专利名称：组织再生调节物的制作方法
技术领域：
本发明涉及在损伤或再生的组织中得到正调节的蛋白质，以及编码这些蛋白质的DNA。本发明还涉及包含这些蛋白质的治疗组合物和治疗方法。
背景技术：
在组织发育期间和损伤后组织修复期间发生组织结构的动态重建。为了研究这一过程，我们曾集中于缺血-再充血刺激造成的肾受伤模型方面的研究。
肾能够经过一系列复杂过程来修复对近侧小管上皮细胞的损坏，这一系列复杂过程包括细胞死亡、近侧小管上皮细胞的增殖、在剥落底膜上微弱分化的再生上皮细胞的形成以及再生上皮细胞的分化，从而形成具完全功能性的近侧小管上皮细胞(Wallin等，Lab.Invest.66:474-484,1992；Witzgall等，分子细胞生物学，13:1933-1942,1994；Ichimura等，Am.J.Physiol.269:F653-662,1995；Thadhani等，N.Engl.J.Med.334:1448-1460,1996)。这一修复过程牵涉生长因子，如IGF,EGF，和HGF，也牵涉内皮细胞粘着分子ICAM-1。然而，仍不清楚小管上皮细胞的恢复机理。
为了确定小管上皮细胞损伤和修复过程中的有关分子，我们利用表现区别分析(RDA)法在mRNA群体中分析损伤的/再生的肾和正常肾之间的差别。RDA是一种用于扣除反应的基于PCR的方法，其通过重复扣除和扩增来产生靶组织或细胞特异性cDNA片段(Hubank和Schua，核酸研究22:5640-5648,1994)。
发明概要本发明总的来说提供与肾损伤有关的分子(此后每一分子称为″KIM″)，其在肾受损伤后在肾部组织中得到正调节。本发明的KIM蛋白质和肽，和它们的兴奋剂和拮抗剂，以及与其有相当疗效的物质，在各疗程中均有用。
本发明提供了一种纯化和分离的DNA分子，其具有在SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中说明的核苷酸序列。本发明也包括这些序列的互补链，在严格条件下与上述DNA分子进行杂交的DNA分子，以及(如果没有遗传密码的简并性)将与以上限定的任何DNA分子进行杂交的DNA分子。这些DNA分子可能是重组体，并可以可操作地连接于一表达控制序列上。
本发明还提供了一种包含纯化和分离的DNA分子(具有在SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6中描述的核苷酸序列)或以上定义的任一其它DNA分子的载体。这一载体可能是一个具生物学功能的质粒或一病毒DNA载体。本发明提供了一种原核或者真核宿主细胞，其由包含SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或SEQ IDNO:6中描述的DNA分子的载体来稳定地转化或转染。在本发明的另一实施方案中，提供了由如以上描述的DNA分子编码的KIM多肽产物的产生过程，该过程包括在合适的培养条件下培养用DNA分子转化或转染(以使DNA分子得以表达的方式)的原核或真核宿主细胞，并回收上述表达的多肽产物。
一种本质上无其它人蛋白质的纯化和分离的人KIM蛋白质，其特定包含于本发明范围内，含有KIM蛋白质的部分或者全部一级结构构象和生物活性的多肽产物的产生过程也包含在本发明范围内。本发明的KIM蛋白质可能具有包含SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或者可以是SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的变体，或者可以是由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6的DNA编码的纯化和分离蛋白质。可以提供本质上无其它人蛋白质的这些蛋白质。本发明还包括这些蛋白质的变体，如可溶性变体或者融合蛋白质。本发明的KIM融合蛋白质可能包含免疫球蛋白、毒素、可成像化合物或者放射性核素。
本发明也提供了抗上述KIM蛋白质的特异性单克隆抗体。抗KIM抗体可能与毒素、可成像化合物及放射性核素有关。本发明还说明的是产生这种特异性抗体的杂交瘤细胞系。
药物组合物也在本发明范围内。本发明的药物组合物可包含治疗有效量的、与药理学上可接受载体一起施用的本发明KIM蛋白质或抗KIM抗体。诊断方法在本发明之内，如通过测定已患肾病或处于肾病发展危险的受治疗者尿液、血清或尿沉淀物中的KIM浓度，来评价肾部伤害病症是否消退或消退过程。
本发明的治疗方法包括对受治疗者施用治疗有效量的KIM、KIM变体、KIM类似物、KIM融合蛋白质、KIM兴奋剂以及抗KIM或KIM配体的抗体。本发明的其它治疗化合物包括KIM配体、抗KIM抗体以及KIM配体的融合蛋白质。这些化合物可以有用于刺激或抑制(取决于KIM功能)细胞应答的治疗方法中。
本发明的另一方法通过使表达KIM的肿瘤细胞与KIM配体的融合蛋白质和毒素或放射性核素接触，或者与连结于毒素或者放射性核素上的抗KIM抗体接触，来抑制该肿瘤细胞的生长。同样地，表达KIM配体的肿瘤细胞的生长，也可通过使之与KIM的融合蛋白质和毒素或放射性核素接触，或者与连结于毒素或者放射性核素上的抗KIM配体抗体接触而受到抑制。
本发明也包括基因治疗的方法。该方法包括患有肾功能紊乱的受治疗者的治疗方法，促进受治疗者体内的新组织生长的方法，以及促进受治疗者体内受到破坏的组织的存活的方法，包含向受治疗者施用一种包含DNA(包含SEQ ID DNA NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6的核苷酸序列)的载体。
在体外或体内，本发明的化合物对成像组织来说也是有用的。该方法包括将一种可成像化合物导向表达具有SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的蛋白质的细胞，使细胞与本发明的任一单克隆抗体或任一含有上述蛋白质的融合蛋白质接触，其中这些单克隆抗体或融合蛋白质融合到可成像化合物上。对于体内方法，细胞在受治疗者体内，将蛋白质或单克隆抗体施用于受治疗者。
本发明也包括诊断方法，如确定受治疗者者体内肾细胞的损伤或再生，包括比较受治疗者肾细胞中SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6的表达水平和对照肾细胞中的上述序列的对照表达水平。本发明的另一方法包括确定细胞中SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6的正调节，包括使细胞与反义探针接触并测量与细胞内的RNA的杂交。
本发明诊断方法的另一实施方案包括评估在尿液、血清或其它体液中或者在尿沉淀物或者组织样品中的本发明分子的存在或其浓度。测得的有关损伤的分子与病理过程的存在、程度或阶段密切相关。这一相互关系也可用来评估治疗方法的有效性。
附图简要描述
图1是鼠克隆cDNA 3-2的核苷酸序列，具有推定的蛋白质读框615-1535。
图2是鼠克隆1-7的cDNA序列表，具有推定的蛋白质读框145-1065。
图3是鼠克隆4-7的cDNA序列表，具有推定的蛋白质读框107-1822。
图4是人克隆HI3-10-85的cDNA和推定的氨基酸的序列表，具有推定的蛋白质读框1-1002。序列表的上行是cDNA序列(SEQ ID NO:6)，下行是推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。
图5是人克隆HI3-10-85与鼠克隆3-2的核苷酸序列的BESTFIT比较。
发明的详细描述我们通过利用表现度示差分析法(RDA)分析再生和正常肾之间的mRNA表达的差别，来鉴别KIM基因。RDA是用于扣除反应的基于PCR的方法，该扣除反应通过重复减少和扩增来产生靶组织或细胞特异性cDNA片段。48小时局部缺血后的成年鼠肾RNA的cDNA表象，用来自正常(伪操作)成年鼠肾的样品来扣除。在这一方法中，除去局部缺血处理后的肾样品和正常肾样品的共同序列，留下仅在受伤的肾组织中特异表达的那些序列。上述基因编码在治疗学上有益于肾功能紊乱及有关肾损伤过程的蛋白质。获得几个克隆，并对其进行测序和鉴定。随后利用Northern分析和RNA原位杂交来研究克隆在肾修复、发育和组织分配期间的表达模式。序列识别号核苷酸和氨基酸序列是指在详细描述中已给出下列序列识别号的核苷酸和氨基酸序列SEQ ID NO:1-大鼠3-2 cDNA插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO:2-大鼠1-7 cDNA插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO:3-由大鼠3-2和1-7 cDNA的基因编码的大鼠KIM-1氨基酸序列SEQ ID NO:4-大鼠4-7 cDNA插入片段的核苷酸序列SEQ ID NO:5-由4-7 cDNA插入片段编码的氨基酸序列SEQ ID NO:6-人cDNA克隆H13-10-85的核苷酸序列SEQ ID NO:7-由人cDNA克隆H13-10-85编码的氨基酸序列术语的定义″KIM蛋白质″，在这里作为″KIM″的同义词使用，是一种由mRNA编码的蛋白质，该mRNA在肾损伤之后得到选择性地正调节。所感兴趣的KIM蛋白质组包括由mRNA编码的那些蛋白质，该mRNA在损伤(导致对肾组织的损伤)后一周内的任何时间得到选择性地正调节。可以鉴定这种正调节的时间的例子包括损伤后的10小时、24小时、48小时或者96小时。损伤类型的例子包括那些导致局部缺血、毒害的损伤或其它类型的损伤。
″KIM兴奋剂″是一种分子，其特定地触发通常由KIM与KIM配体相互作用触发的细胞应答。KIM兴奋剂可以是KIM变体、或者抗KIM的特异性抗体、或者可溶性形式的KIM配体。
