神经调节蛋白拮抗剂及其在治疗癌症中的用途的制作方法

专利名称：神经调节蛋白拮抗剂及其在治疗癌症中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用神经调节蛋白拮抗剂治疗癌症。
背景技术：
癌症干细胞(CSC)的身份和特性在最近数年中已经是强烈研究的一个领域。肿瘤是具有不同生物学特性的细胞的异质混合物的证据在积累。已经对许多血液学恶性肿瘤和实体瘤报告了具有启动肿瘤生长的独特能力的截然不同的细胞群体的分离。然而，已经在 使用特定细胞表面标志物预期地鉴定CSC中出现不一致性。例如，已经对白血病、胰腺、结肠直肠、脑和乳腺癌报告了关于干细胞表型的根本不同的发现(综述见Brennan和Matsui2009)。此外，CSC频率的估算在肿瘤类型和患者中显著变化。CSC在维持已建立肿瘤的生长中或在化学疗法后在原发性或远距离部位再启动肿瘤中的作用仍然有待确定。对于大多数癌症患者，化学疗法后的疾病复发是死亡的一个主要原因。因而，需要更好地了解造成复发的肿瘤再启动细胞(TRIC)以更好地治疗在最初响应化学治疗处理后经历癌症复发的患者。这对于非小细胞肺癌(NSCLC)是特别相关的，因为大于三分之二的NSCLC患者不是手术切除的候选者。大多数患者以晚期疾病呈现，并且用化学疗法、放射或两种的组合治疗(Lung Cancer Principles and Practice)。然而,尽管对治疗的初始响应良好，局部晚期疾病的5年存活率仍然为23. 7%，而对于晚期疾病为3. 5%(Horner等SEER)。已经显示了经由过表达或激活突变的EGFR信号传导的脱调节(deregulation)是NSCLC中的一个频繁事件(综述见Dahabreh等，2010)。EGFR是HER酪氨酸激酶家族的原型成员，该家族包括EGFR (Herl)、Her2、Her3和Her4。Her2缺乏功能性配体结合域(Graus-Porta 1997),而Her3缺乏酪氨酸激酶活性(Guy 1994),因此这些受体必须以异二聚体起作用。最近的证据显示了其它Her家族成员也可以在NSCLC中发挥作用。然而，它们对疾病的贡献是不太充分表征的，并且研究经常聚焦于其与EGFR激活的相互作用(Kuyama等 2008，Hirsch 2009，Zhou 2006，Johnson 2006，Ding 2008)。神经调节蛋白是Her3和Her4受体酪氨酸激酶的一种配体。神经调节蛋白家族有4种已知的成员，即NRG1、NRG2、NRG3、和NRG4(Falls 2003)。NRGl转录物经历广泛的可变剪接，生成至少15种不同同等型。所有活性同等型共享对于活性必需且足够的EGF样域(Holmes 1992, Yarden 1991)。已经显示了 NRGl自分泌信号传导调节肺上皮细胞增殖(Jinbo 2002)，并且在人肺发育中发挥作用(Patel 2000)，而且牵涉NSCLC对EGFR抑制剂的不敏感性(Zhou2006)。需要提供在治疗抗性癌症和已经经历癌症复发的患者中有效的治疗剂。发明概述本发明的一个方面提供了一种延长癌症患者中的肿瘤复发前时间的方法，包括对所述患者施用有效量的神经调节蛋白拮抗剂。在一个实施方案中，该方法进一步包括对所述患者施用治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂是化学治疗剂或抗体。在某些实施方案中，化学治疗剂是帕利他塞(paclitaxal)或顺钼或帕利他塞和顺钼的组合。在某些实施方案中，抗体是EGFR、HER2、HER3、或HER4抗体。在某些实施方案中，患者患有的癌症是非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头和颈癌、宫颈癌、膀胱癌、食管癌、前列腺癌、或结肠直肠癌。在一个实施方案中，肿瘤复发前时间的延长比在没有所述神经调节蛋白拮抗剂的情况中的复发前时间大至少I. 25倍。在一个实施方案中，肿瘤复发前时间的延长比在没有所述神经调节蛋白拮抗剂的情况中的复发前时间大至少I. 50倍。在某些实施方案中，神经调节蛋白拮抗剂是抗体、小分子、免疫粘附素、或RNA。在一个实施方案中，神经调节蛋白拮抗剂是NRGl拮抗剂。在一个实施方案中，NRG拮抗剂是抗NRGl抗体。附图
简述图I :用于研究肿瘤再启动细胞(TRIC)的体内模型的图示。
图2A :无胸腺裸鼠中的Calu3人NSCLC异种移植物模型，其中化学疗法由帕利他塞和顺钼组成。数据以均值肿瘤体积土SEM呈现，n=12只小鼠/组。图2B :无胸腺裸鼠中的H441人NSCLC异种移植物模型，其中化学疗法由帕利他塞和顺钼组成。数据以均值肿瘤体积土SEM呈现，n=12只小鼠/组。图2C :具有肿瘤细胞对SCID/beiz小鼠乳房脂肪垫的正位移植的KPL4人乳房模型，其中化学疗法由帕利他塞组成。数据以均值肿瘤体积土SEM呈现，n=12只小鼠/组。图2D :用顺钼处理K-rasLSU12D，CAG_LSL_GFP遗传工程小鼠NSCLC模型。数据以每个肺的GFP阳性细胞的平均数土SEM呈现，n=6只小鼠/组。图3A :通过微阵列分析中的两种独立的探针证明NRGlmRNA在Calu3异种移植物模型的TRIC中富集。使用自独立的肿瘤样品分离的RNA通过针对NRGla和NRGlb的定量实时PCR(qPCR)验证富集。图3B :通过两种不同微阵列探针显示的NRGlmRNA在H441异种移植物模型的TRIC中的富集。这使用来自用于微阵列分析的相同肿瘤样品的RNA通过针对NRGla和NRGlb的qPCR验证。图3C :通过两种不同微阵列探针显示的NRGlmRNA在KPL4乳腺癌异种移植物模型的TRIC中的富集。图3D :通过一种微阵列探针显示并通过qPCR验证的NRGlmRNA在K-rasL^1211小鼠NSCLC模型的TRIC中的富集。图4 =NRGl富集对于残留细胞是特异的，如通过对化学疗法后各个大小和时间的肿瘤中的肿瘤细胞NRGlmRNA水平的qPCR分析证明的。图5A:图显示了在其随意的饮用水中施用媒介物(鹿糖)或dox(2gm/L)的具有已建立的Calu3-shNRGl异种移植物肿瘤的小鼠的肿瘤生长曲线。对肿瘤体积一周测量两次，持续整个研究。数据以线性混合效应(Linear Mixed Effect,LME)模型对肿瘤体积产生的拟合呈现，作为具有自动确定纽结(auto-determined knot)的三次样条(cubic splines)绘图。
