氨基酸序列。
序列标识号12为碳水化合物结合模块CBM 25 (I)的氨基酸序列。序列标识号13为碳水化合物结合模块CBM 25 (2)的氨基酸序列。序列标识号14为引物pHPLT-AmyNest-Fw的核苷酸序列。序列标识号15为引物pHPLT-AmyNest-Rv的核苷酸序列。序列标识号16为引物pHPLT-Fl的核苷酸序列。序列标识号17为引物pHPLT-Rl的核苷酸序列。序列标识号18为芽孢杆菌属物种(Bacillus sp. ) 195 a -淀粉酶未成熟形式的氨
基酸序列。序列标识号19为将CBM 25(1)与CBM 25(2)分隔开的连接基的氨基酸序列。
具体实施例方式描述了涉及从涅斯捷连科氏菌分离出来的a -淀粉酶及其变体和同源物的组合物和方法。这些多肽统称为AmyNEST多肽。将描述涉及AmyNEST多肽或编码这些多肽的多核苷酸的各种组合物和方法。I.定义和首字母缩略词
根据此详细描述，应用下面的缩写和定义。注意，除非上下文另有明确指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物。因此，例如，提及“一种酶”包括多个此种酶，而提及“该剂型”，包括提及一个或多个剂型以及本领域技术人员已知的其等同物，等
坐寸o除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。为了清楚起见，定义以下缩写和/或术语
I. I缩写/首字母缩略词除非另外指明，否则以下缩写/首字母缩略词具有以下含义AE醇乙氧基化物AEO醇乙氧基化物AEOS 醇乙氧基硫酸盐AES醇乙氧基硫酸盐AOSa -烯烃磺酸盐AS烧基硫酸盐CBD 25 碳水化合物结合结构域蛋白质家族25cDNA互补 DNACMC羧甲基纤维素DNA脱氧核糖核酸DTMPA 二亚乙基三胺五乙酸EC酶学委员会EDTA乙二胺四乙酸EMPA Eidgenossische Materialpriifungs-und Forschungs Anstalt (瑞士联邦材料检测与研究实验室)EO环氧乙烷(聚合物片段)F&HC 织物及家居护理GA葡萄糖淀粉酶IPTG 异丙基-P -D-硫代半乳糖苷kDa千道尔顿LAS直链烷基苯磺酸盐LAT属于地衣芽孢杆菌淀粉酶MW分子量MWU改良的伍格母单位；I. 6 X l(T5mg/MWU=活性单位NOBS 壬酰基氧基苯磺酸盐NTA次氨基乙酸OxAmPurastar HPAM 5000L (杰能科国际有限公司(GenencorInternational, Inc.))PEG聚乙二醇pi等电点PVA聚(乙烯醇)
PVP聚(乙烯吡咯烷酮)RNA核糖核酸SAS烷基磺酸盐SDS-PAGE十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳sp.物种TAED四乙酰基乙二胺w/v重量/体积w/w重量/重量
v/v体积/体积wt%重量 ％V摄氏度H2O水dH20或DI去离子水dIH20Milli-Q过滤的去离子水g 或 gm克Ii g微克mg毫克kg千克u L 和 u I微升mL 和 ml毫升mm毫米u m微米M摩尔mM毫摩尔UM微摩尔U单位sec 和"秒min 和'分钟h小时DO溶解氧Genencor位于加利福尼亚州帕罗奥图市的美国丹尼斯克有限公司杰能科子公司(Danisco US Inc, Genencor Division, Palo Alto, CA)Ncm牛顿厘米ETOH乙醇eq.当量N当量浓度ds或DS干固体含量I. 2 定义术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”是指除别的方面以外能够催化淀粉降解的酶。淀粉酶为裂解淀粉中a -D-(I — 4)0-糖苷键的水解酶。一般来讲，a -淀粉酶(EC 3. 2. I. I ；a -D- (I — 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定义为以随机方式在淀粉分子内裂解a -D- (I — 4)
0-糖苷键的内切酶。相反地，外切淀粉分解酶如￠-淀粉酶(EC 3.2. 1.2 ;a-D_(l —4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶如生麦芽糖a -淀粉酶(EC 3. 2. I. 133)从底物的非还原端裂解淀粉分子。P -淀粉酶、a -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1.20 ； a -D-葡糖苷葡萄糖水解酶)、葡萄糖淀粉酶(EC 3. 2. I. 3 ; a -D-(I — 4)-葡聚糖葡萄糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可由淀粉生成特定长度的麦芽低聚糖。如本文所用，术语“淀粉”指由植物的复杂多糖碳水化合物构成的任何材料，由具有式(C6HltlO5)x (其中X可以是任何数字)的直链淀粉和支链淀粉构成。该术语包括植物基材料，如谷物、草、块茎和根，并且更具体地讲是从小麦、大麦、玉米、裸麦、大米、高梁、糠、木薯、小米、马铃薯、甘薯和木薯获得的材料。 