″KIM拮抗剂″是一种分子，该分子可与KIM或KIM配体特异性相关，由此阻断或者以其它方式抑制KIM与KIM配体的结合。拮抗剂结合作用阻断或抑制细胞应答，该细胞应答将通过KIM配体与KIM或KIM兴奋剂的连接以其它方式触发。KIM兴奋剂可以是某些KIM变体、KIM融合蛋白质以及抗KIM配体或KIM的特异性抗体。
″KIM配体″是非共价地、特异性地结合到KIM蛋白质上的任一分子。这种配体可以是任何形式(包括天然存在的、重组产生的、或其它合成形式)的蛋白质、肽、类固醇、抗体、氨基酸衍生物、或者其它类型分子。KIM配体可以是任何形式的，包括可溶性形式，膜结合形式，或者作为与免疫球蛋白、脂肪酸、或其它组分的融合构建体的一部分。KIM配体可以是一种整联蛋白。膜结合KIM配体可充当受体，该受体当与KIM结合或缔合时触发细胞应答。在一些相互作用中，KIM可以与不止一个的单KIM配体结合，或者与为复合物(具有一个或多个其它分子或辅因子)一部分的KIM配体结合。在KIM和KIM配体都结合于细胞膜上的情况下，KIM可以与KTM配体(结合到与KIM一样的细胞上)缔合和反应，或者它可以与结合到第二个细胞上的KIM配体缔合和反应。当KIM连接反应发生在结合于不同细胞的分子之间时，就细胞类型或来源、表型条件或代谢条件、或者细胞对给定刺激的应答(例如生长、分化或者编程性细胞死亡)的类型或程度而论，两个细胞可以是相同的或者不同的。″KIM连接反应″指KIM与KIM配体的接触和结合。
″序列的对比″意指一种序列的核苷酸或氨基酸的定位以及另一序列的核苷酸或氨基酸的的定位，这种定位使一个序列与另一个序列的相关部分的序列比较得以进行。这一过程的方法的例子由Needleman等(分子生物学杂志。48:443-453,1970)给出。该方法能通过如Align程序(DNAstar,Inc.)的计算机程序方便地实施。正如将由本领域技术人员所了解的一样，同源的及功能上等同的序列包括在保守的半胱氨酸骨架内的半胱氨酸残基的功能上等同的排列(包括改变这些半胱氨酸线型排列的氨基酸插入或缺失)，但实质上并不削弱它们在蛋白质的折叠结构方面的关系。因此，忽略候选序列中的内部缺口和氨基酸插入片段，其目的在于计算候选和参考序列之间的氨基酸序列同源性或者等同性水平。建立蛋白质同源性时经常使用的一个特征是使一种蛋白质和另一种蛋白质具有相似的半胱氨酸残基数量和位置。
″反义DNA″指被转录的染色体DNA序列。
″反义探针″指至少包含感兴趣核苷酸部分的部分反义DNA的探针。
″克隆″意指利用体外重组技术将一种具体基因或其它DNA序列插入载体分子。为了成功地克隆所需的基因，有必要使用用于产生DNA片段的方法，用于将DNA片段连接到载体分子上的方法，用于把复合DNA分子引入宿主细胞(可以复制品)的方法，以及用于从受体宿主细胞中选择有靶基因的克隆的方法。
″cDNA″意指通过依赖RNA的DNA聚合酶的反应(逆转录酶)由RNA模板产生的互补或者拷贝DNA。因此，″cDNA克隆″意指互补于感兴趣的RNA分子的双螺旋DNA序列，其由克隆载体携带。
″cDNA文库″意指包含cDNA插入物的重组DNA分子的集合，cDNA插入物取决于RNA模板的来源，同时包含存在于整个有机体或者组织中的mRNA分子的表象。这样一种cDNA文库通过技术人员所知的方法制备，如Maniatis等所描述的分子克隆实验室手册，同上。一般地，首先从有机体细胞分离RNA，该有机体是期望从其基因组克隆一个特殊基因的有机体。对于本发明的目的优选是哺乳动物，特别是人类，细胞系。或者，RNA可从肿瘤细胞分离，得自动物肿瘤，优选得自人肿瘤。因此，一种文库可从如人肾上腺肿瘤制备，但是可以利用任何肿瘤。
如本文这里所使用的，术语″DNA多态性″指其中在DNA的一个特定位点上可存在两个或者多个不同的核苷酸序列的情况。
″表达载体″包括能够表达包含在其中的DNA序列的载体，即，编码序列可操作地连接到其它能够影响它们表达的序列上。它暗含着(虽然不总是明确说明)这些表达载体必须是可作为游离基因或者作为染色体DNA的整合部分在宿主有机体中重现。有效表达载体的一种有用的、但不必要的因子是编码序列的标记，它是一种编码导致细胞表型性质(如四环素抗性)的蛋白质的序列，这些细胞含有使其易于鉴定的蛋白质。总之，″表达载体″得到一个功能定义，当将它运用于所规定的序列时，任何能够影响特定包含DNA密码的表达的DNA序列都包括在这一术语中。象现在，这样的载体经常以质粒形式存在，这样的″质粒″和″表达载体″经常可以互换使用。然而，本发明旨在于包括这样的其它形式的表达载体，这些表达载体具有等同的功能，并能够经常被本领域所了解。
″功能衍生物″意指分子的″片段″、″变体″、″类似物″或者″化学衍生物″。分子的″片段″(例如本发明的任何抗原)意思是该分子的任何多肽子集。这种分子的″变体″意指本质上类似于整个分子或其片段的天然存在的分子。分子的″类似物″意指本质上类似于整个分子或其中的某些片段的非天然分子。
术语″基因″意指编码肽的多核苷酸序列。
″均一″，当用于肽或者DNA序列时，意指存在于所考虑的组合物中的本质上所有分子的主要分子结构(即氨基酸或者核苷酸序列)是完全相同。
″分离的″指本发明的蛋白质，或者编码任何这种蛋白质的任何基因，其本质上分别无其它蛋白质或基因，以及其它通常可在自然界发现的污染物和以这种形式存在于自然界但不能发现的污染物。
术语″标记″指能够检测的分子部分，包括例如(无限制性)放射性同位素、酶、发光剂和染料。
术语″探针″指能够有选择地与靶抗配体结合的已知质量的配体。当应用于核酸时，术语″探针″指具有互补于靶链的碱基序列的核酸链。
″重组宿主细胞″指由通过重组DNA技术构建的载体转化的细胞。正如这里所定义的，由重组体宿主细胞产生的抗体或者其修饰借助于这一转化，更少量(或者更一般地，少于可检测的量)将由非转化宿主所产生。
″本质上纯化″意指本发明的任何蛋白质或者编码任何这种蛋白质的任何基因，其本质上分别无其它的蛋白质或基因，以及其它通常可在自然界发现的污染物，和以这种形式存在于自然界但不能发现的污染物。
如果两个分子中的氨基酸序列本质上相同，并且如果两个分子具有类似的生物活性，那么就说一个分子″本质上类似于″另一个分子。因此，即使一个分子中含有另一个分子中不存在的另外的氨基酸残基，或者即使氨基酸残基序列不完全等同，只要两个分子具有一种类似的活性，就认为它们为互变体(如这里所使用的术语)。如这里所使用的，当一分子含有另外的化学组成部分而非通常的分子部分时，就说一分子是另一个分子的″化学衍生物″。这样的组分能改进分子的溶解性、吸收性、生物半寿期等等。该组分或者也能减少分子的毒性，除去或者削弱分子的任何不受欢迎的副作用等等。能够介导这种影响的组分已经公开，例如，在Remington’s药物科学中。第16次编辑，Mack出版公司，Easton,Penn,(1980)。
″载体″意指从DNA片段可以插入其中或者得到克隆的质粒或者噬菌体衍生而来的DNA分子。载体将含有一个或多个唯一的限制酶切位点，并且能在所定义的宿主或者载体有机体中进行自主复制，以致于这样的克隆序列具有再生性。本发明的化合物本发明包括SEQ IDNO:1、SEQ IDNO:2、SEQ IDNO:4或者SEQID NO:6的cDNA，也包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6的序列以及这些序列的衍生物。本发明也包括载体、脂质体以及其它含有这些序列或其衍生物的载体工具。本发明还包括从SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6转录而来的蛋白质，包括但不限于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQID NO:7以及它们的衍生物和变体。
本发明的一实施方案包括一种KIM蛋白质的可溶性变体，这种蛋白质通常作为膜缔合蛋白质合成，并且在受损伤后得到正调节。可溶性变体至少缺少天然KIM蛋白质的跨膜或内膜部分。在一些例子中，可溶性变体缺少天然KIM蛋白质的整个跨膜或者内膜部分。可溶性变体包括融合蛋白质，融合蛋白质又包括至少缺少天然KIM蛋白质的跨膜或者内膜部分的KIM蛋白质衍生物。所有类型的KIM融合蛋白质都包括在其中，特别是那些掺入有his标记、Ig标记、和myc标记的分子形式的融合蛋白质。这些KIM融合蛋白质可以具有利于治疗的种种特征，如由Ig标记赋予增加的半寿期。可溶性融合蛋白质也包括融合有KIM蛋白质的所选择结构域部分的融合蛋白质。
在氨基酸序列方面或者不包括序列在内的其它方面，或者在两方面，变体不同于天然存在的KIM蛋白质。当用一种不同的天然氨基酸、氨基酸衍生物或者非天然氨基酸取代天然存在于氨基酸中的一个或多个氨基酸时，就产生氨基酸序列变体。特别是优选的变体包括天然存在的KIM蛋白质、或者天然存在的KIM蛋白质的生物活性片段，它们的序列通过一个或多个氨基酸保守取代而不同于野生型序列，这种保守取代典型地对蛋白质或者肽的二级结构与疏水性质具有最小限度的影响。变体也可以含有这样一些不同于其它序列的序列，这些序列包含一个或多个并不消除KIM蛋白质生物活性的非保守氨基酸的取代、缺失或者插入。保守取代典型包括用另一性质相似的氨基酸取代一氨基酸，例如发生在以下基团之间的取代缬氨酸、甘氨酸，甘氨酸、丙氨酸，缬氨酸、异亮氨酸，天冬氨酸、谷氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺，丝氨酸、苏氨酸，赖氨酸、精氨酸以及苯丙氨酸、酪氨酸。非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。阳性氨基酸(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。阴性(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸酸。
