专利名称：神经调节蛋白用于心肌梗死治疗的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心肌梗死的成分及方法。更具体说，本发明提供了一种可预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死方法，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延缓的哺乳动物尤其是人类施用有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，因而可以预防、治疗或延缓所述心肌梗死。本发明还提供了神经调节蛋白及提高神经调节蛋白产量和(或)功能的物质用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心肌梗死的组合物、试剂盒及有效药物成分。
背景技术：
心肌梗死(myocardial infarction)是冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死。由于心肌梗死同时伴各种并发症如心律失常、休克及充血性心力衰竭的发生，心肌梗死成为严重影响人类健康的疾病。当心肌广泛(40％以上)坏死，心排血量急剧下降导致休克或心力衰竭。该病在欧美国家常见，其发病率为3.5‰，美国每年约有100-150万人发生心肌梗死。该病在我国过去极少见，近年逐渐增多。近年来对急性心肌梗死的治疗主要是应用静脉溶栓疗法为代表的再灌注治疗，该方法对降低心肌梗死的死亡率、保存心功能、改善预后产生了突破性的进展。
同时，经皮腔内冠状动脉血管成形术(PTCA)的应用及冠状动脉内支架的植入，对某些极严重型的急性心肌梗死，心源性休克或溶栓治疗有禁忌者或溶栓失败的患者，增加了生存的机会。抗血小板、抗凝剂用于再灌注时的辅助治疗起到了积极的作用。而ACEI、β受体阻滞剂等的合理应用，减少了心肌梗死后的心肌重塑过程，改善预后，降低了死亡率。然而，所述治疗措施可以限制及缩小梗死面积但未有从根本上治疗针对受损的心肌细胞的手段。
神经调节蛋白(Neuregulins，NRGs)是由NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码，并与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。NRG与受体ErbB信号传导途径可调控多种生物反应如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨胳肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞成活和DNA合成。目前，研究较深入的是Neuregulin-1。Neuregulin-1又称Neu Differentiation Factor(NDF)或Glial Growth Factor(GGF)，是ErbB3和ErbB4的配体(Wen等，Cell 69，559-572，1992；Holmes等，Science 256，1205-1210；Pinkas-Kramarski等，EMBO J.15，2452-2467，1996；Tzahar等，Mol.Cell.Biol.16，5276-5287，1996)。由于其胞外段含有一个EGF样功能区域(EGF-like domain)，在结构上属表皮生长因子(EGF)的家庭成员(Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9513024-13029.1998)。它能直接与ErbBs受体结合，激活ErbBs受体并产生相应的生物学活性。ErbBs是一组结构相近的具有酪氨酸激酶活性的受体，共有四个成员，ErbB1～4。ErbB1是EGF受体，ErbB2～4是Neuregulin-1的受体。在体内，ErbB3表达在神经组织中，ErbB4表达在神经和心肌组织中，ErbB2则伴随ErbB3和ErbB4共表达。当配体和ErbB3或ErbB4结合后，ErbB3或ErbB4和ErbB2形成异源二聚体，并引起细胞内的信号传递。ErbB2/ErbB4异源二聚体所激活的细胞内信号对心肌细胞的发育、分化、结构和功能有重要的影响(Meyer等，Nature 378386-390，1995；Lee等，Nature.378394-398，1995；Gassmann等，Nature 378390-394，1995；Zhao等，J Biol Chem.1998，27310261-10269)。
应用基因定位灭活技术(Targeted Gene Knock-out)，将Neuregulin-1、ErbB2、ErbB4定点失活后导致纯合子突变胚胎在发育E10.5天早期死亡。原因是纯合子突变胚胎的心脏结构完全没有心肌小梁(trabeculae)的分化形成，心室变为一扩大的空泡结构，造成心脏早期发育不完善。同时，胚胎的神经节发育也存在严重的缺陷(Meyer等，Nature 378386-390，1995；Lee等，Nature.378394-398，1995；Gassmann等，Nature 378390-394，1995；Liu等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9513024-13029.1998)。
早期对Neuregulin-1与心肌功能的研究主要集中于培养心肌细胞。当时认为Neuregulin-1对心肌细胞的影响和内皮细胞因子-1或Phenylephlin差不多，即它可能和心肌细胞分裂、存活、肥大有一定的联系(Baliga等，Am JPhysiol 1999，277(5 pt 2)H2026-H2037)。WO00/37095显示Neuregulin-1促进心肌细胞分裂的作用仅限于在低浓度和无血清的培养条件，否则，Neuregulin-1则显示对心肌细胞分裂的抑制作用，证实NRG-1促进心肌细胞分化作用。此外，Douglas等研究证实Neuregulin-1阿霉素对培养心肌细胞结构的破坏作用能有效抑制(Douglas等，Circulation 2002；1051551-1554)。
研究结果表明，Neuregulin-1/ErbB信号系统不但在早期胚胎发育时期对心脏和神经系统有重要作用，而且与心肌细胞的病变有密切关系。最新的研究结果表明Neuregulin-1对成体的心脏功能具有重要作用。抗肿瘤药Herceptin(抗ErbB2人源化单克隆抗体)在临床应用中发现有心脏毒性副作用，尤其和阿霉素联合使用时能使高达28％的癌症病人罹患心力衰竭；而将活检的损伤的成人心肌细胞进行体外培养，初步结果发现Neuregulin-1可恢复心肌细胞的功能；表明该信号系统对成人心脏的生理功能有重要的作用。此外，在前述Neuregulin-1基因失活实验中，由于胚胎的早期死亡，很难观察到Neuregulin-1在成体心脏中的作用。应用Cre-Loxp酶切重组实验技术，KF Lee和Kenneth R.Chien合作培育了一种实验小鼠，该小鼠的ErbB2受体基因被条件性地失活(Conditional Gene Knockout)，这种基因突变发生于小鼠发育较后期并被限制在心肌细胞中。在携带这种突变基因的小鼠心肌中，Neuregulin-1/ErbB信号系统被阻断，结果小鼠患扩张性心肌病。该实验结果进一步说明Neuregulin-1/ErbBs信号对成体心脏生理功能具有重要意义(Crone等，Nat Med 8(5)459-465，2002)。