关于多肽的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失的天然存在的多肽。类似地，关于多核苷酸的术语“野生型”、“亲本”或“参考”是指不包括人为制造的核苷改变的天然存在的多核苷酸。然而，应注意，编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而涵盖编码野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的任何多核苷酸。关于多肽的术语“变体”是指不同于特定野生型多肽、亲本多肽或参考多肽的多肽，因为它在一个或多个氨基酸位置处包括人为制造的置换、插入或缺失。类似地，关于多核苷酸的术语“变体”是指核苷酸序列不同于特定野生型多核苷酸、亲本多核苷酸或参考多核苷酸的多核苷酸。野生型、亲本或参考多肽或多核苷酸的同一性从上下文来看将是显而易见的。当结合对象细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表明对象已通过引入异源核酸或蛋白质、或者变更天然的核酸或蛋白质而得到改性，或者细胞衍生自己经过此类改性的细胞。因此，例如，重组细胞表达未在天然(非重组)形式的细胞中发现的基因，或者以不同的水平或在不同于自然界中存在的条件下表达天然基因。术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指从如在自然界中发现的那样与其天然相关的至少一种其他物质或组分中移除的化合物、蛋白质(多肽)、细胞、核酸、氨基酸或其他指定的物质或组分。如本文所用，术语“纯化的”是指处于相对纯的状态的物质(如，分离的多肽或多核苷酸)，所述相对纯的状态如至少约90%纯、至少约95%纯、至少约98%纯或甚至至少约99%纯。结合酶的术语“热稳定的”和“热稳定性”是指酶在暴露于高温后保持活性的能力。酶(例如淀粉酶)的热稳定性是由其半衰期(t1/2)衡量的，所述半衰期以分钟、小时或天为单位给出，在此期间酶活性在限定的条件下损失一半。半衰期可通过测量暴露于(即经受)高温后残余的a-淀粉酶活性来计算。结合酶的“ pH范围”是指酶显示出催化活性的pH值范围。如本文所用，结合酶的术语“pH稳定的”和“pH稳定性”涉及在预定的时间段(如，15分钟、30分钟、I小时)内、酶在宽泛的pH值范围内保持活性的能力。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是同义词，并且可互换使用。在此类氨基酸序列表现出活性的情况下，它们可被称为“酶”。使用常规的氨基酸残基的单字母或三字母代码，其中氨基酸序列以标准的氨基端至羧基端取向(即，N — C)提供。术语“核酸”涵盖DNA、RNA、异源双链体和能够编码多肽的合成分子。核酸可为单链或双链的，而且可为化学修饰物。术语“核酸”与“多核苷酸”可互换使用。由于遗传密码具有简并性，故可以使用不止一个密码子来编码特定氨基酸，并且本发明组合物和方法涵盖编码特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作说明，否则核酸序列是以5’至3’取向提供。所谓“同源物”，应当指与对象氨基酸序列和对象核苷酸序列具有某种程度的同一性的实体。同源序列被认为包括与对象序列至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%相同的氨基酸序列，序列对比使用常规的序列对比 工具(如，Clustal、BLAST等)进行。通常，除非另外指明，否则同源物将包括与对象氨基酸序列相同的活性位点残基。如本文所用，“杂交”是指核酸碱基对的一条链与互补链在印迹杂交技术和PCR技术期间所发生的过程。严格的杂交条件如下所示50°C和0. 2X SSC (IX SSC=O. 15M NaCl,0. 015M柠檬酸三钠，pH 7.0)。高度严格的条件如下所示65°C和0. IX SSC(IX SSC=O. 15MNaCl，0. 015M 柠檬酸三钠，pH 7.0)。如本文所用，“合成”分子通过体外化学合成或酶促合成而生成、而非由生物体生成。如本文所用，结合细胞使用的术语“转化”、“稳定转化”和“转基因”意指包含整合到其基因组中或作为经多代保留下来的附加体而携带的非天然(如，异源)核酸序列的细胞。在将核酸序列插入细胞的情况下，术语“引入”意指本领域已知的“转染”、“转化”或“转导”。“宿主菌株”或“宿主细胞”为在其中表达所引入的载体、噬菌体、病毒或其他DNA构建体，包括编码所关注的多肽(如，AmyNEST多肽)的多核苷酸的生物体。示例性的宿主菌株为细菌细胞。术语“宿主细胞”包括由细胞形成的原生质体，例如芽孢杆菌属物种的原生质体。结合多核苷酸或蛋白质的术语“异源”是指并非天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。结合多核苷酸或蛋白质的术语“内源”是指天然存在于宿主细胞中的多核苷酸或蛋白质。如本文所用，术语“表达”是指基于核酸序列生成多肽的过程。该过程包括转录和翻译。“选择性标记”或“可选标记”是指这样的基因，其能够在宿主中表达以有利于选择携带该基因的宿主细胞。可选标记的实例包括(但不限于)抗微生物剂(如潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或赋予宿主细胞代谢益处(如营养益处)的基因。