其它的保守取代基可从以下表中获得，另外其它的保守取代基由Dayhoff在蛋白质序列和结构图集(1988)中描述。表1保守氨基酸取代
本发明之内的其它变体是那些具有增加肽稳定性的修饰的变体。这样的变体在肽序列中可以含有例如一个或多个非肽键(其代替肽键)。也包括含有不同于天然存在的L-氨基酸残基的变体(如D-氨基酸)或者非天然存在的或合成的氨基酸(如β或者γ氨基酸)和环变体。D-氨基酸代替L-氨基酸向多肽的掺入可增加它的抗蛋白酶抗性。参见如美国专利5,219,990。
一般地，能期待引起在KIM多肽的功能性质方面变化的取代是这样一些取代，其中(ⅰ)一亲水残基(例如丝氨酸或苏氨酸)被一疏水残基(例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸或者丙氨酸)取代；(ⅱ)半胱氨酸残基被任何其它残基取代；(ⅲ)一具有阳性侧链的残基(例如赖氨酸、精氨酸或者组氨酸)被一具有阴性侧链的残基(例如谷氨酸或者天冬氨酸)取代；或者(ⅳ)一具有庞大侧链的残基(例如苯丙氨酸)被一不具有这种侧链的氨基酸(例如甘氨酸)取代。
本发明的肽也可以通过各种变化而得到修饰，如插入、缺失和取代(保守的或非保守的)，其中这种变化在其应用中可提供一定的优点。剪接变体特别包括在本发明中。
在其它实施方案中，用较小保守性的氨基酸取代的变体也可以产生所需的衍生物，例如通过引起电荷、构象和其它生物性质的变化。这样的取代包括，例如疏水残基由亲水残基取代，半胱氨酸或者脯氨酸由另一个残基取代，有小的侧链的残基由一条有大的侧链残基取代或者阳性残基由阴性残基取代。当给出的取代结果不能确切地预料时，可根据这里所公开的方法试验衍生物，以便确定所需特性的存在与否。
本发明的范围内的变体包括蛋白质和肽，其氨基酸序列至少有百分之八十与KIM蛋白质同源。同源序列更优选的是至少百分之九十，或者至少百分之九十五相同。为确定同源性，用于比较的序列长度一般至少是8个氨基酸残基，通常至少是20氨基酸残基。本发明的化合物变体也包括以下之任一蛋白质，这些蛋白质1)含有至少百分之四十与本发明的KIM蛋白质同源的氨基酸序列，并且2)在与KIM序列一起以最佳排列放置(如图5中所描述的人和大鼠KIM-I)时，它的半胱氨酸残基至少有80％与本发明KIM蛋白质中与半胱氨酸结合。
正如取代支架的取代基是可能的一样，用具有类似特性的基团取代结合在支架上的功能基团也是可能的。这些取代最初将是保守的，即取代基团与原基团具有大约相同的大小、形状、疏水性以及带电性。非序列修饰体可以包括，例如天然存在的KIM蛋白质在体内或体外的化学衍生物，以及在乙酰化作用、甲基化作用、磷酸化、羧基化或者葡基化作用下的变体。
本发明也包括特定结合于蛋白质或者蛋白质片段(SEQ ID NO:3、5或者7)的介质。这些介质包括配体和抗体(包括单克隆、单链、双链、Fab片段，而不论它们是否是天然的、人类的、人源化的、初始化的或嵌合的)。关于这些介质的分类在PCT申请95/16709中另外有描述，该申请的说明部分与本文一并参考。实验过程1．从局部缺血和正常的成年鼠肾产生RNA受局部缺血损伤的鼠肾产生方法如Witzgall等(J.Clin Invest.93:2175-2188,1994)所描述。简言之，将一只成年Sprague-Dawley鼠的肾部动脉以及静脉钳制40分钟并使之再充满。在再充满后24小时和48小时从鼠体收获受伤肾。也从伪操作的、正常的成年Sprague-Dawley鼠体中收获肾。
基于Glisin等的方案(生物化学13:2633,1974)从器官制备总RNA。简言之，将所收获的器官立即放置到GNC缓冲液中(4M胍硫氰酸，0.5％SDS,25mM柠檬酸钠，0.1％Sigma消泡剂)，并在冰上用polytron破碎。细胞碎片用一种低速旋转的临床离心机去除，并将上清液放置在5.7MCsCl、25mM乙酸钠、1mM EDTA垫层上面。RNA在15小时转动22K次的SW40Ti转动体中通过垫层成球状。RNA重悬浮于无菌的DEPC处理的水中，以1/10体积量的3M乙酸钠和2.5倍体积量的EtOH沉淀两次。利用mRNA纯化试剂盒分离Poly A+RNA(Pharmacia，产品号27-9258-02)。2.1-7的表现度区别分析(RDA)法分离1-7,3-2和4-7 RDA片段利用Gibco BRL″Superscript ChoiceTM系统cDNA合成试剂盒″，由来自伪操作的和局部缺血48小时后的肾poly A+RNA合成cDNA双链(分类号18090)。第一链通过oligo dT引导并利用SuperscriptⅡTM逆转录酶合成。第二链的产生是利用大肠杆菌聚合酶Ⅰ和RnaseH，其后利用BRL推荐条件下的T4 DNA聚合酶。
RDA分析的方法本质上同Hubank和Schatz所描述的方法(核酸研究22:5640-48,1994)一样。简言之，以限制酶DpnⅡ消化局部缺血48小时后的肾cDNA，并将其连接到R-Bgl-12/24寡核苷酸(参见文献确切的序列)。连接于cDNA上的接头的PCR扩增反应(用Perkin-Elmer标记聚合酶及其对应的PCR缓冲液进行)用来产生初始表象。指定这一PCR产物为″检验扩增子″。相同的方法用于从伪操作鼠肾cDNA产生″驱动扩增子″。
在有选择性的扩增反应后，进行三次检验扩增子和驱动扩增子的杂交产生差异产物一(DPI)、二(DP2)和三(DP3)。DP1产物的产生方法如Hubank和Schatz所描述(核酸研究72:5640-48,1994)。DP2与DP3产物也可用如Hubank和Schatz(id.)所描述的方法产生，除了对于DP2驱动检验比改为5,333∶1和对于DP3驱动检验比改为40,000∶1或4,000∶1外。
从DP3克隆三种RDA产物成为克隆载体pUC 18当利用比例40,000∶1产生DP3时为产物RDA 1-7(252bp)，当利用比例4,000∶1产生DP3时为产物RDA 3-2(445 bp)和4-7(483bp)。利用Pharmacia SurecloneTM试剂盒亚克隆DNA片段(分类号27-9300-01)，从而利用克列诺酶修复PCR片段的末端，并有利于片段的平端连接进入pUC 18载体。3.Northern分析来自鼠体正常成熟肾(伪操作)、局部缺血受损伤48小时后的成熟肾、和18天的早期肾的Poly A+RNA(2.5ug)，将其行电泳和Northern印迹(Cate，细胞45:685,1986)到基因筛TM膜(Dupont)上。在含有10％硫酸盐葡聚糖和100tg/ml tRNA的PSB缓冲液(50mM Tris 7.5、1MNaCl、0.1％焦磷酸钠、0.2％PVP、0.2％菲可、0.2％BSA、1％SDS)中进行的杂交，在65℃下利用三种不同的探针完成1-7 RDA产物、3-2 RDA产物和4-7RDA产物。所有探针均用Pharmacia的″Ready toGoTM″随机引导标记试剂盒进行放射性标记(分类号27-9251-01)。产物RDA1-7、3-2和4-7都与存在于所有三种样品中的mRNAs杂交，而与48小时局部缺血肾RNA样品中的mRNAs杂交能力最强。
成年鼠组织的Northern印迹分析表明在正常的成熟肾、睾丸、脾以及肺脏中1-7基因的表达水平十分低。3-2基因在肝、肾、脾以及脑中表达。4-7基因在脾、肾、肺脏、睾丸、心脏、人脑、肝以及骨胳肌肉中表达。在1-7与3-2印迹的一些组织中不同大小的mRNAs的存在，表明1-7基因和3-2基因的首要转录产物可以经受交互剪接作用和/或聚腺苷酸化作用。4.3-2和4-7cDNA克隆的分离利用合成cDNA的BRL Superscript choiceTM系统和StratageneTMLambda ZapⅡ克隆试剂盒的试剂(分类号236201)，根据制造商推荐的草案，从4μg来自48小时局部缺血后的受损伤的肾的polyA+RNA产生cDNA文库。
用3-2RDA产物作为探针筛选105克隆(如上所述的随机引导标记)。选择八个阳性克隆，从中随机挑选四个用于第二次分析以获得纯化的噬菌体噬斑。在第三次筛选后分离出四个纯化的噬菌体克隆。根据StratageneTMLambda ZapⅡ试剂盒通过体外切除方法从噬菌体分离克隆插入片段。对大约2.6kb的最大插入片段(指cDNA克隆3-2)进行DNA测序。插入片段的序列(SEQ ID NO:1)如图1中所示。cDNA克隆3-2(大肠杆菌K-12,SOLR/p3-2#5-1)已经以ATCC 98061号保藏。除了SEQ ID NO:1的136-605核苷酸代表为一插入片段外，cDNA克隆3-2的序列完全等同于cDNA克隆1-7(SEQ ID NO:2)的序列。因此，SEQ ID NO:2代表SEQ ID NO:1的一种剪接变体形式。1-7的克隆(大肠杆菌K-12 SOLR/pI-7#3-1)已经以ATCC 98060号保藏。
以1-7RDA产物作为探针筛选105个克隆(如上述的随机引导放射性标记)。选择八个阳性克隆，从中随机挑选四个用于第二次分析以获得纯化的噬菌体噬斑。在第三次筛选之后，分离出四个纯化的噬菌体克隆。根据StratageneTMLambda ZapⅡ试剂盒通过体外切除方法从噬菌体分离克隆插入片段。对大约2.0kb的最大插入片段(指cDNA克隆1-7)进行DNA测序。插入片段的序列(SEQ ID NO:2)如图2中所示。