图5B :图显示了用化疗+蔗糖或化疗+dox处理的具有已建立的Calu3_shNRGl异种移植物肿瘤的小鼠的肿瘤生长曲线。数据以LME模型对肿瘤体积产生的拟合呈现，作为具有自动确定纽结的三次样条绘图。图6A :图显示了用蔗糖或dox处理的具有已建立的H441_shNRGl异种移植物肿瘤的小鼠的肿瘤生长曲线U=12只/组)。数据以肿瘤体积的LME拟合分析呈现，作为具有自动确定纽结的三次样条绘图。图6B :图显示了用化疗+蔗糖或化疗+dox处理的具有已建立的H441_shNRGl异种移植物肿瘤的小鼠的肿瘤生长曲线(n=12只/组)。数据以肿瘤体积的LME拟合分析呈现，作为具有自动确定纽结的三次样条绘图。图7A :图显示了用蔗糖或dox处理的具有已建立的H1299_shNRGl异种移植物肿瘤的小鼠的肿瘤生长曲线(n=12只小鼠/组)。数据以肿瘤体积的LME拟合分析呈现，作为具有自动确定纽结的三次样条绘图。 图7B :图显示了用化疗+蔗糖或化疗+dox处理的具有已建立的H1299_shNRGl异种移植物肿瘤的小鼠的肿瘤生长曲线U=12只/组)。数据以肿瘤体积的LME拟合分析呈现，作为具有自动确定纽结的三次样条绘图。图8A :图显示了用媒介物+对照IgG (n=6)、顺钼+对照IgG (n=6)、或顺钼+HER4ECD-Fc (n=8)处理的LSL-K_rasG12D ；p53F1/+小鼠的平均肿瘤体积+/-SEM。豚草，对照鼠IgG2a抗体。图SB :图显示了通过治疗方案得到的肿瘤负荷的每日倍数变化及95%置信区间。图SC :图显示了用媒介物+对照IgG (n=10)、顺钼+对照IgG (η=11)、顺钼+HER4-ECD(η=8)或媒介物 +HER4-ECD(η=7)处理的 LSL-K_rasG12D ；p53F1/F1 小鼠的自基线的肿瘤负荷的平均百分比变化土 SEM。发明详述I.定义出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自人免疫球蛋白框架或如下文定义的人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间I:I相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致该抗体对抗原的亲和力改善。术语“抗NRG抗体”和“结合NRG的抗体”指能够以足够的亲和力结合NRG，使得抗体可用作靶向NRG中的诊断和/或治疗剂的抗体。在一个实施方案中，抗NRG抗体对无关的、非NRG蛋白的结合程度是抗体对NRG的结合的小于约10%，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合NRG的抗体具有彡ΙμΜ、彡100Κ IOnM,(InM、彡 O. InM、彡 O. OlnM、或彡 O. OOlnM(例如 10_8M 或更少，例如 10_8M 至 10_13M，例如 KT9M至I(T13M)的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗NRG抗体结合来自不同物种的NRG间保守的NRG表位。本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体结合的抗原的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’ _SH、F(ab’ )2 ;双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv);和由抗体片段形成的多特异性抗体。与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结·合阻断50%或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50%或更多。本文中提供了例示性的竞争测定法。术语“嵌合”抗体指其中的重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体。术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调节的生理状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤(例如，何杰金(Hodgkin)氏和非何杰金氏淋巴瘤)、母细胞瘤、肉瘤、和白血病。此类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、夕卜阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、白血病和其它淋巴增殖性病症、和各种类型的头和颈癌。抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。抗体有5大类IgA、IgD、IgE、IgGjP IgM，并且这些中的几种可以进一步分成亚类(同种型)，例如，IgG1, IgG2, IgG3、IgG4 JgA1、和IgA2。与不同类免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、Y、和μ。如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y9°、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素)；化学治疗剂或药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物喊类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin) C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂);生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤或抗癌剂。“效应器功能”指那些可归于抗体Fe区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。本文中的术语“Fe区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区一部分的C端区。该术语包括天然序列Fe区和变体Fe区。