“载体”是指旨在将核酸引入一个或多个细胞类型中的多核苷酸序列。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、曬菌体颗粒、表达盒等等。“表达载体”是指包含编码所关注多肽的DNA序列的DNA构建体，所述编码序列可操作地连接到能够实现DNA在合适宿主中表达的合适控制序列。这种控制序列可包括实现转录的启动子、控制转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA上核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的增强子和序列。术语“可操作地连接”意指特定组分处于一种允许它们以预期的方式起作用的关系(包括但不限于并置)。例如，调控序列可操作地连接到编码序列，使得编码序列的表达受调控序列的控制。“信号序列”是连接到蛋白质的N-端部分的氨基酸的序列，其促进蛋白质细胞外分泌。细胞外蛋白质的成熟形式没有信号序列，其在分泌过程期间被切除。如本文所用，“生物活性”是指具有特定生物活性(例如酶活性)的序列。
“水硬度”是对存在于水中的矿物质(如，钙和镁)的量度。如本文所用，“包含AmyNEST淀粉酶(或AmyNEST多肽)的培养细胞材料”或者类似的语言是指包含AmyNEST多肽作为组分的细胞裂解液或上清液。细胞材料优选地来自在出于产生AmyNEST多肽的目的的培养物中生长的异源宿主。本文所引用的所有参考文献均据此全文以引用方式并入。2. AmvNEST淀粉酶核酸和多狀本发明组合物和方法的一个方面为从菌属涅斯捷连科氏菌菌种中获得的a-淀粉酶多肽，或者结构相关的多肽，其统称为AmyNEST淀粉酶或AmyNEST多肽。示例性的AmyNEST多肽从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4. 2S6中获得，并且具有序列标识号11的氨基酸序列。菌属涅斯捷连科氏菌在如Stackebrandt, E. et al. (1995) Int. J. Syst.Bacteriol.)45:682-92 (Stackebrandt, E.等人，《国际系统细菌学杂志》1995年第45卷第682-692页)中有所描述。另外的AmyNEST多肽与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4. 2S6获得的a -淀粉酶具有特定程度的氨基酸序列同一性。这种AmyNEST多肽包括天然存在的变体，包括人为制造的氨基酸置换、插入或缺失的变体，嵌合体和同源物。在一些情况下，这些AmyNEST多肽与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4. 2S6 (序列标识号11)获得的a -淀粉酶具有至少57%、至少 60%、至少 65%、至少 70%、至少 75%、至少 80%、至少 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97% 或 98%，或甚至至少 99% 的整体同源性 / 同一性。还有另外的AmyNEST多肽与从新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4. 2S6获得的a -淀粉酶具有特定程度的总体氨基酸序列同一性，同时包含新疆涅斯捷连科氏菌菌株B4. 2S6多肽的特定氨基酸序列。例如，AmyNEST多肽可与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含碳水化合物结合模块(CBM) 25 (I)(即序列标识号12)和/或CBM 25 (2)(即序列标识号13)的氨基酸序列。类似地，AmyNEST多肽可与序列标识号11具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的总体氨基酸序列同一性，同时包含与CBM 25(1)和/或CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。AmyNEST多肽也可包含与CBM 25(1)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列以及与CBM 25(2)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%序列同一性的氨基酸序列。与AmyNEST多肽中的CBM 25(1)和CBM 25⑵有关的氨基酸序列可通过连接基分隔开，如，与序列标识号19具有至少57%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%的氨基酸序列同一性。AmyNEST多肽可为包含信号序列的“全长”(“f I ”)、“未成熟”或者“前体”多肽、或者不含信号序列的“成熟”多肽。示例性的未成熟AmyNEST多肽具有序列标识号9的氨基酸序列，而示例性的成熟AmyNEST多肽具有序列标识号11的氨基酸序列。一般来讲，多肽的成熟形式活性最强，并且最适用于清洁和其他应用。