以1-7 RDA产物作为探针筛选105个克隆(如上述的随机引导标记并在65℃下在PSB溶液中杂交)。选择八个阳性克隆，从中随机挑选四个用于第二次分析以获得纯化的噬菌体噬斑。在第二次筛选之后，分离出两个纯化的噬菌体克隆。根据StratageneTMLambda ZapⅡ试剂盒通过体外切除方法从噬菌体分离克隆插入片段。对大约2.4kb的最大插入片段(指cDNA克隆4-7)进行DNA测序。插入片段的序列(SEQ ID NO:4)如图3所示。cDNA克隆4-7(大肠杆菌K-12,SOLRR/p4-7#1-1)已经以ATCC 98062号保藏。5.1-7、3-2和4-7cDNA克隆的特征A.)DNA和蛋白质序列3-2cDNA的序列(图1；SEQ ID NO:1)包含具有307个氨基酸的开放读框(图1,SEQ ID NO:3)。21个氨基酸的信号序列由Von Heijne分析(Von Heijne等，核酸研究。14:14683(1986))推断，并且跨度为大约aa235-257的跨膜域表明3-2产物是细胞表面蛋白质。
1-7cDNA的序列(图2；SEQ ID NO:2)包含具有307个氨基酸的开放读框，其完全等同于3-2cDNA(SFQ ID NO:3)中包含的开放读框。序列的4-7cDNA(图3；SEQ ID NO:4)包含具有572个氨基酸的开放读框(SEQID NO:5)，跨膜域大约位于氨基酸501-521处。
B.)在局部缺血后成年鼠中的以及在对侧肾中的1-7、3-2和4-7mRNAs原位分析根据Finch等描述的方法实行原位杂交(Dev.动力学203:223-240,1995)。简言之，在PBS中将既局部缺血的也对侧肾的肾脏用4％的低聚甲醛进行灌注结合。进一步在4℃条件下结合肾一夜并且进行处理。对石蜡面进行脱蜡和再水化，在PBS中用4％低聚甲醛固定，用蛋白酶K消化，再结合，然后在三乙醇胺缓冲液中用醋酸酐进行乙酰化。随后对该面进行脱水，并在55℃条件下使其与32P-标记的核糖探针杂交一夜，同时由3-2RDA或者1-7 RDA产物产生的33P-标记的核糖探针亚克隆进入pGEM-I1Z的BamH1位点。杂交之后，在高度严格条件下冲洗该面(65℃条件下的2XSSC,50％甲酰胺)。最后再水化该面，涂上一层乳化剂(NBT-2)以便放射自显影，曝光至少一周时间。显影银粒并用甲苯胺蓝复染色该面和进行显微照相。
通过原位杂交对1-7和3-2mRNA表达的分析表明这些基因在受损伤肾中的表达与其在正常的肾面中表达相比，其受到极大的正调节。在外皮和外部骨髓再生细胞中能观察到这种基因的表达，这些细胞的大多数似乎都接近于小管细胞。
对4-7原位RNA表达模式的分析也揭示与正常的成熟肾相比，在局部缺血损伤的肾中这种基因表达更充分。表达的位置显现在渗透细胞中。6).与鼠体3-2cDNA交叉杂交的人cDNA克隆的分离产生一种32P标记的DNA探针(其包含图1中所示的克隆3-2插入片段的546-969核苷酸)，并用其来筛选人类胚胎肝脏λgt10 cDNA文库(Clontech产品号HL5003a)。在与上述相同的标准条件下筛选出1×106个噬斑，但筛选温度为50℃。高度严格冲洗，即在55℃的2×SSC中冲洗过滤物。鉴定出五十个阳性噬菌体，纯化噬斑并制备DNA。利用同上的探针对噬菌体DNA进行Southern分析，最后在55℃条件下用0.5×SSC冲洗Southern印迹过滤物。两克隆被鉴定为阳性。测序克隆H3-10-85的插入片段，发现一编码一定蛋白质的结构域，该蛋白质很大程度上类同于图3中所示的3-2蛋白质。
图4中给出的是人类3-2相关蛋白质的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)和预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。如图5中通过最佳拟合(bestfit)分析显示人类3-2相关蛋白有43.8％完全等同、59.1％类似于鼠类3-2蛋白。两者都含有IgG、粘蛋白、跨膜和细胞质结构域。两种蛋白IgG结构域内的六个半胱氨酸都是保守的。7)KIM-l Ig融合蛋白的产生对于受损伤/再生肾的分子和细胞生物学的研究和作为一种治疗分子，KIM的胞外结构域的融合蛋白和免疫球蛋白(Ig)的Fc域都是有用的工具。为了用人胞外结构域和鼠体KIM-1蛋白产生Kim Ig融合蛋白质，通过PCR扩增KIM-1 cDNA的胞外结构域片段，并在生原体表达载体PCA 125中克隆，以实现在COS细胞中对其的瞬时表达。pCA 125表达载体产生一种融合蛋白质，其具有来自N-端克隆基因的结构和C-端的人类Ig Fc结构域。用质粒SJR 103或104转染COS细胞；这些质粒表达含有人类KIM序列263-1147(SEQ ID NO:6；SJR 103)或者融合于人Ig Fe域胞外结构域的鼠KIM序列599-1319(SEQ ID NO:1；SJR 104)的融合蛋白质。细胞在细胞工厂的DMEM中用10％的FBS培育(Nunc,Naperville,I1)。转染后两至三天，回收培养基，利用Amicon浓缩器浓缩，并利用蛋白质-A琼脂糖柱纯化融合蛋白质。纯化后，根据SOS-PAGE评价融合蛋白质的纯度。本发明化合物的诊断用途特异性结合于SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或者其片段的蛋白质中的本发明抗-KIM抗体，在几种诊断方法中有用。这些药剂用可检测的标识物标记，如荧光屏检测和X光线照相的不透明物质，并可施药于受治疗者而使表达KIM蛋白质的组织得以成像。该药剂也可结合于如山葵过氧化物酶的物质上，这些物质可以用作为免疫细胞化学染剂，从而使KIM蛋白的阳性细胞区域得以显现在组织面上。在该方法中单独使用一种特异性抗体，其结合位点在夹层测定(利用自身结合于可检测标记物的抗-免疫球蛋白抗体)中显现。
在KIM测定身体组织和体液样品中的存在或者浓度的免疫分析方面，KIM蛋白质的特异性抗体也是有用的。这个浓度值可以与不同的疾病状态相关。作为特别感兴趣的一个实施方案，通过测量受治疗者尿液、血浆或者血清中的KIM或KIM片段的浓度，本发明包括一种诊断肾部受伤或者监控肾部修复过程的方法。同样地，也可测量尿液沉淀物中的KIM浓度，特别是尿液沉淀物的细胞碎片。肾部小管细胞的管型，可以在正患有肾病的受治疗者尿液沉淀物中出现，可以含有升高水平的KIM蛋白质和mRNA。
KIM蛋白质的特异性抗体也可以结合于固相支持体(如珠粒或者器皿)上，为测量或进一步纯化和鉴定蛋白质或者它的属性(如翻译后修饰)，其可用于从溶液中去除配体。受治疗者KIM蛋白质的这种特性在识别干扰KIM功能和与反常受治疗者表型有关的有害突变体或者治疗缺陷过程中有用。这种技术的每一项对免疫学领域的技术人员来说都是常规的。
为了实现表达KIM配体的组织成像，特别是肿瘤的成像，另外的成像方法利用了融合于可成像组分上的KIM或者KIM片段。
进一步的诊断技术基于对组织中受正调节KIM mRNA的验证，如表明的有关损伤过程。这一技术经检验发现可应用于如下的鼠体局部缺血受伤模型。
为了确定在受损伤后KIM-1蛋白质的量是否增加，我们钳制每只鼠的一个肾动脉和静脉40分钟，检查局部缺血24和48小时后的肾及其对侧肾的匀桨。肾匀浆用于评估KIM-1蛋白质的存在与否。利用两种不同的抗体进行Western印迹分析可识别三种可检测的蛋白质，在未经局部缺血损伤的对侧肾中检测不到这些蛋白质。链的表观分子量大约是40 kDa、50 kDa和70-80 kDa。通过western印迹发现的三个蛋白质种类，能代表糖基化位点连接的潜在N和O存在时相同蛋白质的糖基化形式。这些蛋白质的每一种都与两套不同的多克隆抗体进行反应的事实，支持了它们是与KIM-1相关并且不是交叉反应带的想法。这一预言的证实来自三种蛋白质的部分CNBr切割的结果，结果揭示它们共享CNBr切割片段。由于预测KIM-1蛋白质的胞质结构域不含有任何主要的翻译后修饰部分，用直接抗KIM-I胞质结构域的抗体检测到的消化过程的两种最小产物(4.7 kDa和7.4kDa)，如果它们起源于相同的蛋白质，那么对于三种不同的KIM-1蛋白质带其应该具有相同的大小。我们观察到KIM1 40 kDa与70-80 kDa蛋白质产生了预测大小的片段迁移。SOkDa蛋白质带的消化也提供了相同的C端特征带肽。
KIM-1序列显现两个N-糖基化推定位点和一个粘蛋白结构域，在这些区域O-糖基化能覆盖多肽链。在局部缺血后肾中所发现的三个KIM-1带能对应于相同的核心蛋白质的糖基化变体。用PNGase F的De-N-糖基化导致三条带都变换成一个较低的分子量，相应的损失大约为3 kDa，表明三种蛋白质都经过了N-糖基化作用。在O-糖基化中的差别可以用来解释这三条带在大小上的差别。本发明的化合物的治疗用途本发明的治疗方法包括有选择地促进或者抑制依赖于KIM连接的细胞应答。其中KIM和KIM配体都与膜结合，并且由不同的细胞表达，转导信号可能发生在KIM-表达细胞中、在KIM配体表达细胞中或者同时发生在两种细胞中。
通过在体内或体外细胞与外源KIM、KIM融合蛋白质或者抗KIM配体的活化抗体接触，可在KIM配体表达细胞中触发KIM配体反应。另外，通过把KIM配体表达细胞与KIM配体拮抗剂相接触(例如，结合到KIM配体的拮抗剂抗体)，或者把内源性KIM与抗-KIM抗体或者其它的抑制KIM与KIM配体有效连接的KIM-结合分子相接触，由内源性KIM触发的表达细胞应答就可能受到抑制。
同样地，在KIM-表达细胞中的由KIM连接触发的反应也可能用外源化合物来促进或者抑制。例如，通过把细胞与可溶性KIM配体或者一定的抗-KIM活化抗体相接触，可引发在KIM-表达细胞中的KIM配体触发反应。另外，通过使KIM-表达细胞与对KIM的拮抗剂相接触(例如，一种以抑制有效的、信号产生的连接反应的方式结合到KIM上的封阻抗体)，或者通过使内源性KIM配体与抗-KIM配体抗体或者抑制KIM与KIM配体有效连接的其它KIM配体-结合分子相接触，通过与内源KIM配体接触触发的KIM表达细胞应答将受到封阻。