在一个实施方案中，人IgG重链Fe区自Cys226，或自Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fe区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定，Fe区或恒定区中的氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，又称作EU索弓I,如记载于Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991。“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个？1 域组成疋1 1、？1 2、？1 3、和？1 4。因而，HVR和FR序列在VH (或VL )中一般以如下的顺序出现:FR1-H1 (LI) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR4。 术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有基本上类似的结构或者具有含有如本文中所限定的Fe区的重链的抗体。术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或利用人抗体全集或其它人抗体编码序列自非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如KabatSequences of Proteins of Immunological Interest,第五版，NIH Publication91-3242，Bethesda MD (1991)，第1_3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组K I。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个可变域，其中所有或基本上所有HVR (例如，CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体，例如非人抗体的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。如本文中所使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR ;三个在VH中(HI、H2、H3)，且三个在VL中(LI、L2、L3)。HVR —般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识另U。例示性的高变环存在于氨基酸残基26-32 (LI) ,50-52 (L2) ,91-96 (L3) ,26-32 (Hl)、53-55 (H2)、和 96-101 (H3)。(Chothia 和 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。例示性的⑶R (⑶R-Ll、⑶R-L2、⑶R-L3、CTR-Hl、⑶R-H2、和⑶R-H3)存在于LI的氨基酸残基24-34、L2 的 50-56、L3 的 89-97、Hl 的 31-35B、H2 的 50-65、和 H3 的 95-102 (Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版Public Health Service,National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991))。除了 VH 中的 CDRl 夕卜，CDR 一般包含形成高变环的氨基酸残基。⑶R还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-⑶R，或a-⑶R的⑶R区内。例示性的a_⑶R(a_raR_Ll、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-Hl、a-CDR-H2、和 a_CDR-H3)存在于 LI 的氨基酸残基 31_34、L2的 50-55,L3 的 89-96,Hl 的 31_35B、H2 的 50-58、和 H3 的 95-102 (见 Almagro 和 Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))。除非另有指示，可变域中的HVR残基和其它残基(例如，FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子，包括但不限于细胞毒剂缀合的抗体。“个体”或“受试者”或“患者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如，人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体、受试者、或患者是人。 “分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95%或99%的纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，见例如 Flatman 等,J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)。“分离的”核酸指已经与其天然环境的组分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。“编码抗NRG抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或不同载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫化物键合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种类型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(λ)。术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信肩、O关于参照多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软 件。