本发明通过用有效量神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质治疗心肌梗死，修复受损的心肌细胞，从根本上改善心肌功能，改善心肌的生物学效应，从而使这类患者心功能改善，生存期延长，死亡率降低，生活质量提高。
发明概述本发明提供了一种预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死方法，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延缓的哺乳动物尤其是人类施用有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，从而预防、治疗或延缓心肌梗死。
本发明还提供了预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心肌梗死的组合物，该组合物包括有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质以及有效量的预防或治疗心肌梗死的药物。
本发明还提供了预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心肌梗死的药物有效成分，该药物有效成分包括有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，从而预防、治疗或延缓心肌梗死。
本发明还提供了用于预防、治疗和延缓心肌梗死试剂盒，该试剂盒包括置于容器中的所述的药物有效成分及其使用说明。
图1.人神经调节蛋白工程菌株的构建设计方案的技术路线。人神经调节蛋白基因定位于染色体8P12，有大约13个外显子结构。构建的神经调节蛋白β2片段由61个氨基酸组成，理论分子量为7055D，SDS-PAGE电泳表观分子量为6500-7000D，等电点在6.5左右，无糖基化位点，含三个二硫键，适合用大肠杆菌系统进行表达。选用PET22b作为表达质粒，导入人神经调节蛋白基因后转化大肠杆菌BL21，经过筛选得到高表达重组人神经调节蛋白的工程菌株。
图2.神经调节蛋白基因的扩增。从人5个月胚胎脑组织提取总RNA和mRNA，逆转录成cDNA，以此为模板，进行RT-PCR获得目的基因。取PCR扩增产物经1.5％琼脂糖电泳，可见特异的183bp大小扩增片段，与设计片段长度相符。泳道1是扩增大小为183bp的目的片段，泳道2、3为DNA Markers。
图3.PET22b质粒物理图谱图4.重组人神经调节蛋白表达质粒的构建。用氯化钙沉淀法将人神经调节蛋白基因克隆至PET22b表达质粒中，构建成重组人神经调节蛋白表达质粒(PET22b-人神经调节蛋白)，此蛋白在T7启动子的驱动下，高效表达。表达基因N端从NdeI位点插入，C端有终止子紧接在最后一个氨基酸处，所得蛋白不与任何氨基酸形成融合蛋白。经酶切切出约183bp的正确片段。转化子经酶切鉴定后，提取双链DNA进行核甘酸序列测定。
图5.高效表达工程菌鉴定。取经PCR和酶切鉴定的工程菌克隆(BL21-PET22b-人神经调节蛋白)，随机挑选一系列单菌落接种于2mlLB-Amp液体培养基，置37℃、250rpm培养过夜，然后按一定比例接种于20ml LB-Amp培养液中，37℃培养至OD600达1.0时加入IPTG诱导4h，收集菌体。破菌后收集包涵体，15％SDS-PAGE电泳、薄层扫描分析、Western-blotting鉴定，经反复筛选获得一株稳定高表达目的蛋白神经调节蛋白的工程菌(BL21-PET22b-人神经调节蛋白)。该菌株表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10％左右。经高压匀浆破菌后，目的蛋白以包涵体形式存在。工程菌在IPTG诱导4h后，菌体经SDS-PAGE电泳，包涵体占菌体总蛋白的20％左右；纯化后的重组神经调节蛋白比活性＞5×103EU/mg，表明神经调节蛋白工程菌株构建成功。在筛选工程菌时进行的SDS-PAGE、Western Blot、生物学活性测定的基础上，进行人神经调节蛋白氨基酸组成分析、N-末端序列分析，结果表明所表达的重组人神经调节蛋白氨基酸序列与设计相符。
实施发明方式为了清楚公开发明，分成以下小节详细描述。
A.定义除非有另外的定义，所有在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技能人员普遍理解的同样含义。这里参考的所有专利、申请、公开的申请和其他出版物均被全部引入作为参考。如果本节阐述的定义与在此参考中的专利、申请、公开的申请和其他出版物所阐述的定义相反或不一致时，本节阐述的定义胜过其他参考文献的定义。
在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。
在此所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”的意思是指与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。它能激活上述受体，并调控多种生物反应如刺激乳房癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨胳肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞成活和DNA合成。常见神经调节蛋白可由例如NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码的蛋白质或多肽。由于在多肽的非功能区域的个别氨基酸的改变对其功能无影响(see，e.g.，Watson等.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)，这里，NRG也包括保留NRG保守氨基酸序列，但对心肌梗死的治疗作用不变的NRG异构体。