以上所述的本发明部分对特殊的治疗用法有用，如对医学领域的技术人员来说很明显的事实，其取决于将要抑制的病理过程或者将要促进的药理所需过程的有关病原学机理。例如，其中的KIM连接导致所需的细胞生长，分化表型的持续，抗各种损伤引起的编程性细胞死亡的抗性，或者其它有利的医疗反应，以上所述的促进配体触发的应答的干涉过程之任一种都可以实现。在选择过程中，在KIM连接产生不理想结果(如肿瘤生长、细胞功能的有害损伤、对编程性细胞死亡的易感性或者促进发炎过程)时，抑制性干涉过程之一可能是有用的。
以下是前述的本发明治疗方法的例子。本发明KIM-缔合化合物的一种治疗用法是治疗肾病患者，促进受治疗者体内新生组织的生长，或者促进受治疗者体内受损伤组织的存活，并且包括步骤给受治疗者服用治疗有效量的本发明KIM蛋白质，或者含本发明蛋白质的药物组合物。这些方法所使用的蛋白质可能是全长KIM蛋白质、可溶性KIM配体蛋白质或融合片段的一个片段，或者一种KIM促效药。这些方法在实践应用中也可能是给受治疗者服用治疗有效量的本发明促效药抗体，或者含本发明促效药抗体的药物组合物。一种KIM蛋白质可以和治疗有效量的第二种化合物同时服用，该化合物发挥一种医疗上所需的附加作用。对于这些方法感兴趣的组织可以包括任何组织，而优选的组织包括肾组织、肝、神经组织、心脏、胃部、小肠、脊髓或者肺脏。本发明化合物适合治疗的肾病包括急性肾衰竭、急性肾炎、慢性肾衰竭、肾部综合病、肾小管缺陷、毒性损伤、缺氧损伤以及外伤。肾小管缺陷包括遗传的或者后天形成的疾病，如肾部多囊疾病、髓囊疾病以及髓海绵肾。这一列表不受限制，并可以包括许多其它肾功能紊乱疾病(参见例如，内服药的Harrison原理，第13次编辑，1994，其在与本文一并参考)。该方法的受治疗者可能是人。
用于抑制受治疗者体内不受欢迎的KIM配体表达组织的生长的治疗干涉过程包括以下步骤给受治疗者施用治疗有效量的KIM拮抗剂(例如，结合于KIM配体的拮抗剂抗体)或者抗-KIM抗体或者其它的封阻KIM结合到KIM配体表达组织的KIM-结合分子。在一感兴趣的实施方案中，KIM拮抗剂或者抗-KIM抗体在治疗方面用于抑制或者阻滞肿瘤的生长，肿瘤的生长取决于用于生长的KIM蛋白质。
本发明的其它方法包括通过使细胞与KIM的融合蛋白质和毒素或放射性核素，或者连结于毒素或者放射性核素上的抗-KIM配体抗体相接触，以杀死KIM配体表达肿瘤细胞，或者抑制其生长。细胞可以在受治疗者体内，蛋白质或缀合抗体是施用给受治疗者的。
本发明也包含一种方法，该方法用于以表达KIM的细胞为目标的毒素或者放射性核素，包括使细胞与含有KIM配体和毒素或放射性核素的融合蛋白质，或者连结于毒素或者放射性核素的抗-KIM抗体相接触。另一实施方案包含一种抑制表达KIM肿瘤细胞生长的方法，包括使细胞与KIM配体和毒素或者放射性核素的融合蛋白质，或者连结于毒素或者放射性核素的抗-KIM抗体相接触；细胞可以在受治疗者体内，蛋白质是施用给受治疗者的。
这里使用的术语″受治疗者″意指任何给其服用KIM的哺乳动物。特别适合用本发明的方法治疗的受治疗者包括人类和非人类灵长目动物、绵羊、马、牛、山羊、猪、狗、猫、兔、天竺鼠、仓鼠、沙鼠、大鼠和小鼠以及得自或来源于这些宿主的器官，肿瘤和细胞。本发明化合物在基因治疗中的用途将本发明的KIM基因引入受到损坏的组织，或者想要刺激其生长的组织。这种治疗基因通过转染细胞、促进细胞生长和/或表达KIM蛋白质细胞的生存来刺激KIM蛋白质的产生。
在一特定的基因治疗方法实施方案中，将编码KIM蛋白质的基因引入肾部靶组织。KIM蛋白质被稳定表达并刺激组织生长、分裂或者分化，或者能加强细胞生存。此外，还可利用各种利用基于病毒或无病毒策略的熟知方法，将KIM基因引入靶细胞。
无病毒方法包括电穿孔法、膜与脂质体融合、利用涂布显微轰击粒子的DNA高速轰击、利用磷酸钙DNA沉淀的温育、DEAE右旋糖苷介导的转染以及向单细胞的直接微注射。例如，KIM基因可以通过以下方法引入细胞，即通过磷酸钙共沉淀(Pillicer等，科学，209:1414-1422(1980))；机械微注射和/或粒子加速(Anderson等，美国科学院院报，77:5399-5403(1980))、脂质体为基DNA转移(例如，LIPOFECTIN-媒介转染-Fefgner等，美国科学院院报，84:471-477,1987；Gao和Huang，生物化学生物生理研究委员会，179:280-285,1991)、DEAE右旋糖苷介质转染、电穿孔法(美国第4,956,288号专利)或者以多熔素为基础的方法，其中DNA连结于传送DNA上，该传送DNA优先连接于肝细胞上(Wolff等，科学，247:465-468,1990；Curiel等，人类基因治疗3:147-154,1992)。
用本发明的基因通过直接的基因转移可转染靶细胞。参见例如，Wolff等，″体外直接基因转化进入驼鹿肌肉″，科学247:1465-68,1990。在许多情况之下，合乎需要的是载体介导的转染。任何本领域已知的多核苷酸序列向载体的插入方法都可以利用(参见，例如，Sambrook等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989；Ausubel等，分子生物学当前草案，J.Wiiey和Sons，纽约，1992，两者都与本文一并参考)。启动子活化可能是组织特异性的或者是可由代谢产物或施用的物质引起的。这样的启动子/增强子包括但不限于天然c-ret配体蛋白质启动子、巨细胞病毒立即早期启动子/增强子(Karasuyama等，J.Exp.Med.,169:13,1989)、人β-肌动蛋白启动子(Gunning等，美国科学院院报，84:4831,1987)、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复序列中存在的糖皮质激素引导启动子(MMTV LTR)(Klessig等，细胞分子生物学。4:1354,1984)、莫洛尼氏鼠类白血病病毒的长末端重复序列(MuLV LTR)(Weiss等，RNA肿瘤病毒，冷泉港实验室，冷泉港，纽约。1985)、SV40的早期域启动子(Bemoist和Chambon，自然，290:301,1981)、Rous肉瘤病毒(RSV)启动子(Yamamoto等，细胞，22:787,1980)、疱疹单纯病毒(HSV)胸苷激酶启动子(Wagner等，美国科学院院报，78:1441,1981)、腺病毒启动子(Yamada等，美国科学院院报，82:3567,1985)。
KIM基因也可通过用于基因转化系统(其现在已建好)中的特异性病毒载体引入。参见例如Madzak等，病毒基因杂志，73:1533-36,1992(乳多空病毒SV40)；Berkner等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:39-61,1992(腺病毒)；Hofmann等，美国科学院院报，92:10099-10103,1995(杆状病毒)；Moss等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:25-38,1992(牛痘病毒)；Muzyczka,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:97-123，1992种(腺伴随病毒)；Margulskee,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:67-93，1992(疱疹单纯病毒(HBV)和Epstein-Barr病毒(HBV))；Miller,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158:1-24，1992(逆转录病毒)；Brandyopadhyay等，细胞分子生物学，4:749-754,1984(逆转录病毒)；Miller等，自然，357:455-450，1992(逆转录病毒)；Anderson，科学，256:808-813，1992(逆转录病毒)，分子生物学当前草案9.10-9.14部分(Ausubel等编辑)，Greene出版公司，1989，以上所有这些本文一并参考。
优选的载体是DNA病毒，包括腺病毒(优选基于载体的Ad-2或Ad-5)、杆状病毒、疱疹病毒(优选基于载体的疱疹单纯病毒)以及微病毒(优选基于载体的缺陷和非自主微病毒，更优选基于载体的与腺体有关病毒，最优选基于载体的AAV-2)。参见例如，Ali等，基因治疗1:367-384,1994；美国专利4,797,368和5,399,346以及以下所讨论内容。
用于转移例如KIM序列的特定载体系统的选择将取决于各种因素。一个重要的因素是靶细胞群的性质。虽然对逆转录病毒载体进行了广泛地研究并将其应用于大量的基因治疗实践，但是，一般来说它们不适合未分裂的转染细胞，但由于它们在复制细胞中仅仅整合和表达自身的基因，因此其可能在癌症治疗中有用。由于它们能够稳定整合进入靶细胞基因组，其对于体内方法是有用的，并且在这一点上具有吸引力。