本领域技术人员可以决定用于比对序列的合适参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office, Washington D. C. , 20559),其中其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech, Inc. , South San Francisco,California可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4. OD上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算分数X/Y 乘 100其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。术语“药物配制剂”指处于如下的形式，使得容许其中含有的活性成分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。“药学可接受载体”指药物配制剂中与活性成分不同的，且对受试者无毒的成分。药学可接受载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。如本文中所使用的，术语“NRG”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如，小鼠和大鼠)的任何天然的神经调节蛋白(又称为调蛋白)，除非另有指示。该术语涵盖“全长”、未加工的NRG及源自细胞中的加工的任何形式的NRG。该术语还涵盖NRG的天然存在的变体，例如剪接变体或等位变体。存在着4种已知形式的NRG NRGl (Holmes，ff. E.等，Science 256:1205-1210(1992)) ；NRG2 (Caraway, K. L.等，Nature387:512-516(1997)) ；NRG3 (Zhang, E.等，Proc Natl Acad Sci USA94:9562-9567));和NRG4 (Harari,D.等，Oncogene 18:2681-2689))。由于可变剪接，受体结合需要的 NRGl EGF样域存在着两种活性同等型，称为NRGl阿尔法(NRG1 α )和NRGl贝塔(NRGP )。在Genbank登录号 ΒΚ000383 (Falls，D. L. , Ex Cell Res, 284:14-30 (2003)和美国专利 No. 5，367，060中显示了例示性的人NRGl的序列。如本文中所使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的NRG拮抗剂来延迟疾病的形成、减缓疾病的进展、预防复发、或延长肿瘤复发前时间。在某些实施方案中，治疗导致肿瘤再启动细胞的数目减少或完全缺乏；实体瘤中的肿瘤再启动细胞相对于肿瘤中不是肿瘤再启动细胞的细胞的数目减少；和/或抑制肿瘤再启动细胞的增殖。在某些实施方案中，用NRG拮抗剂的治疗导致比在没有用NRG拮抗剂治疗的情况中的肿瘤复发前时间大至少I. 25、I. 50、I. 75,2. O倍的肿瘤复发前时间延长。术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然 抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL) —般具有类似的结构,其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR) ο (见例如Kindt等Kuby Immunology,第6版，W. H. Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。见例如，Portolano 等，J. Immunol. 150:880-887 (1993) ; Clarkson 等，Nature352:624-628(1991)。如本文中所使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。II.组合物和方法本发明基于如下的发现，即NRG自分泌信号传导在原本化学敏感的肿瘤中在化学疗法后在一小群肿瘤细胞的存活和增殖中发挥重要的作用。这些存活的肿瘤细胞(在本文中称为“肿瘤再启动细胞”，或“TRIC”)负责其癌症先前用治疗剂治疗的患者中的癌症的复发(relapse)和再现(recurrence)。在一个实施方案中,用于治疗患者的治疗剂是化学治疗剂。在另一个实施方案中，用于治疗患者的治疗剂是抗原结合剂，诸如抗体或其片段。抑制NRG信号传导导致延迟或预防用治疗剂治疗后的肿瘤复发或再现。因而，本发明的一方面提供了抑制NRG诱导的信号传导的NRG拮抗剂。在一个实施方案中，NRG拮抗剂是NRGl拮抗剂。NRG拮抗剂在治疗癌症及预防抗性和/或用治疗剂治疗后的癌症再现中得到应用。本发明的另一方面提供了通过对患者施用NRG拮抗剂预防患者中对用治疗剂治疗的抗性的方法。本发明的另一方面提供了通过对患者施用NRG拮抗剂预防用治疗剂治疗后癌症再现。本发明的又一方面提供了表征TRIC的模型。如实施例和附图中描述的，此模型包含如下的细胞，其显示对处理的强力响应，导致显著的肿瘤消退，接着是在停止处理后疾病复发。该模型在筛选可以用于靶向TRIC的化合物及测定TRIC的分子基础中得到应用。
具体的方面包括预防肿瘤复发或延长肿瘤复发前时间的方法，包括对患者施用有效量的NRG拮抗剂。在一个实施方案中，已经用治疗剂，诸如化学治疗剂或抗原结合剂，诸如抗体治疗患者。在一个实施方案中，癌症包含肿瘤再启动细胞。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，用化学治疗剂治疗患者。在一个实施方案中，化学治疗剂是作为癌症的护理治疗标准使用的药剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是帕利他塞(paclitaxal)或顺钼或帕利他塞和顺钼的组合。在一个实施方案中，化学治疗剂不是酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实施方案中，化学治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是EGFR、HER2、HER3和/或HER4抑制剂。另一个实施方案另外包括与NRG拮抗剂组合对患者施用化学治疗剂。在另一个实施方案中，用抗体治疗患者。在一个实施方案中，抗体是抗酪氨酸激酶抗体。