在此所用“EGF样结构域”或“epidermal growth factor-like domain”或“EGF-like domain”是指与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，具有与EGF受体结合区域相同结构的多肽结构，常见“EGF样结构域”可由NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码。关于EGF样结构域参见WO 00/64400，Holmes等.，Science，2561205-1210(1992)；U.S.PatentNos.5,530,109 and5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，131061-1067(1998)；Chang等，Nature，387509-512(1997)；Carraway等，Nature，387512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochern.，122675-680(1997)；及WO 97/09425.。
在此所用“功能片段或类似物”是指神经调节蛋白的功能片段或类似物或编码该片段的核酸保留对心肌梗死的预防、治疗或延缓作用。通常，这些功能片段或类似物至少保留50％预防、治疗或延缓心肌梗死的作用，更好的情况下，这些功能片段或类似物至少保留60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％预防、治疗或延缓心肌梗死的作用。
在此所用“提高上述神经调节蛋白产量的物质”是指可以提高NRG基因的转录、翻译作用的物质，或提高NRG基因翻译后修饰作用的物质和(或)提高NRG前体细胞通讯的物质，或提高NRG半衰期的物质。
在此所用“提高上述神经调节蛋白功能的物质”是指可以提高神经调节蛋白预防、治疗或延缓心肌梗死的作用的物质，或提高神经调节蛋白在预防、治疗或延缓心肌梗死的作用中细胞传导途径中配体灵敏度的物质，或降低神经调节蛋白拮抗剂作用的物质，但不包括神经调节蛋白及其编码核酸。
在此所用“组合物”是指两种或两种以上化学物质组合而成的物质。
在此所用“erb”指两种癌基因，erb A和erb B，与骨髓成红血细胞增多症病毒相关(一种急性的转化性逆转录病毒)。
在此所用“用于治疗特定疾病的化合物的有效用量”是指足以改善，或是以某种方式减少与该疾病相关的症状的用量。这样的用量可以作为单一剂量或者根据一个配方其可有效的服用剂量。这个用量可能治愈疾病，但是典型的情况是为了改善疾病症状而服用。为达到期望的症状改善，可能需要连续服用。
在此所用“治疗”的意思是使任何状态、不适或疾病的症状得到改善或存在有益变化的方法。治疗也包括其中组合物的任意药物治疗应用。
在此，通过服用特定的药物治疗组合物达到特定不适的症状“改善”是指任何的减轻，不管是永久的还是暂时的，持久的还是短暂，只要该减轻可以归功于或是与服用组合物有关系。
在此所用“重组方法生产”是指使用重组核酸方法的生产方法。本方法是以众所周知的用克隆化的核酸表达所编码的蛋白质的分子生物学方法。
在此所用“互补的”当是指两个核酸分子时，意思是两个核苷酸序列能杂交，优选是低于25％，更优选是低于15％，甚至更加优选是低于5％，最优选是在相对的核苷酸处不存在错误配对。优选在严格条件下，这两个分子杂交。
在此所用决定错误配对百分率的“杂交的严格性”如下规定高严格性0.1×SSPE，0.1％SDS，65℃；中等严格性0.2×SSPE，0.1％SDS，50℃；(也指适度严格性)低严格性1.0×SSPE，0.1％SDS，50℃；应理解为使用对等的缓冲液、盐和温度，可以获得相当的严格性。
在此所用“载体(或质粒)”是指用于将外源DNA导入细胞进行表达或复制的不连续的元件。选择和使用此种载体在这种技术人员的技术范围内是广为人知的。表达载体包括能表达DNA的载体，其DNA有效地与调控序列，例如启动子区域，连接在一起。调控序列能影响该段DNA片段的表达。所以，一个表达载体是指重组DNA或RNA构成物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，它们一旦导入适当的宿主细胞中，导致克隆的DNA表达。合适的表达载体对本领域的技术人员而言十分清楚，并且包括能在真核细胞和/或原核细胞中复制的载体以及保持游离态或整合进宿主细胞基因组的载体。
在此所用“启动子区域或启动子元件”是指控制与其有效连接的DNA或RNA的转录DNA或RNA片段。启动子区域包含足以让RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。启动子区域的这一部分是指启动子。并且，启动子区域还包括调节RNA聚合酶识别、结合和转录起始活动的序列。这些序列可以是顺式作用因子或对反式作用因子作出响应。依据调节的性质，启动子可以是组成型的或调节型的。考虑用于原核生物的典型的启动子包括噬菌体T7和T3启动子和相似的启动子。
在此所用“有效连接和有效结合”是指核苷酸效应序列和调节序列，例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其他信号序列与DNA间的功能关系。举例而言，DNA和启动子的有效连接是指DNA和启动子间的物理和功能关系，该关系使专一识别、结合和转录该段DNA的RNA聚合酶能够从启动子处起始该段DNA的转录。为便于优化表达和/或体外转录，有必要去掉、增加或改变克隆的5′不翻译部分，以便消除多余的、潜在不适当替代性翻译起始密码子或其他不论是在转录或翻译水平上干扰或减少表达的序列。其他方法还有将核糖体结合位点共有序列紧接起始密码子的5′插入，可以增强表达。(参考实例，Kozak，生物化学杂志(J.Biol.Chem.，26619867-19870(1991)。这一改正的愿望(或需要)可由经验来决定。
“心肌梗死”是冠状动脉闭塞，血流中断，使部分心肌因严重的持久性缺血而发生局部坏死。
B.预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死的方法本发明提供了一种预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死方法，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延缓的哺乳动物尤其是人类施用有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，从而预防、治疗或延缓心肌梗死。
本发明的方法能用于任何哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、猪、奶牛、牛、绵羊、山羊、马、猴子和其它非人的灵长类动物预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死。优选地，本发明的方法用于人类预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死。