腺病毒是真核DNA病毒，其可通过修饰有效地将治疗或报道转基因传送给各种类型细胞。一般的腺病毒2型和5型(分别为Ad2和Ad5)(可引起人体呼吸疾病)当前已发展用于对假肥大型肌营养不良(DMD)和囊性纤维化(CF)的基因治疗。Ad2和Ad5均属于与人体恶性肿瘤无关的腺病毒的一个亚类。不论有丝分裂状态如何，腺病毒载体能够实际提供极端高水平的传递转基因到几乎所有细胞类型。重组体病毒的高滴定度(1013噬斑形成单位/ml)很容易在293个细胞(一种转移腺病毒，与人类胚胎肾细胞系互补ATCC CRL 1573)中产生，并无觉察损失地冷藏一延续时段。系统在体内传送治疗转基因补助基因的不平衡，该系统的这种功效已在动物的各种紊乱模型得到验证。参见Watanabe，动脉硬化症，36:261-268,1986；Tanzawa等，FEES Letters 118(1):81-84,1980；Golasten等，新的Engl.J.Med.309:288-296,1983；Ishibashi等，J.Clin.Invest.92:883-893,1993；同时Ishibashi等，J.Clin.Invest.92:883-893,1993；以及Ishibashi等，J.Clin.Invest.93:1889-1893,1994。以上这些本文一并引用。事实上，编码囊性纤维化跨膜调节物(CFTR)的cDNA的重组体复制缺损腺病毒，已经批准至少可在两种人类CF临床试验中使用。参见例如，Wilson，自然365:691-692,1993。人们对人群中的活腺病毒疫苗的广泛经验，是对用于基因治疗的重组体腺病毒安全性的进一步支持。
第一代重组体，即复制缺陷T腺病毒，已发展用于DMD和其它的遗传紊乱病(包括整个和部分Elb域的缺失)的基因治疗。这一复制缺陷病毒在293个细胞中培育，这些细胞包含提供反式作用Ela蛋白质的功能性腺病毒Ela基因。缺失El病毒能够在293个细胞中复制和产传染性病毒，这些病毒在反式作用中提供Ela和Elb域基因产物。所得的病毒能够感染许多细胞类型并可以表达引入的基因(只要它携带它自己的启动子)，但是不能在未携带E1域DNA的细胞中复制，除非细胞被高重复度感染。腺病毒有一个优点，即它们有广泛的宿主范围，可以感染静止或者末端分化细胞(如神经细胞)，并本质上表现为非致瘤性。腺病毒看来似乎并不整合进入宿主基因组。因为它们存在于染色体外，所以大大地减少了插入诱变的风险。Ali等，同上，373。重组体腺病毒(rAdV)产生十分高的滴定度，病毒微粒适当稳定，表达水平高，可以感染很大范围的细胞。它们的天然宿主细胞是上皮细胞导气管，因此它们可用于治疗肺癌。
杆状病毒介质转移有几个优点杆状病毒基因转移可以发生在复制和非复制细胞中，可发生在肾部细胞中以及在肝、神经细胞、脾、皮肤以及肌肉细胞中。在哺乳动物细胞中杆状病毒为非复制型和非致病型。人类缺乏先天存在的抑制感染的重组体杆状病毒抗体。此外，杆状病毒能够合并和转移十分大的DNA插入片段。
在体基因治疗中，腺伴随病毒(AAV)也被用作为载体。AAV是一种小的、带有简单基因组(4-7kb)的单链(ss)DNA病毒，这种结构使其成为基因工程的理想底物。两种开放读框编码一系列rep和cap多肽。rep多肽(rep78、rep68、rep62和rep40)涉及AAV基因组的复制、拯救以及整合。cap蛋白质(VPI、VP3和VP3)形成病毒粒外壳。与rep和cap的开放读框5′和3′端侧面相连的是145bp反向末端重复序列(ITRs)，其开始的125bp能够形成Y-或T-形双螺旋结构。发展AAV载体最重要的是，整个rep和cap结构域可以被去除并用一治疗或报道转基因代替。参见B.J.Carter，微病毒手册，编者P.Tijsser,CRC出版社，pp.155-168(1990)。有人指出，ITRs代表AAV基因组复制、拯救、包装以及整合所需的最小序列。
腺伴随病毒(AAV)在基因治疗中有很大潜力。病毒微粒是十分稳定的，并且重组体AAVs(rAAV)具“似毒”特性，因此rAAV可通过成粒或CsCl梯度带纯化。它们是热稳定的，并且能够冻干成粉末并再水化到完全活性。它们的DNA稳定整合进入宿主染色体，因此表达是长期的。它们的宿主范围很广，并且AAV不引发已知疾病，因此这种重组载体是非毒性的。
一旦引入了靶细胞，感兴趣的序列通过一些传统方法就能得到识别，例如利用含有一定序列的探针进行核苷酸杂交(方法)，所说的序列类似或互补于载体的插入基因序列。按照另一种方法，序列可通过一种″标记″基因功能(例如胸苷激酶活性、抗生素抗性及其类似物)的存在或缺乏来识别，这种基因功能由表达载体引入靶细胞造成。制剂和施用根据标准的实践配制本发明化合物，如在载体工具中制备。术语″药理学上可接受的载体″意味着一种或多种有机或无机组分(天然的或合成的)，为了能方便服用它，将其与突变体原癌基因或者突变体致癌蛋白结合。尽管本领域普通技术人员已知其它的一些含水和不含水的等渗无菌溶液和无菌悬液，并已知这些溶液是药学上可接受的，但合适的载体只包括无菌盐水。在这一点上，术语″载体″包含脂质体和HIV-I梭形蛋白质(参见Chen等，生物化学年报。227:168-175,1995)以及任何质粒和病毒表达载体。
本发明的任何新多肽，都可以以药学上可接受的盐形式来加以利用。能够与本发明的多肽形成盐的合适酸和碱，包括无机和有机酸和碱，是本领域技术人员所熟知的。
给患者施用治疗有效量的本发明化合物，这一有效量意指能够产生所需的医疗效果或者在特殊治疗条件下能够产生一定影响的化合物的量。有效量的本发明化合物能够改善或者延迟病态的、退化的、受破坏的疾病的发展。有效量的确定基于单个个体，并且部分基于对受治疗者身体特性、要治疗的症状以及所寻求结果的考虑。本领域的普通技术人员考虑这几个因素，并使用不超过日常经验量的该化合物，就可确定用药有效量。
本发明的化合物的脂质体传递系统可以是各种单层泡、多层(multilamellar)泡或者稳定的多层(plurilamellar)泡之任一种，并且可以根据本领域技术人员所熟知的方法(例如根据美国专利5,169,637,4,762915,5,000,958或5,185154的方法)制备和施用。此外，表达这一发明的新的多肽以及其它所选择的多肽(如脂蛋白)是所需的，以便提高它们与脂质体的结合。例如，可以通过将KIM蛋白质引入细胞(需要利用脂质体进行这样的治疗)中，用脂质体包膜的蛋白质体内治疗人急性肾衰竭。可以经由导管将脂质体传递至肾部动脉。利用免疫亲和层析或者任何其它便利的方法例如从CHO细胞纯化得到重组KIM蛋白质，然后使其与脂质体混合，并以高效率将它们掺入其中。可以体外检验包膜的蛋白质对刺激细胞生长的作用。
可以医学上可接受的任何方式施用本发明的化合物。这一方式可以包括肠胃外途径注射，如静脉内、血管内、动脉内、皮下、肌内、肿瘤内、腹膜内、心室内，硬膜内外注射，或者也包括口腔、鼻腔、眼睛、直肠或者局部注射。本发明也特定包括持续释放给药(方式)，该方式借助于积存注射液或者腐蚀植入物。特别考虑局部传递，通过该方式经由导管传递至一条或多条动脉，如肾部动脉或者供养局部肿瘤的脉管。
为了清楚地理解本发明，虽然前述内容通过图例和实例对其进行了详细描述，很显然，对本领域技术人员来说，可在本发明范围之内对本发明作一定的变化和修改，本发明范围指仅由附属的权利要求所限定的范围。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人Michele Sanicola-NadelJoseph V.BonventreCatherine A.HessionTakaharu IchimuraHenry WeiRichard L.Gate(ⅱ)发明名称组织再生调节物(ⅲ)序列数7(ⅳ)通信地址(A)收信人Biogen,Inc.
(B)街道剑桥中心14号(C)城市剑桥(D)州MA
(E)国家美国(F)邮编02142(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release#1.0，版本1.30(ⅵ)当前的申请数据(A)申请号(B)申请日期1997-5-23(C)分类(ⅶ)在先的申请数据(A)申请号US 60/018,228(B)申请日期1996-5-24(ⅷ)代理人/代理机构信息(A)姓名Levine,Leslie M.
(B)登记号35,245(C)证书号A010 PCT CIP(ⅸ)通讯信息(A)电话(617)679-2810(B)传真(617)679-2838(2)关于SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2566个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS
(B)位置615..1535(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:GCGGCCGCGT CGACGGTGCC TGTGAGTAAA TAGATCAGGG TCTCCTTCAC AGCACATTCT60CCAGGAAGCC GAGCAAACAT TAGTGCTATT TTACCCAGGA GGAAATCTAG GTGTAGAGAG 120CTCTACGGAT CTAAGGTTTG GATCTGTACC CAGTGCTTTT TTAGGTGTCT TTAGACATTT 180CTCAGGAAGA TGTAGTCTCT GTCACCATGT GTGGCTGAAT TCTAGCTCAG TCCATCTTAT 240TGTGTTTAAG GTAGTTGAAG TTTAGGAACC AACCAGTATG TCTCTGAGCA GAAGAGTACA 300GTGTCCATCT TGAGGACAAG CTCATCTTTA CCATTAGAGG GCTGGCCTTG GCTTAGATTC 360TACCGAGAAC ATACTCTCTA ATGGCTGCCC TCAGTTTTCT CTGTTTGCTG TCTTATTTGT 420GTCATGGCCA GAAGTCATAT GGATGGCTCT ATGTGAGCAA GGACCCAGAT AGAAGAGTGT 480ATTTGGGGGA ACAGGTTGCC CTAACAGAGA GTCCTGTGGG ATTCATGCAG TCAGGATGAA 540GACCTGATCA GACAGAGTGT GCTGAGTGCC ACGGCTAACC AGAGTGACTT GTCACTGTCC 600TTCAGGTCAA CACC ATG GTT CAA CTT