专利名称：神经调节蛋白用于预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及神经调节蛋白在制备用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人缺血再 灌注损伤的药物中的用途。更为特别地，涉及神经调节蛋白用于预防、治疗或延迟心脏缺血 再灌注损伤的方法和组合物。
背景技术：
缺血后疏通血管或再造血管使组织得到血液的再灌注，本来是医师们的目的所 在，而且事实上在大多数情况下也确能收到良好的治疗效果。但在一定条件下再灌注反 而引起更加严重的后果。这不仅见于临床，而且也为不同种属(兔、大鼠、豚鼠、狗、猪等) 的大量动物实验所证明。这是一种反常现象，称之为再灌注损伤(ischemia reperfusion injury, IRI)。自从I960年Jennings第一次提出心肌缺血再灌注损伤的概念以来，其已经成为 心血管研究的热点问题。心肌持续性缺血导致组织损伤和细胞死亡，早期再灌注能够减轻 心肌缺血的损伤程度，但是大量的动物实验和临床观察，再灌注后在改善心肌供血的同时 又加重了单纯心肌缺血所造成的损伤，出现心律失常、梗死面积扩大、持久性心室收缩功能 低下等状况。病理变化可出现心肌细胞水肿、细胞膜和细胞器膜完整性破坏、肌纤维出现破 坏性断裂超微结构的改变、微血管损伤和无再灌注现象等。因此，心肌缺血再灌注损伤成为 影响患者缺血/再灌注后心脏结构和功能恢复的主要因素。由于近年医学的发展进步；使缺血再灌注损伤愈益受到重视。例如断肢再植和器 官移植就存在缺血肢体和器官的再灌注问题。又如动脉搭桥术后、溶栓疗法之后，休克治疗 之后均可能发生缺血与再灌注损伤。缺血再灌注损伤的机制目前仍不是非常明确。可能的机制包括氧自由基的堆积 (RuizGinesJA 等，J Cardiovasc Pharmacol, 2000, 35 (1) :109-113)，钙离子超载(Shen AC 等,Am JPathol，1972，67(3) :441-452 ；Sjaastad I等，Acta Physiol Scand,2002,175(4) 261-269)，能量代谢障碍(谷天祥等，中华心血管病杂志，2001，四(7) =420-423 ；Nordlie MA等，J CardiovascPharmacol Ther, 2006,11 (1) 17-30)，中性粒细胞的聚集(Hoffman Jff 等，J Extra CorporTechnol，2004，36 (4) :391-411)等等。针对这些机制，可采取的用于防 治缺血再灌注损伤的手段包括尽早恢复血流，减少缺血时间；灌注时低压、低流、低温；清 除自由基，比如外源性SOD、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(allopurinol)、维生素E、维生 素C、过氧化氢酶、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)等自由基清除剂；改善缺血组 织代谢，比如补充糖酵解底物如磷酸己糖保护缺血组织，外源性ATP恢复细胞膜功能，氢 醌、细胞色素C延长缺血组织的可逆性改变期限。神经调节蛋白(Neuregul in，NRG ；Heregul in，HRG)，属于表皮生长因子样 (EGF-Iike)家族，是一类结构上相似的生长分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4以及它 们的异构体，行使了一系列的生物学作用刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌(Lessor T等.J CellBiochem. 1998 ；70 (4) :587-595)；诱导神经脊细胞分化为 khwann细胞(Topilko P等，Mol CellNeurosci. 1996 ；8 (2-3) :71-75)；刺激骨骼肌细胞内乙酰胆碱受体的合成 (Altiok N等，EMB0J. 1995 ；14(17) =4258-4266)；以及促进心肌细胞成活和 DNA 合成(Zhao YY等，J Biol Chem. 1998 ；273 (17) 10261-10269) 用NRG基因严重缺陷的小鼠胚胎做的 活体研究证明NRG对于心脏和神经发育是必需的。NRG的受体属于EGF受体家族，包括EGFR，ErbB2, ErbB3和ErbB4，它们在多种细 胞功能比如细胞生长、分化和存活中发挥了重要的作用。它们属于络氨酸激酶受体，有胞 外的配体结合功能区、跨膜区和胞内的络氨酸激酶功能区组成。当NRG结合到ErbB3或 ErbB4的胞外区后，引起其构象改变从而导致ErbB3/ErbB4或ErbB2/ErbB3异二聚体的形成 或ErtB4/ErbB4同二聚体的形成，并且引起其C末端的磷酸化。磷酸化的C末端可以进一 步结合胞内的下游信号蛋白，激活AKT和(或)ERK信号通路，并最终引起一系列的细胞反 应比如刺激或抑制细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞黏附。