任何适当的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质都能用于本方法中。在本发明中，神经调节蛋白通过与ErbB2-ErbB4受体结合，从而产生抗心肌梗死的作用，其中神经调节蛋白可以选自神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3或神经调节蛋白4。神经调节蛋白1可以为神经调节蛋白α2或神经调节蛋白β2。其中神经调节蛋白β2片段，包含有SEQID1的氨基酸序列。在其他的实例中，美国专利Nos.6,252,051、6,121,415(NRG3)、6,087,323、6,033,906、US2002002276以及WO01/81540(NRG-4)、WO01/64877(NRG1)、WO01/64876(NRG1AG1)、WO01/58948(neuregulin-beta)、WO01/26607、WO00/70322、WO00/64400、WO99/18976、WO98/02540、WO96/30403、WO96/15812、以及GenBank Accession Nos.如BC017568、BC007675、AF142632、AF194439、AF194438、HS2NRG12、HS2NRG08、HS2NRG07 AF083067、AF076618、AF045656、AF045655、AF045654、MAU96612、AF010130公开的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸，用于本方法中。优选地，GenBank Accession No.NT_007995(gi18570363)公开神经调节蛋白，用于本方法中。存在保守核苷酸序列替换但不影响其活性的任何神经调节蛋白，或其功能片段能用于本方法中。
在本发明中，任何原因引起的心肌梗死均可以得到预防、治疗或延缓。例如，冠状动脉血栓形成、冠状动脉痉挛以及心肌供血不足引起的心肌梗死均可以得到预防、治疗或延缓。
在本发明中，心肌梗死的临床症状及并发症可以得到预防、治疗或延缓。例如，心律失常、室性心律失常、房室传导阻滞、缓慢的心律失常、室上性快速心律失常、休克、心力衰竭可以得到预防、治疗或延缓。
在本发明中，其中神经调节蛋白可以缩小心肌梗死的面积，促使心肌梗死血管增生，从而产生抗心肌梗死的作用。
在本发明中，任何可以预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物能用于本方法中。例如心肌梗死病人长期口服小剂量的阿司匹林或双嘧达莫对抗血小板的聚集和粘附，被认为有预防心肌梗死复发的作用。例如预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是溶血栓药如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)、甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是心律失常治疗药物如利多卡因、美西律、普鲁卡因酰胺、溴苄铵、丙吡胺、妥卡尼、阿托品或奎尼丁肾上腺皮质激素、异丙肾上腺素或麻黄素等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是血管收缩药多巴胺、多巴酚丁胺、间羟胺(阿拉明)、去甲肾上腺素等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是血管扩张药可选用硝酸甘油、硝普钠、酚妥拉明、二硝酸异山梨醇、硝苯地平或东莨菪碱等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是β阻滞剂如阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是ACEI如卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利或喹那普利等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是钙离子拮抗剂如硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫等。促进心肌代谢药物维生素C、辅酶A、肌苷酸钠、细胞色素C、维生素B6等。以及洋地黄类、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等药物。透明质酸酶、吗啡或哌替啶和利尿剂糖皮质激素如甲基强的松龙。抗凝剂如肝素、华法林或双香豆素或苯茚二酮能用于本方法中。
C.预防、治疗或延缓心肌梗死的药物有效成分、组合物及试剂盒本发明提供了一种可直接用于预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死的有效药物成分，该有效药物成分包括有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质。
任何适当的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸，都能用于本组合物中。在本发明中，神经调节蛋白通过与ErbB2-ErbB4受体结合，从而产生抗心肌梗死的作用，其中神经调节蛋白可以选自神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3、神经调节蛋白4。神经调节蛋白1为神经调节蛋白α2或神经调节蛋白β2。其中神经调节蛋白β2片段，包含有SEQ ID1的氨基酸序列。
在本发明中，其中神经调节蛋白可以缩小心肌梗死的面积，促使心肌梗死血管增生，从而产生抗心肌梗死的作用。神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，剂量可以从25μg到2500μg。
本发明提供了一种可直接用于预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死的组合物，该组合物包括有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质以及有效量的预防、治疗心肌梗死的药物。