在一个实施方案中，抗体是EGFR、HER2、HER3和/或HER4抗体。另一个实施方案另外包括与NRG拮抗剂组合对患者施用抗体。在某些实施方案中，肿瘤复发前时间比在没有神经调节蛋白拮抗剂的情况中的肿 瘤复发前时间大至少 I. 25,1. 50,1. 75,2. 0,2. 5,5. 0、10、20 或 50 倍。另一方面提供了治疗具有抗性癌症的患者的方法，包括对患者施用有效量的NRG拮抗剂。在一个实施方案中，癌症包含肿瘤再启动细胞。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，癌症对用化学治疗剂治疗有抗性。在一个实施方案中，癌症对用帕利他塞或顺钼或帕利他塞和顺钼的组合治疗有抗性。在一个实施方案中，癌症对用酪氨酸激酶抑制剂治疗有抗性。在一个实施方案中，癌症对用EGFR、HER2、HER3和/或HER4抑制剂治疗有抗性。另一个实施方案另外包括对患者施用化学治疗剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是帕利他塞或顺钼或帕利他塞和顺钼的组合。在一个实施方案中，化学治疗剂是EGFR、HER2、HER3和/或HER4抑制剂。在一个实施方案中，癌症对用治疗性抗体治疗有抗性。在一个实施方案中，癌症对用EGFR、HER2、HER3、或HER4抗体治疗有抗性。另一个实施方案另外包括对患者施用抗体。在一个实施方案中，抗体是曲妥单抗(trastuzumab)或帕妥珠单抗(pertuzumab)。另一方面提供了预防癌症中的抗性的方法，包括对具有癌症的患者施用有效量的NRG拮抗剂和治疗剂。在一个实施方案中，癌症包含肿瘤再启动细胞。在一个实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，癌症对用化学治疗剂治疗有抗性。在一个实施方案中，癌症对用帕利他塞或顺钼或帕利他塞和顺钼的组合治疗有抗性。在一个实施方案中，化学治疗剂不是酪氨酸激酶抑制剂。在另一个实施方案中，化学治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是EGFR、HER2、HER3和/或HER4抑制剂。另一个实施方案另外包括对患者施用化学治疗剂。在一个实施方案中，化学治疗剂是帕利他塞或顺钼或帕利他塞和顺钼的组合。在一个实施方案中，癌症对用治疗性抗体治疗有抗性。在一个实施方案中，癌症对用EGFR、HER2、HER3、或HER4抗体治疗有抗性。另一个实施方案另外包括对患者施用抗体。在一个实施方案中，抗体是曲妥单抗或帕妥珠单抗。在治疗性用途的这些方法中，NRG拮抗剂是抗体、小分子、免疫粘附素、或RNA。在一个实施方案中，NRG拮抗剂是NRGl拮抗剂。在一个实施方案中，NRG拮抗剂是抗NRGl抗体。
在又一方面，本发明提供了神经调节蛋白拮抗剂在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，使用神经调节蛋白拮抗剂，或用神经调节蛋白拮抗剂制造的药物来延长患者中的肿瘤复发前时间。在另一个实施方案中，使用神经调节蛋白拮抗剂，或用神经调节蛋白拮抗剂制造的药物来治疗具有对治疗剂有抗性的癌症的患者。A. NRG 拮抗剂可用于本发明方法的NRG拮抗剂包括特异性结合NRG的多肽，NRG抗体(抗NRG抗体)，RNA，诸如RNAi、siRNA, shRNA等，小分子，受体分子和衍生物，诸如免疫粘附素(其特异性结合NRG)(见例如美国专利6，696，290和7，659，368、美国公开文本2010055093和20100278801)和融合蛋白。NRG拮抗剂还包括NRG多肽的拮抗性变体、针对NRG的RNA适体和肽体(peptibody)。下文描述了这些中每种的例子。在一个实施方案中，NRG拮抗剂是NRGl拮抗剂。在其它实施方案中，NRG拮抗剂是NRG2、NRG3、或NRG4拮抗剂。I.抗体 可用于本发明方法的抗NRG抗体包括以足够的亲和力和特异性结合NRG，而且可以降低或抑制NRG信号传导的任何抗体。NRG抗体记载于W01992020798、美国专利No. 6，953，842、和美国专利 No. 6，252，051。a)杭体亲和力在某些实施方案中，本文中提供的抗体具有彡ΙμΜ、彡IOOnM, ^ IOnM, ^ InM,(O. InM、彡 O.OlnM、或彡 O. OOlnM (例如 1(Γ8Μ 或更少，例如 1(Γ8Μ 至 10_13M，例如，10_9M 至I(T13M)的解离常数(Kd)。在一个实施方案中，Kd是通过如下述测定法所述用Fab型式的感兴趣抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在未标记抗原的滴定系列的情况中用最小浓度的(125I)标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(见例如Chen等，J. Mo I.Biol. 293:865-881 (1999))。为了建立测定法的条件，将MICROTITER 多孔板(ThermoScientific)用 50mM 碳酸钠(pH 9. 6)中的 5 μ g/ml 捕捉用抗 Fab 抗体(Cappel Labs)包被过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白于室温(约23° C)封闭2-5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将IOOpM或26pM125I_抗原与连续稀释的感兴趣Fab (例如与Presta 等，Cancer Res. 57:4593-4599(1997)中抗 VEGF 抗体，Fab-12 的评估一致)混合。然后将感兴趣的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板，于室温温育(例如I小时)。然后除去溶液，并用PBS中的O. 1%聚山梨酯20 (TWEEN-20 )洗板8次。平板干燥后，加入150 μ I/孔闪烁液(MICR0SCINT-20 ; Packard)，然后在T0PC0UNT 伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一个实施方案，Kd是使用表面等离振子共振测定法使用BIAcore -2000或 B丨Acore -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)于 25。