在这些受体中，在 心脏组织表达的主要是 ErbB2 和 ErbB4(Zhao YY 等，Circ Res. 1999 ；84 (12) :1380-1387) 已有的证据表明，NRG-I的EGF样结构域，包含50到64个氨基酸，足以结合并激活受体 (Culouscou JM 等，J Biol Chem. 1995 ；270 (21) :12857-12863) NRG-1 β 可以以较高的亲 和力结合到ErbB3和ErbB4。而ErbB2可与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体，其与配体的 亲和力高于ErbB3或ErbB4同源二聚体与配体的亲和力。神经发育学的研究证实交感神 经系统的形成需要NRG-I β、ErbB2和ErbB3的信号传导(Britsch S等，Genes Dev. 1998 ； 12(12) =1825-1836)。而干扰NRG-I β或ErbB2或ErbB4的表达将由于心脏发育的缺陷引起 胚胎死亡(Gassmann M等，Nature. 1995 ；378 (6555) :390-394)。最近的研究强调，NRG-1 β、 ErbB2和ErbB4不仅对心脏发育至关重要，同时对成年心脏的功能维持也起到非常重要的 作用(Kuramochi Y 等，J Mol Cell Cardiol. 2006 ；41 (2) :228-235)。NRG-1 β 被证明可 以加强成年心肌细胞肌小节的形成。在多种心衰动物模型中发现，NRG-I β EGF样结构域 的摄入可以显著提高心脏功能，防止心功能的恶化(Liu等，J Am Coll Cardiol. 2006 ；48 1438-1447)。在临床试验中，NRG也显示了对各种病因引起的慢性心力衰竭患者的治疗作 用，显著提高了其心脏功能(CN200910057390. 5)。在大脑缺血再灌注动物模型中，NRG-I 也显示了对脑细胞显著的保护性作用，抑制脑细胞凋亡，增强神经功能，减小梗死面积(Li Q等，Neurosci Lett. 2008 ；443 (3) =155-159) 虽然有证据表明，心脏缺血再灌注诱导 7 NRG-I的释放，激活心肌细胞NRG/ErbB信号通路(Kuramochi Y等，J Biol Chem. 2004 ； 279(49) :51141-51147)，但NRG-I在心脏缺血再灌注损伤中的作用仍然没有清楚地阐明。 本发明提供了上述需求的方法和组合物。
发明内容
A.发明概述本发明是基于NRG对心脏发育至关重要，对成年心脏的功能维持也起到非常重要 的作用的科学发现；基于NRG可以加强心肌细胞肌小节和细胞骨架以及细胞间连接的形成 的科学发现；基于NRG在各种动物模型和临床试验中可以提高心衰动物或病人的心脏功能 的科学发现；基于NRG在大脑缺血再灌注动物模型中显示对脑细胞的保护作用的科学发 现。NRG，NRG多肽，NRG突变体或其它具有NRG样功能的复合物都属于本发明的范畴。
本发明的第一个方面，是提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺 血再灌注损伤的药物制剂。该药物制剂包含有效量的NRG或其功能片段，或编码NRG或其 功能片段的核酸，或提高NRG产量和/或功能的物质，以及药学上可以接受的载体、赋形剂 等。该药物制剂可以和其它可用于预防、治疗或延缓缺血再灌注损伤的药物一起使用。本发明的第二个方面，是提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺 血再灌注损伤的方法。包括对需要或希望预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的哺乳动 物特别是人施用有效量的NRG或其功能片段，或编码NRG或其功能片段的核酸，或提高NRG 产量和/或功能的物质，从而达到预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的效果。本发明的另一个方面，是提供了一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心 脏缺血再灌注损伤的组合物。该组合物包含了本发明所提供的用于预防、治疗或延迟哺乳 动物心脏缺血再灌注损伤的药物制剂，以及其它预防、治疗或延缓缺血再灌注损伤的药物。本发明还提供了一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人心脏缺血再灌注损 伤的药盒，其中包含了一次或多次使用剂量的上述预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤 的药物制剂或组合物，以及如何使用该药物制剂或组合物的说明书。本发明所提供的药物制剂或组合物，可以在缺血再灌注损伤发生前、发生时或发 生后给予。当用于预防时，一般在缺血再灌注损伤发生前给药。当用于治疗时，一般在缺血 再灌注损伤发生后给药。在一个实施方案中，本发明所提供的药物制剂或组合物，在缺血发 生之前给药。在一个实施方案中，本发明所提供的药物制剂或组合物，在心脏缺血发生后， 再灌注之前给药。在另一个实施方案中，本发明所提供的药物制剂或组合物，在再灌注发生 后给药。B.释义除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理 解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如 本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。