任何适当的可以预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症药物能用于该组合物中。例如心肌梗死病人长期口服小剂量的阿司匹林或双嘧达莫对抗血小板的聚集和粘附，被认为有预防心肌梗死复发的作用。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是溶血栓药如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)或甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等。心律失常治疗药物如利多卡因、美西律、普鲁卡因酰胺、溴苄铵、丙吡胺、妥卡尼、阿托品或奎尼丁肾上腺皮质激素、异丙肾上腺素或麻黄素等。血管收缩药多巴胺、多巴酚丁胺、间羟胺(阿拉明)或去甲肾上腺素等。血管扩张药可选用硝酸甘油、硝普钠、酚妥拉明、二硝酸异山梨醇、硝苯地平或东莨菪碱等。β阻滞剂如阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔等。ACEI如卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利或喹那普利等。钙离子拮抗剂如硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫等。促进心肌代谢药物维生素C、辅酶A、肌苷酸钠、细胞色素C、维生素B6等。以及洋地黄类、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等药物。透明质酸酶、吗啡或哌替啶和利尿剂糖皮质激素如甲基强的松龙。抗凝剂如肝素、华法林或双香豆素或苯茚二酮可以用于该组合物中。
本发明还提供了用于预防、治疗和延缓心肌梗死试剂盒，该试剂盒包括置于容器中的所述的药物有效成分及其使用说明。
本发明还提供了进行本发明治疗方案的试剂盒。该试剂盒包括置于一个或多个容器中的无论单独或是与其它药剂联合使用的治疗有效量的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质。优选的药物形式是与无菌生理盐水，葡萄糖溶液或缓冲液溶液或是其它制药上可以接受的无菌液体联合使用。组合物也可以冻干或干燥；在这种情况下，试剂盒进一步可随意地包括存于一个容器中的药学上可接受的溶液，优选无菌溶液，以重组成复合物形成注射溶液。典型的药学上可接受的溶液是生理盐水和葡萄糖溶液。
在另一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含一枚用于注射组合物的优选无菌包装的注射针或注射器和/或包装的酒精衬垫。适合于医生或病人使用本组合物的指示性说明随意地包含在试剂盒上面。
D.神经调节蛋白使用方法、剂量以及给药途径神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质使用配方、剂量和给药途径，尤其作为药物组合物时，可根据本技术领域所知的方法加以确定。(参见，例如，雷明顿药剂学科学与实践(RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年四月；治疗用肽和蛋白配方、加工和传递系统(Therapeutic Peptides and ProteinsFormulation，Processing，and Delivery Systems)，Banga，1999；和肽和蛋白制药配方的发展(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins)，Hovgaard和Frkjr(编者)，Taylor&Francis公司，2000；脂质体的医学应用(Medical Applications of Liposomes)，Lasic和Papahadjopoulos(编者)，Elsevier Science，1998；基因治疗教程(Textbook of Gene Therapy)，Jain，Hogrefe&Huber出版社，1998；腺病毒基因治疗的基本生物学(AdenovirusesBasic Biology to Gene Therapy)，15卷，Seth，LandesBioscience，1999；生物制药的药物设计和发展(Biopharnaceutical Drug Designand Development)，Wu-Pong和Rojanasakul(编者)，Humana出版社，1999；治疗学上的血管发生从基础科学到临床(Therapeutic AngiogenesisFromBasic Science to the Clinic)，28卷，Dole等(编者)，Springer-Verlag New York，1999)。神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸，可配制成用于口服，直肠给药，局部用药，吸入法用药，口腔用药(例如舌下)，注射用药(例如，皮下的，肌内的，皮内的，静脉的)，经皮给药或其他适合的给药途径。在任何给定的情况下，最合适的给药途径将取决于要治疗情况的性质和严重程度以及所用的特定神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质的性质。
神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质能够单独使用。优选的方式是，神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，与药物治疗上可接受的载体或者赋形剂共同使用。任何合适的药物治疗可以接受的载体或者赋形剂能用于本方法中。(参见，例如，雷明顿药剂学科学与实践(RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年四月)。
本方法能单独使用。或者，本方法能与其它抗心肌梗死方法联合使用。本方法也能与其它抗心肌梗死药剂联合使用例如心肌梗死病人长期口服小剂量的阿司匹林或双嘧达莫对抗血小板的聚集和粘附，被认为有预防心肌梗死复发的作用。例如预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是溶血栓药如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)、甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是心律失常治疗药物如利多卡因、美西律、普鲁卡因酰胺、溴苄铵、丙吡胺、妥卡尼、阿托品或奎尼丁肾上腺皮质激素、异丙肾上腺素或麻黄素等。血管收缩药多巴胺、多巴酚丁胺、间羟胺(阿拉明)、去甲肾上腺素等。血管扩张药可选用硝酸甘油、硝普钠、酚妥拉明、二硝酸异山梨醇、硝苯地平或东莨菪碱等。β阻滞剂如阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔等。预防、治疗或延缓心肌梗死和临床症状及其并发症的药物可以是ACEI如卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利或喹那普利等。钙离子拮抗剂如硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫等。促进心肌代谢药物维生素C、辅酶A、肌苷酸钠、细胞色素C、维生素B6等。以及洋地黄类、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等药物。透明质酸酶、吗啡或哌替啶和利尿剂糖皮质激素如甲基强的松龙。