CAA GTC TTC ATT TCA GGC CTC CTG 650Met Val Gln Leu Gln Val Phe Ile Ser Gly Leu Leu1 5 10CTG CTT CTT CCA GGC TCT GTA GAT TCT TAT GAA GTA GTG AAG GGG GTG 698Leu Leu Leu Pro Gly Ser Val Asp Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val15 20 25GTG GGT CAC CCT GTC 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(A)长度307个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:Met Val Gln Leu Gln Val Phe Ile Ser Gly Leu Leu Leu Leu Leu Pro1 5 10 15Gly Ser Val Asp Ser Tyr Glu Val Val Lys Gly Val Val Gly His Pro20 25 30Val Thr Ile Pro Cys Thr Tyr Ser Thr Arg Gly Gly Ile Thr Thr Thr35 40 45Cys Trp Gly Arg Gly Gln Cys Pro Tyr Ser Ser Cys Gln Asn Ile Leu50 55 60Ile Trp Thr Asn Gly Tyr Gln Val Thr Tyr Arg Ser Ser Gly Arg Tyr65 70 75 80Asn Ile Lys Gly Arg Ile Ser Glu Gly Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu85 90 95Asn Ser Val Asp Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Cys Arg Val Glu Ile100 105 110Pro Gly Trp Phe Asn Asp Gln Lys Met Thr Phe Ser Leu Glu Val Lys115 120 125Pro Glu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Thr Arg Pro Thr Thr Thr Arg Pro130 135 140Thr Thr Thr Arg Pro Thr Thr Ile Ser Thr Arg Ser Thr His Val Pro145150 155 160Thr Ser Thr Arg Val Ser Thr Ser Thr Pro Thr Pro Glu Gln Thr Gln165 170 175Thr His Lys Pro Glu Ile Thr Thr Phe Tyr Ala His Glu Thr Thr Ala180 185 190Glu Val Thr Glu Thr Pro Ser Tyr Thr Pro Ala Asp Trp Asn Gly 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125Asp Pro Tyr Val Tyr Asn Trp Thr Thr Gly Ala Asp Asp Glu Asp Trp130 135 140Glu Asp Ser Thr Ser Gln Gly Gln His Leu Arg Phe Pro Asp Gly Lys145 150 155 160Pro Phe Pro Arg Pro His Gly Arg Lys Lys Trp Asn Phe Val Tyr Val165 170 175Phe His Thr Leu Gly Gln Tyr Phe Gln Lys Leu Gly Arg Cys Ser Ala180 185 190Arg Val Ser Ile Asn Thr Val Asn Leu Thr Val Gly Pro Gln Val Met195 200 205Glu Val Ile Val Phe Arg Arg His Gly Arg Ala Tyr Ile Pro Ile Ser210 215 220Lys Val Lys Asp Val Tyr Val Ile Thr Asp Gln Ile Pro Ile Phe Val225 230 235 240Thr Met Tyr Gln Lys Asn Asp Arg Asn Ser Ser Asp Glu Thr Phe Leu245 250 255Arg Asp Leu Pro Ile Phe Phe Asp Val Leu Ile His Asp Pro Ser His260 265 270Phe Leu Asn Tyr Ser Ala Ile Ser Tyr Lys Trp Asn Phe Gly Asp Asn275 280 285Thr Gly Leu Phe Val Ser Asn Asn His Thr Leu Asn His Thr Tyr Val290 295 300Leu Asn Gly Thr Phe Asn Phe Asn Leu Thr Val Gln Thr Ala Val Pro305 310 315 320Gly Pro Cys Pro Ser Pro Thr Pro Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ser Pro325 330 335Ser Pro Ala Ser Ser Pro Ser Pro Thr Leu Ser Thr Pro Ser Pro Ser340 345 350Leu Met Pro Thr Gly His Lys Ser Met Glu Leu Ser Asp Ile Ser Asn355 360 365Glu Asn Cys Arg Ile Asn Arg Tyr Gly Tyr Phe Arg Ala Thr Ile Thr370 375 380Ile Val Asp Gly Ile Leu Glu Val Asn Ile Ile Gln Val Ala Asp Val385 390 395 400Pro Ile Pro Thr Pro Gln Pro Asp Asn Ser Leu Met Asp Phe Ile Val405 410 415Thr Cys Lys Gly Ala Thr Pro Thr Glu Ala Cys Thr Ile Ile Ser Asp420 425 430Pro Thr Cys Gln Ile Ala Gln Asn Arg Val Cys Ser Pro Val Ala Val435 440 445Asp Glu Leu Cys Leu Leu Ser Val Arg Arg Ala Phe Asn Gly Ser Gly450 455 460Thr Tyr Cys Val Asn Phe Thr Leu Gly Asp Asp Ala Ser Leu Ala Leu465 470 475 480Thr Ser Ala Leu Ile Ser Ile Pro Gly Lys Asp Leu Gly Ser Pro Leu485 490 495Arg Thr Val Asn Gly Val Leu Ile Ser Ile Gly Cys Leu Ala Met Phe500 505 510Val Thr Met Val Thr Ile Leu Leu Tyr Lys Lys His Lys Thr Tyr Lys515 520 525Pro Ile Gly Asn Cys Thr Arg Asn Val Val Lys Gly Lys Gly Leu Ser530 535 540Val Phe Leu Ser His Ala Lys Ala Pro Phe Ser Arg Gly Asp Arg Glu545 550 555 560Lys Asp Pro Leu Leu Gln Asp Lys Pro Trp Met Leu565 570(2)关于SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1795个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型cDNA(ⅰⅹ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置278..1279(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:GCGGCCGCGT CGACGAAGCT GGGAAGTCAG GGGCTGTTTC TGTGGGCAGC TTTCCCTGTC 60CTTTGGAAGG CACAGAGCTC TCAGCTGCAG GGAACTAACA GAGCTCTGAA GCCGTTATAT 120GTGGTCTTCT CTCATTTCCA GCAGAGCAGG CTCATATGAA TCAACCAACT GGGTGAAAAG 180ATAAGTTGCA ATCTGAGATT TAAGACTTGA TCAGATACCA TCTGGTGGAG GGTACCAACC 240AGCCTGTCTG CTCATTTTCC TTCAGGCTGA TCCCATA ATG CAT CCT CAA GTG GTC 295Met His Pro Gln Val Val1 5ATC TTA AGC CTC