除非特别指明，在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。此处 所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能够结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4 或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括神经调节蛋白的异构体、神经调节蛋白中的EGF 样功能域、包含神经调节蛋白EGF样功能域的多肽、神经调节蛋白的突变体或衍生物以及 其它能够激活上述受体的神经调节蛋白样的基因产物。神经调节蛋白还包括NRG-l，NRG-2， NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG样功能的复合物。优选的，神经调节蛋白是可 以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。作为例子，但并非 为了限制的目的，本发明的神经调节蛋白是NRG-I β 2异构体的一个片段，即177-237位氨 基酸片段，其中包含了 EGF样功能域。该片段的氨基酸序列为SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVK DLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ IDNO :1)。本发明所用神经调节蛋白可以 激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；促进心 肌细胞的分化、存活以及DNA合成。神经调节蛋白还包括那些具有并不实质性影响生物学 功能的保守性突变的神经调节蛋白突变体。本技术领域中普通技术人员熟知，非关键区域 的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变(参见Watson等人， Molecular Biology of the Gene,4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub. co.,P. 224)。本发明所用神经调节蛋白可以从天然的来源分离得到，或者通过重组技术、人工合 成或其它手段得到。此处所用“EGF样功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所编码 的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段，并且与下述 参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似性W0 00/64400 ；Holmes等，Science, 256 :1205-1210(1992)；美国专利 5，530，109 和 5，716，930 ；Hijazi 等，Int. J. Oncol.， 13 :1061-1067(1998) ；Chang 等，Nature, 387 :509-512(1997) ；Carraway 等，Nature, 387 512-516(1997) ；Higashiyama 等，J. Biochem.，122 :675-680 (1997)；以及 WO 97/09425。在 某些实施方案中，EGF样功能域结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在 某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-I的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF 样功能域是指NRG-I的第177-2 位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些实施方案 中，EGF样功能域包含NRG-2的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含 NRG-3的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-4的受体结合区 氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含美国专利5，834，229中描述的氨基酸序列 Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe CysValAsn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。缺血再灌注损伤是指缺血组织或器官重获血流灌注或氧供后，对组织和器官所产 生的损伤作用，涉及氧自由基的产生，钙离子超载，中性粒细胞损伤区浸润等多重病理生理 改变。此处所用“其它用于治疗缺血再灌注损伤的药物”是指已知的可用于治疗缺 血再灌组损伤的药物，包括自由基清除剂，比如外源性SOD、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤 醇(allopurinol)、维生素E、维生素C、过氧化氢酶、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)；改善缺血组织代谢的药物，比如糖酵解底物如磷酸己糖，外源性ATP，氢醌、细胞色