抗凝剂如肝素、华法林或双香豆素或苯茚二酮等其它抗心肌梗死药剂。其它抗心肌梗死治疗或药剂能够用于神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白的核酸，或其功能片段或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质的使用之前、之中或之后。举实施例而言，神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白的核酸，或其功能片段能与抗心肌梗死药剂共同使用。任何适合于基因治疗的病毒载体能在本联合使用中加以使用。例如，腺病毒载体(美国专利No.5,869,305)、猴病毒载体(美国专利No.5,962,274)、条件复制型人免疫缺陷型病毒载体(美国专利No.5,888,767)、反转录病毒、猿猴病毒-40、单纯性疱疹病毒扩增子载体和牛痘病毒载体能够使用。并且，这些基因能转入非病毒载体系统，例如脂质体，在脂质体中，脂质在凝聚过程中保护DNA或其它生物物质不受氧化。
根据本发明，无论单独或是与其它药剂、载体或赋形剂联合使用的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质可以系统用于任何的给药途径，诸如海绵体内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、皮内注射、口服或局部用药。本方法可以使用以单位剂量形式、一次用量针剂或多剂量容器的含有添加的防腐剂的注射制剂。该配方可以采用油质或水质赋形剂中的悬浊液，溶液或乳浊液形式并且可以包含配方试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。活性成分也可以是粉状，以便在使用前与适合的载体、无菌不含热源的水或其他溶剂混合。本发明的局部用药可以采用泡沫状物、凝胶体、霜、药膏、透皮药膏或软膏。
可能用于本发明的药物治疗可接受的组合物和方法包含在，但不仅仅限于美国专利Nos.5,736,154；6,197,801 B1；5,741,511；5,886,039；5,941,868；6,258,374 B1；和5,686,102中。
治疗或预防中药物治疗剂量的大小将随治疗的状况的严重程度和给药途径变化。剂量和剂量频率也将根据病人自身年龄、体重、疾病状况和反应而变化。
主治医生应当知道怎样和何时由于药物毒性或不利的效应终止、中断或将治疗调整到低剂量。相反地，医生应当知道怎样和何时由于临床效应不足(排除了毒性副效应)，将治疗调整到高水平。
任何适合的给药途径可以使用。剂量形式包括片剂、锭剂、扁囊剂、分散体、悬浊液、溶液、胶囊、药膏和类似形态。(参考，雷明顿氏药物治疗科学)在实际应用中，无论单独或是与其它药剂联合使用的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，可以根据传统药物治疗混合技术作为活性成分与诸如β-环糊精和2-羟基-丙基-β-环糊精的药物治疗载体或赋形剂形成紧密添加混合物。载体根据期望使用方式，局部或注射用药，采取多种配制形式。在制备用于注射剂的组合物时，例如静脉注射或静脉灌输，相同的制药介质可以使用，水、乙二醇、油、缓冲液、糖、防腐剂、脂质体和其他具有本技术领域技能的人所知的介质。注射组合物的实例包括，但不限于，5％w/v的葡萄糖、正常生理盐溶液或其他溶液。神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，剂量可以从25μg到2500μg。待给药的神经调节蛋白，或其功能片段，或者编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质的总剂量可以在一小瓶含有体积从1毫升到2000毫升的静脉内液体中使用。根据所用的总剂量，稀释液体体积将有所变化。
实施例1.神经调节蛋白基因的扩增神经调节蛋白基因定位于染色体8P12，有大约13个外显子结构。构建的神经调节蛋白由61个氨基酸组成，理论分子量为7055D，SDS-PAGE电泳表观分子量为6500-7000D，等电点在6.5左右，无糖基化位点，含三个二硫键，适合用大肠杆菌系统进行表达。选用PET22b作为表达质粒，导入人神经调节蛋白基因后转化大肠杆菌BL21，经过筛选得到高表达重组人神经调节蛋白的工程菌株。
神经调节蛋白基因的扩增。从人5个月胚胎脑组织提取总RNA和mRNA，逆转录成cDNA，以此为模板，进行RT-PCR获得目的基因。取PCR扩增产物经1.5％琼脂糖电泳，可见特异的183bp大小扩增片段，与设计片段长度相符。
实施例2重组人神经调节蛋白的制备用氯化钙沉淀法将人神经调节蛋白基因克隆至PET22b表达质粒中，构建成重组人神经调节蛋白表达质粒(PET22b-人神经调节蛋白)，此蛋白在T7启动子的驱动下，高效表达。表达基因N端从NdeI位点插入，C端有终止子紧接在最后一个氨基酸处，所得蛋白不与任何氨基酸形成融合蛋白。经酶切切出约183bp的正确片段。转化子经酶切鉴定后，提取双链DNA进行核甘酸序列测定。结果证实，表达载体上的人神经调节蛋白序列完全正确。
神经调节蛋白cDNA的顺序为(SEQ ID NO2)AGC CAT CTT GTA AAA TGT GCG GAG AAG GAG AAA ACT TTC TGTGTG AAT GGA GGG GAG TGC TTC ATG GTG AAA GAC CTT TCA AACCCC TCG AGA TAC TTG TGC AAG TGC CCA AAT GAG TTT ACT GGTGAT CGC TGC CAA AAC TAC GTA ATG GCC AGC TTC TAC AAG GCGGAG GAG CTG TAC CAG根据上述cDNA顺序编码的氨基酸顺序为(SEQ ID NO1)
SHLVKCAEKEKIFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ取经PCR和酶切鉴定的工程菌克隆(BL21-PET22b-人神经调节蛋白)，随机挑选一系列单菌落接种于2ml LB-Amp液体培养基，置37℃、250rpm培养过夜，然后按一定比例接种于20ml LB-Amp培养液中，37℃培养至OD600达1.0时加入IPTG诱导4h，收集菌体。破菌后收集包涵体，15％SDS-PAGE电泳、薄层扫描分析、Western-blotting鉴定，经反复筛选获得一株稳定高表达目的蛋白神经调节蛋白的工程菌(BL21-PET22b-人神经调节蛋白)。该菌株表达的目的蛋白占菌体总蛋白的10％左右。经高压匀浆破菌后，目的蛋白以包涵体形式存在。工程菌在IPTG诱导4h后，菌体经SDS-PAGE电泳，包涵体占菌体总蛋白的20％左右；纯化后的重组神经调节蛋白比活性＞5×103EU/mg，表明神经调节蛋白工程菌株构建成功。在筛选工程菌时进行的SDS-PAGE、Western Blot、生物学活性测定的基础上，进行人神经调节蛋白氨基酸组成分析、N-末端序列分析，结果表明所表达的重组人神经调节蛋白氨基酸序列与设计相符。