C 使用固定化抗原 CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的用法说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAC0RE，Inc.)。将抗原用IOmM乙酸钠pH 4. 8稀释至5 μ g/ml (约0.2μΜ)，然后以5μ I/分钟的流速注射以获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，于25° C以约25 μ I/分钟的流速注入在含O. 05%聚山梨酯20 (TWEEN-20 )表面活性剂的PBS (PBST)中两倍连续稀释的Fab (O. 78ηΜ至500ηΜ)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIACORE Evaluation Software version 3. 2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(kj和解离速率。平衡解离常数(Kd)以比率k JKm计算。见例如Chen等，J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过IO6M-1S-1,那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINC0 分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量,在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBSpH 7. 2中20nM抗抗原抗体(Fab形式)于25°C的荧光发射强度(激发=295nm ;发射=340nm，16nm带通)的升高或降低。b)抗体片段
在某些实施方案中，本文中提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab’_SH、F(ab’)2、Fv、和scFv片段，及下文所描述的其它片段。关于某些抗体片段的综述，见 Hudson 等 Nat. Med. 9:129-134 (2003)。关于 scFv 片段的综述，见例如 Pluckthiin,于 The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第 113 卷，Rosenburg 和 Moore 编，(Springer-Verlag, New York),第 269-315 页(1994);还可见 WO 93/16185;及美国专利No. 5，571，894和5，587，458。关于包含补救受体结合表位残基，并且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，见美国专利No. 5，869，046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。见例如 EP 404, 097;WO 1993/01161 ;Hudson 等，Nat. Med. 9:129-134(2003);及 Hollinger等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)。三抗体和四抗体也记载于 Hudson 等，Nat. Med. 9:129-134(2003)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整个或部分轻链可变域的抗体片段。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis, Inc. ,Waltham,MA ;见例如美国专利 No. 6，248，516B1)。可以通过多种技术，包括但不限于对完整抗体的蛋白水解消化及重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成来生成抗体片段，如本文中所描述的。c)嵌合的和人源化的抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体记载于例如美国专利 No. 4，816，567;及 Morrison 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，自小鼠、大鼠、仓鼠、家兔、或非人灵长类，诸如猴衍生的可变区)和人恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换的”抗体，其中类或亚类已经自亲本抗体的类或亚类改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。一般地，人源化抗体包含一个或多个可变域，其中HVR，例如⑶R (或其部分)自非人抗体衍生，而FR (或其部分)自人抗体序列衍生。任选地，人源化抗体还会至少包含人恒定区的一部分。在一些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基用来自非人抗体(例如衍生HVR残基的抗体)的相应残基替代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。人源化抗体及其生成方法综述于例如Almagro和Fransson,Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008),并且进一步记载于例如 Riechmann 等，Nature332:323-329 (1988) ; Queen等，Proc. Nat，I Acad. Sci. USA 86:10029-10033(1989);美国专利 No. 5，821，337，7，527，791，6，982，321 和 7，087，409;Kashmiri 等，Methods36:25-34(2005)(描述了 SDR(a-CDR)嫁接);Padlan，Mol. Immunol. 28:489-498(1991)(描述了“重修表面”);Dall’ Acqua 等，Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR 改组”);及 Osbourn等，Methods 36:61-68(2005)和 Klimka 等，Br. J. Cancer，83:252-260 (2000)(描述了 FR 改组的“引导选择”方法)。