AmyNEST多肽可被截短，使得它们不含成熟形式的N或C-端。一个示例性的截短AmyNEST多肽不含C-端第二碳水化合物结合模块(CBM)(即CBM (2))，但保留了 N-端催化结构域。另一个示例性的截短AmyNEST多肽不含C-端CBM (S卩CBM⑴和CBM⑵)，但保留了 N-端催化结构域。相关的AmyNEST多肽不含CBM(2)，但保留了 CBM(I)和N-端催化结构域。不含一个或多个CBM的AmyNEST多肽可用于需要高催化转化量的地方，理想地可用于AmyNEST多肽的浓度与要水解的底物相比足够高以致CBM的存在不会对促进酶底物相互作用起关键作用的地方。类似地，AmyNEST多肽包含保留亲本AmyNEST多肽的a -淀粉酶活性特征的至少一部分的片段。优选的片段包含催化结构域的至少一部分。如上所述，AmyNEST多肽包括变体多肽，例如包含人为制造的置换的那些。示例性
的置换为保守性氨基酸置换，例如下表中列出的那些。
权利要求
1.一种分离的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少60%的氨基酸序列同一'丨生。
2.根据权利要求I所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少70%的氨基酸序列同一'丨生。
3.根据权利要求2所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少80%的氨基酸序列同一性。
4.根据权利要求3所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少90%的氨基酸序列同一性。
5.根据权利要求4所述的分离的多肽，与序列标识号11的所述氨基酸序列具有至少95%的氨基酸序列同一'丨生。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的多肽，包含碳水化合物结合模块(CBM) 25 (I)的所述氨基酸序列(序列标识号12)和/或CBM25 (2)的所述氨基酸序列(序列标识号13)。
7.根据权利要求6所述的分离的多肽，包含的CBM25(1)的所述氨基酸序列和CBM25(2)的所述氨基酸序列被具有序列标识号19的所述氨基酸序列的连接基分隔开。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的多肽，具有α-淀粉酶活性。
9.一种包含根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的组合物。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述组合物对于从衣物、盘碟或纺织物除去淀粉污溃是有效的。
11.根据权利要求9或10所述的组合物，还包含表面活性剂。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的组合物，其中所述组合物为洗涤剂组合物。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物为衣物洗涤剂或衣物洗涤剂添加剂。
14.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述组合物是人工或自动盘碟洗涤剂。
15.一种从表面除去淀粉污溃的方法，包括 在存在水性组合物的情况下温育所述表面，所述水性组合物包含有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的多肽， 让所述多肽水解存在于所述淀粉污溃中的淀粉组分，以形成溶于所述水性组合物的较小的淀粉源分子， 从而从所述表面上除去所述淀粉污溃。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述水性组合物还包含表面活性剂。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述表面是纺织物表面。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述表面在盘碟上。
19.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述表面是染污的硬质表面。
20.一种编码根据权利要求1-8中任一项所述的多肽的分离的多核苷酸。
21.根据权利要求20所述的分离的多核苷酸，与序列标识号8的所述多核苷酸具有至少90%的核苷酸序列同一'丨生。
22.—种包含根据权利要求20或21所述的多核苷酸的表达载体。
23. —种包含根据权利要求22所述的表达载体的宿主细胞。
全文摘要
本发明描述了涉及得自涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)和相关属菌种的α-淀粉酶的组合物和方法。
文档编号C12N9/28GK102782126SQ201180009998
公开日2012年11月14日 申请日期2011年1月20日 优先权日2010年2月18日
发明者B·E·琼斯, M·科尔克曼 申请人:丹尼斯科美国公司