实施例3.NRG-1对心肌梗死动物的治疗实验实验材料与方法动物选用300-350g、雄性、SD大鼠(由上海医科大学实验动物中心提供)。
模型制作方法按照Johns and Olson(Johns，T.N.P.，and B.J.Olson.Experimental myocardial infarction.I.A method of coronary occlusion in smallanimals.Ann.Surg.140675-682，1954.)结扎大鼠左冠状动脉，结扎一周后做心超，选EF(射血分数)下降70％左右大鼠为成功的心肌梗死模型。
分组及处理分为4组，每组10只。假手术组进行手术但不结扎大鼠左冠状动脉，不进行任何处理；阴性对照组给心肌梗死大鼠尾部注射PBS；阳性对照组给心肌梗死大鼠灌胃维拉帕米8mg/kg(上海九福药厂)，每日2次；实验组给心肌梗死大鼠尾部注射神经调节蛋白90μg/kg/d，连续给药11天。所有大鼠在处理前1天、处理第5天及第11天心超观察。在第11天处死，进行病理分析。
实验结果1.NRG-1对心肌梗死大鼠LVEDD及LVESD的作用如表1所示，与PBS组比较，NRG-1可降低心肌梗死大鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)及左心室收缩末期内径(LVESD)的作用。给药第5天、第11天NRG-1可降低心肌梗死大鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)的作用(P＜0.05)。NRG-1可降低心肌梗死大鼠左心室收缩末期内径(LVESD)，NRG-1组与PBS组比较，给药第5天P＜0.05，给药第11天，P＜0.001。
表1.NRG-1对心肌梗死大鼠LVEDD及LVESD的作用LVEDD(mm) LVESD(mm)Day 0 Day 5 Day 11 Day 0 Day 5 Day 11假手术组 0.570±0.037 0.553±0.050 0.465±0.0460.258±0.051 0.236±0.029 0.156±0.039维拉帕米 0.712±0.084 0.739±0.119 0.727±0.1310.557±0.101 0.531±0.127 0.523±0.170PBS组 0.705±0.117 0.792±0.083 0.847±0.1010.558±0.119 0.594±0.110 0.677±0.105NRG-1 0.730±0.108 0.718±0.068*0.727±0.092*0.575±0.119 0.463±0.096*0.460±0.142*2.NRG-1对心肌梗死大鼠左心室EF及Fs的作用如表2所示，与PBS组比较，NRG-1可提高大鼠左心室射血分数(EF)(P＜0.001)及左心室缩短分数(Fs)的作用(P＜0.05)。可见，NRG-1可明显改善大鼠心功能的作用。
表2.NRG-1对心肌梗死大鼠左心室EF及Fs的作用EFFsD0 D5 D11 D0 D5 D11假手术组 89.320±4.908 91.080±2.70895.040±3.13354.980±6.467 57.380±4.37865.640±7.501维拉帕米 49.492±12.132 61.527±11.473 60.786±16.693 22.146±6.629 28.933±7.72629.757±11.213PBS 48.275±10.307 51.050±9.04942.650±6.35521.333±5.585 25.450±7.62818.310±3.185NRG-1 49.269±11.440 72.973±11.586*75.720±10.780*21.723±6.429 35.785±10.779*41.280±10.980*3.NRG-1对心肌梗死大鼠左心室IVS及促进毛细血管增生的作用如表3所示，与PBS组比较，NRG-1对心肌梗死大鼠室间隔厚度(IVS)以及对心肌梗死大鼠具有促进纤维化区域内毛细血管增生作用(P＜0.05)。
表3.NRG-1对心肌梗死大鼠左心室IVS及促进毛细血管增生的作用IVS 毛细血管数(个/mm2)D0D5D11 D11假手术组 0.173±0.006 0.178±0.008 0.187±0.0120.000±0.000维拉帕米 0.169±0.017 0.164±0.013 0.162±0.0287.775±2.309PBS 0.162±0.014 0.162±0.009 0.146±0.0166.490±2.173NRG-1 0.164±0.018 0.161±0.020 0.182±0.041*10.123±2.995*
SEQUENCE LISTING<110>上海泽生科技开发有限公司<120>神经调节蛋白用于心肌梗死治疗的方法和组合物<130>
<140>
<141>2002-11-08<150>
<151>
<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>183<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc 60ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt 120actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac 180cag<210>2<211>61<212>PRT<213>智人(Homo sapiens<400>2Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val1 5 10 15Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser20 25 30Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys35 40 45Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln50 55 60
权利要求
1.一种组合物，该组合物包括有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质以及有效量的预防或治疗心肌梗死的药物组成。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中神经调节蛋白通过与ErbB2-ErbB4受体结合，从而产生抗心肌梗死的作用。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中神经调节蛋白促使心肌梗死血管增生，从而产生抗心肌梗死的作用。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中神经调节蛋白选自神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3或神经调节蛋白4。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中神经调节蛋白1是神经调节蛋白α2或神经调节蛋白β2。