可以用于人源化的人框架区包括但不限于使用“最佳拟合(best-fit) ”方法选择的框架区(见例如Sims等J. Immunol. 151:2296(1993));自轻或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列衍生的框架区(见例如Carter等Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89:4285(1992);及 Presta 等 J. Immunol.，151:2623 (1993));人成熟的(体细胞突变的) 框架区或人种系框架区(见例如 Almagro 和 Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008))；和通过筛选FR文库衍生的框架区(见例如Baca等，J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)及 Rosok 等，J. Biol. Chem. 271:22611-22618(1996))。d)人抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是人抗体。可以使用本领域中已知的多种技术来生成人抗体。一般地，人抗体记载于van Dijk和van de Winkel, Curr. Opin.Pharmacol. 5:368-74 (2001)及 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)。可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体，所述转基因动物已经修饰为响应抗原性攻击而生成完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有所有或部分人免疫球蛋白基因座，其替换内源免疫球蛋白基因座，或者其在染色体外存在或随机整合入动物的染色体中。在此类转基因小鼠中，一般已经将内源免疫球蛋白基因座灭活。关于自转基因动物获得人抗体的方法的综述，见Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)。还可见例如美国专利No. 6，075，181和6，150，584，其描述了 XEN0M0USE 技术；美国专利No. 5，770，429，其描述了 HUMAB 技术；美国专利No. 7，041，870，其描述了 K-M MOUSE 技术，和美国专利申请公开文本No. US 2007/0061900,其描述了VELOC丨MOUSE 技术)。可以例如通过与不同人恒定区组合进一步修饰来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区。也可以通过基于杂交瘤的方法生成人抗体。已经描述了用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(见例如Kozbor J. Immunol.,133:3001 (1984) ;Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications,第 51-63 页(Marcel Dekker, Inc., New York,1987)；及 Boerner 等，J. Immunol. , 147:86 (1991))。经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也记载于Li等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)。其它方法包括那些例如记载于美国专利No. 7，189,826 (其描述了自杂交瘤细胞系生成单克隆人IgM抗体)和Ni，XiandaiMianyixue, 26 (4) : 265-268 (2006)(其描述了人-人杂交瘤)的。人杂交瘤技术(Trioma技术)也记载于 Vollmers 和 Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005)及 Vollmers 和 Brandlein, Methods and Findings in Experimental and ClinicalPharmacology,27(3):185-91 (2005)。也可以通过分离自人衍生的噬菌体展示文库选择的Fv克隆可变域序列生成人抗体。然后，可以将此类可变域序列与期望的人恒定域组合。下文描述了自抗体文库选择人抗体的技术。e)文库衍生的抗体可以通过对组合文库筛选具有期望的一种或多种活性的抗体来分离本发明的抗体。例如，用于生成噬菌体展示文库并对此类文库筛选拥有期望结合特征的抗体的多种方法是本领域中已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等于Methods in MolecularBiology 178:1-37(0，Brien 等编，Human Press, Totowa, NJ, 2001),并且进一步记载于例如 McCafferty 等，Nature348:552-554;Clackson 等，Nature 352:624-628(1991);Marks等，J. Mol. Biol. 222:581-597(1992);Marks 和 Bradbury,于 Methods in MolecularBiology 248 :161-175 (Lo 编，Human Press, Totowa, NJ, 2003) ; Sidhu 等，J.Mol· Biol. 338(2) :299-310(2004) ;Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) :1073-1093(2004) ;Fellouse,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (34) : 12467-12472 (2004);及 Lee 等，J. Immunol. Methods284(1-2):119-132(2004)。