素C等。
图1显示各组大鼠心脏切面TTC染色结果。切面中白色区域(TTC未染区)为梗 死区域。A、B、C、D分别代表A组、B组、C组和D组。
具体实施例方式实施例1 重组人纽兰格林(rhNRG-Ι)对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用试验所用试剂重组人纽兰格林(rhNRG-Ι)上海泽生科技开发有限公司研制，批号200503007 ； 规格250 μ g/支。赋形剂上海泽生科技开发有限公司研制，批号200503001F ；规格250 μ g/支。重组人胸腺素- β 4 北京诺思兰的生物技术有限公司，批号20050728。大鼠(雄性Wistar大鼠，200 240g)腹腔注射20%乌拉坦(5ml/kg)麻醉后，给 予不同剂量的NRG、赋性剂或重组人胸腺素-β 4。开始给药后30分钟，大鼠左冠状动脉结 扎，出现明显的局部心肌颜色变白。冠脉结扎45分钟后，松开结扎的线，使冠脉缺血再灌注2小时。实验结束后，迅速取出心脏，用生理盐水冲洗，去除血管脂肪等非心肌组织，-300C 冻存1小时。顺房室沟从心尖到心基部平行将心脏切成Imm厚的心肌片，于的TTC染液中， 37度温孵染色20min，染色过程中不时摇动使染液和心肌有充分的接触机会。染色后立即 用水冲洗去多余的染料，并在4%的甲醛溶液衬染1小时。将心肌片拍成照片，用图像分析 软件，分析心肌片总面积及心肌片梗死区面积(TTC未染区)。心肌梗死面积比用未染梗死 区面积之和与心肌片总面积和的比来表示。实验分组及给药情况详见表1。结果显示A组(赋形剂)大鼠心肌梗死面积比为 0. 178士0. 047，B 组(10ug/kg/h rhNRG-1)大鼠心肌梗死面积比为 0. 130士0. 049，与 A 组相 比，梗死面积相差显著(P < 0. 05)，明显减小。C组(30ug/kg/h rhNRG-1)大鼠心肌梗死面 积比为0. 121 士0.047，与A组相比，梗死面积相差显著(P < 0.05)，明显减小。D组(重组 人胸腺素-β4)大鼠心肌梗死面积比为0.151 士0.030，与各组相比，无显著差异。(详见 表2及图1)。表1.实验分组及给药情况
权利要求
1.NRG用于制备预防、治疗或延迟哺乳动物心脏缺血再灌注损伤的药物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中NRG选自NRG-I，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述NRG是NRG-I。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述NRG包含SEQID N0:1的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
6.一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物心脏缺血再灌注损伤的药物制剂，其特征在于 其含有有效剂量的NRG。
7.根据权利要求6所述的用途，其中NRG选自NRG-I，NRG-2,NRG-3或NRG-4。
8.根据权利要求6所述的用途，其中所述NRG是NRG-I。
9.根据权利要求6所述的用途，其中所述NRG包含SEQID NO :1的氨基酸序列。
10.根据权利要求6所述的用途，其中所述哺乳动物是人。
11.一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物心脏缺血再灌注损伤的组合物，其特征在于其 含有如权利要求6所述的药物制剂以及其它用于治疗缺血再灌注损伤的药物。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述其它用于治疗缺血再灌注损伤的药物包 含自由基清除剂和改善缺血组织代谢的药物。
13.一种用于预防、治疗或延迟哺乳动物心脏缺血再灌注损伤的药盒，其中含有如权利 要求6所述的药物制剂以及如何使用该药物制剂的说明书。
全文摘要
本发明涉及神经调节蛋白在制备用于预防、治疗或延迟哺乳动物特别是人缺血再灌注损伤的药物中的用途。更为特别地，涉及神经调节蛋白用于预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤的方法和组合物。具体地说，虽然神经调节蛋白在各种细胞试验、动物试验和临床试验中显示了改善心肌细胞结构、提高心脏功能的作用，然而目前对神经调节蛋白对心脏缺血再灌注损伤是否有影响仍然不是很清楚。本发明通过大鼠动物模型，证明神经调节蛋白可以在缺血再灌注过程中减小梗死面积，提示神经调节蛋白可以用于预防、治疗或延迟心脏缺血再灌注损伤。
文档编号A61P9/10GK102139095SQ20101011297
公开日2011年8月3日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者周明东 申请人:上海泽生科技开发有限公司