6.根据权力要求1所述的组合物，其中神经调节蛋白片段为神经调节蛋白β2片段，含有SEQ ID1的氨基酸序列。
7.根据权力要求1所述的组合物，其中预防或治疗心肌梗死的药物包括ACEI、β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、阿司匹林、阿托品、硝酸甘油、东莨菪碱以及溶栓类药物。
8.根据权力要求7所述的组合物，ACEI选自卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利、喹那普利、西拉普利(cilazapril)或培哚普利(perindopril)其中任一。
9.根据权力要求7所述的组合物，β受体阻滞剂选自阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔其中任一。
10.根据权力要求7所述的组合物，钙离子拮抗剂选自硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫其中任一。
11.根据权力要求7所述的组合物，溶栓类药物选自尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)或甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)其中任一。
12.根据权利要求1所述的组合物，包括药理学可接受载体或赋形剂。
13.一种试剂盒，该试剂盒包括置于容器中的权利要求1所述的用于预防、治疗和延缓心肌梗死的组合物及其使用说明。
14.一种预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死的方法，该方法包括对需要或希望这种预防、治疗或延缓的哺乳动物施用有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，因而可以预防、治疗或延缓所述心肌梗死。
15.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白通过与ErbB2-ErbB4受体结合，从而产生抗心肌梗死的作用。
16.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白促使心肌梗死血管增生，从而产生抗心肌梗死的作用。
17.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白选自神经调节蛋白1、神经调节蛋白2、神经调节蛋白3或神经调节蛋白4。
18.根据权利要求17所述的方法，其中神经调节蛋白1是神经调节蛋白α2或神经调节蛋白β2。
19.根据权力要求14所述的方法，其中神经调节蛋白片段为神经调节蛋白β2片段，含有SEQ ID1的氨基酸序列。
20.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，可以拮抗心肌梗死LVEDD及LVESD的提高。
21.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，可以拮抗心肌梗死的左心室射血分数降低作用。
22.根据权利要求14所述的方法，其中哺乳动物为人类。
23.根据权利要求14所述的方法，心肌梗死的临床症状选自左心室扩大、心室收缩功能下降或充盈压升高其中任一。
24.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质与药理学可接受载体或赋形剂一起使用。
25.根据权利要求14所述的方法，其中包括使用神经调节蛋白、或其功能片段。
26.根据权利要求14所述的方法，其中包括使用编码神经调节蛋白或其功能片段的核酸。
27.根据权利要求14所述的方法，其中还包括使用预防或治疗心肌梗死的药物。
28.根据权力要求27所述的方法，其中预防或治疗心肌梗死的药物包括ACEI、β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、阿司匹林、阿托品、硝酸甘油、东莨菪碱以及溶栓类药物。
29.根据权力要求29所述的方法，ACEI选自卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利、喹那普利、西拉普利(cilazapril)或培哚普利(perindopril)其中任一。
30.根据权力要求29所述的方法，β受体阻滞剂选自阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔其中任一。
31.根据权力要求29所述的方法，钙离子拮抗剂选自硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫其中任一。
32.根据权力要求29所述的方法，溶栓类药物选自尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)或甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)其中任一。
33.根据权利要求14所述的方法，其中神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质在体内使用。
全文摘要
本发明涉及用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心肌梗死的成分及方法。更具体说，本发明提供了一种可预防、治疗或延缓哺乳动物心肌梗死方法，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延缓的哺乳动物尤其是人类施用有效量的神经调节蛋白、或其功能片段、或编码该蛋白或功能片段的核酸，或提高上述神经调节蛋白产量和(或)功能的物质，因而可以预防、治疗或延缓所述心肌梗死。本发明还提供了神经调节蛋白及提高神经调节蛋白产量和(或)功能的物质用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心肌梗死的组合物、试剂盒及有效药物成分。
文档编号A61P9/00GK1498656SQ0214514
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月8日 优先权日2002年11月8日
发明者周明东 申请人:上海泽生科技开发有限公司