在某些噬菌体展示方法中，将VH和VL基因的全集分别通过聚合酶链式反应(PCR)克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以对所述噬菌体文库筛选抗原结合噬菌体，如记载于 Winter 等,Ann. Rev. Immunol. , 12:433-455 (1994)的。嗤菌体通常以单链 Fv (scFv)片段或以Fab片段展示抗体片段。来自经免疫的来源的文库提供针对免疫原的高亲和力抗体，而不需要构建杂交瘤。或者，可以(例如自人)克隆天然全集以在没有任何免疫的情况中提供针对一大批非自身和还有自身抗原的抗体的单一来源，如由Griffiths等，EMBO J,12:725-734(1993)描述的。最后，也可以通过自干细胞克隆未重排的V基因区段，并使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排来合成生成未免疫文库，如由 Hoogenboom 和 Winter，J. Mol. Biol.，227:381-388 (1992)所描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利公开文本包括例如美国专利No. 5，750, 373、和美国专利公开文本No. 2005/0079574，2005/0119455，2005/0266000，2007/0117126，2007/0160598，2007/0237764，2007/0292936 和 2009/0002360。认为自人抗体文库分离的抗体或抗体片段是本文中的人抗体或人抗体片段。f)多特异性抗体在某些实施方案中，本文中提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性之一针对NRG，而另一种针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合NRG的两个不同表位。也可以使用双特异性抗体来将细胞毒剂定位于表达NRG的细胞。双特异性抗体可以以全长抗体或抗体片段制备。用于生成多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(见Milstein和Cuello, Nature 305:537(1983))、WO 93/08829、和 Traunecker 等，EMB0 J. 10:3655(1991))、和“突起-入-空穴”工程化(见例如美国专利No. 5，731，168)。也可以通过用于生成抗体Fe-异二聚体分子的工程化静电操纵效应(wo 2009/089004A1);交联两个或更多个抗体或片段(见例如美国专利 No. 4, 676, 980,及 Brennan 等,Science, 229:81 (1985));使用亮氨酸拉链来生成双特异性抗体(见例如 Kostelny 等,J. Immunol. , 148 (5) : 1547-1553 (1992));使用用于生成双特异性抗体片段的“双抗体”技术(见例如Hollinger等，Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993));及使用单链 Fv(sFv) 二聚体(见例如 Gruber 等,J.Immunol. , 152:5368 (1994));及如例如 Tutt 等 J. Immunol. 147:60 (1991)中所描述的，制备三特异性抗体来生成多特异性抗体。本文中还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化改造抗体，包括“章鱼抗体”(见例如US 2006/0025576A1)。本文中的抗体或片段还包括包含结合NRG及另一种不同抗原的抗原结合位点的“双重作用 FAb” 或 “DAF”(见例如 US 2008/0069820)οr)抗体变体
在某些实施方案中，涵盖本文中提供的抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如，抗原结合。h)替代、插入、和删除变体在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表I中在“保守替代”的标题下显示。更实质的变化在表I中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改善的ADCC或CDC。表I
初始残基j例示性替代I优选的替代
Ala (A)Vai; Leu: Iie~\^
Arg (R)Lys; Gin; AsnLys
Asn (N)Gin; His; Asp, Lys; ArgGln
Asp (D)Glu; AsnGlu
Cys (C)Scr; AlaScr
Gln (Q)Asn; GluAsn
Glu (E)Asp: GinAsp
Gly(G)~Ah~Ah

权利要求
1.一种延长癌症患者中的肿瘤复发前时间的方法，包括对所述患者施用有效量的神经调节蛋白拮抗剂。
2.权利要求I的方法，其进一步包括对所述患者施用治疗剂。
3.权利要求2的方法，其中所述治疗剂是化学治疗剂或抗体。
4.权利要求3的方法，其中所述化学治疗剂是帕利他塞或顺钼或帕利他塞和顺钼的组入口 ο
5.权利要求3的方法，其中所述抗体是EGFR、HER2、HER3、或HER4抗体。
6.权利要求I的方法，其中所述癌症选自下组非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、头和颈癌、宫颈癌、膀胱癌、食管癌、前列腺癌、和结肠直肠癌。
7.权利要求I的方法，其中肿瘤复发前时间的延长比在没有所述神经调节蛋白拮抗剂的情况中的复发前时间大至少I. 25倍。
8.权利要求I的方法，其中肿瘤复发前时间的延长比在没有所述神经调节蛋白拮抗剂的情况中的复发前时间大至少I. 50倍。
9.权利要求I的方法，其中所述神经调节蛋白拮抗剂是抗体、小分子、免疫粘附素、或RNA。
10.权利要求I的方法，其中所述神经调节蛋白拮抗剂是NRGl拮抗剂。
11.权利要求I的方法，其中所述神经调节蛋白拮抗剂是抗NRGI抗体。
全文摘要
本发明提供了神经调节蛋白拮抗剂和在延迟肿瘤复发前时间或预防癌细胞对用治疗剂治疗的抗性中使用神经调节蛋白拮抗剂的方法。
文档编号C12N15/113GK102892779SQ201180009922
公开日2013年1月23日 申请日期2011年2月17日 优先权日2010年2月18日
发明者E.杰克森, E.A.斯维特-柯德罗 申请人:基因泰克公司, 里兰斯坦福初级大学理事会