ATC CTA CAT CTG GCA GAT TCT GTA GCT GGT TCT GTA 343Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp Ser Val Ala Gly Ser Val10 15 20AAG GTT GGT GGA GAG GCA GGT CCA TCT GTC ACA CTA CCC TGC CAC TAC 391Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys His Tyr25 30 35AGT GGA GCT GTC ACA TCA ATG TGC TGG AAT AGA GGC TCA TGT TCT CTA 439Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys Ser Leu40 45 50TTC ACA TGC CAA AAT GGC ATT GTC TGG ACC AAT GGA ACC CAC GTC ACC 487Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His Val Thr55 60 65 70TAT CGG AAG GAC ACA CGC TAT AAG CTA TTG GGG GAC CTT TCA AGA AGG 535Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser Arg Arg75 80 85GAT GTC TCT TTG ACC ATA GAA AAT ACA GCT GTG TCT GAC AGT GGC GTA 583Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Ser Gly Val90 95 100TAT TGT TGC CGT GTT GAG CAC CGT GGG TGG TTC AAT GAC ATG AAA ATC 631Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met Lys Ile105 110 115ACC GTA TCA TTG GAG ATT GTG CCA CCC AAG GTC ACG ACT ACT CCA ATT 679Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys Val Thr Thr Thr Pro Ile120 125 130GTC ACA ACT GTT CCA ACC GTC ACG ACT GTT CGA ACG AGC ACC ACT GTT 727Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val Arg Thr Ser Thr Thr Val135 140 145 150CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCA ACG ACA ACT GTT CCA ACA ACA ATG AGC 775Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Ser155 160 165ATT CCA ACG ACA ACG ACT GTT CCG ACG ACA ATG ACT GTT TCA ACG ACA 823Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser Thr Thr170 175 180ACG AGC GTT CCA ACG ACA ACG AGC ATT CCA ACA ACA ACA AGT GTT CCA 871Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro Thr Thr Thr Ser Val Pro185 190 195GTG ACA ACA ACG GTC TCT ACC TTT GTT CCT CCA ATG CCT TTG CCC AGG 919Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu Pro Arg200 205 210CAG AAC CAT GAA CCA GTA GCC ACT TCA CCA TCT TCA CCT CAG CCA GCA 967Gln Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln Pro Ala215 220 225 230GAA ACC CAC CCT ACG ACA CTG CAG GGA GCA ATA AGG AGA GAA CCC ACC 1015Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu Pro Thr235 240 245AGC TCA CCA TTG TAC TCT TAC ACA ACA GAT GGG AAT GAC ACC GTG ACA1063Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr Val Thr250 255 260GAG TCT TCA GAT GGC CTT TGG AAT AAC AAT CAA ACT CAA CTG TTC CTA1111Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu Phe Leu265 270 275GAA CAT AGT CTA CTG ACG GCC AAT ACC ACT AAA GGA ATC TAT GCT GGA1159Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Ile Tyr Ala Gly280 285 290GTC TGT ATT TCT GTC TTG GTG CTT CTT GCT CTT TTG GGT GTC ATC ATT1207Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val Ile Ile295 300 305 310GCC AAA AAG TAT TTC TTC AAA AAG GAG GTT CAA CAA CTA AGA CCC CAT1255Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gln Gln Leu Arg Pro His315 320 325AAA TCC TGT ATA CAT CAA AGA GAA TAGTCCCTGG AAACATAGCA AATGAACTTC 1309Lys Ser Cys Ile His Gln Arg Glu330TATCTTGGCC ATCACAGCTG TCCAGAAGAG GGGAATCTGT CTTAAAAACC AGCAAATCCA 1369ACGTGAGACT TCATTTGGAA GCATTGTATG ATTATCTCTT GTTTCTATGT TATACTTCCA 1429AATGTTGCAT TTCCTATGTT TTCCAAAGGT TTCAAATCGT GGGTTTTTAT TTCCTCCGTG 1489GGGAAACAAA GTGAGTCTAA CTCACAGGTT TAGCTGTTTT CTCATAACTC TGGAAATGTG 1549ATGCATTAAG TACTGGATCT CTGAATTGGG GTAGCTGTTT TACCAGTTAA AGAGCCTACA 1609ATAGTATGGA ACACATAGAC ACCAGGGGAA GAAAATCATT TGCCAGGTGA TTTAACATAT 1669TTATGCAATT TTTTTTTTTT TTTTTGAGAT GGAGCTTTGC TCTTGTTGCC CAGGCTGGAG 1729TGCGATGGTG AAATCTCGGC TCACTGTAAC CTCCACCTTC CGGGTTCAAG CAATTCTCCC 1789GTCGAC 17952)关于SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特征(A)长度334个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Met His Pro Gln Val Val Ile Leu Ser Leu Ile Leu His Leu Ala Asp1 5 10 1541Ser Val Ala Gly Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val20 25 30Thr Leu Pro Cys His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn35 40 45Arg Gly Ser Cys Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr50 55 60Asn Gly Thr His Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu65 70 75 80Gly Asp Leu Ser Arg Arg Asp Val Ser Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala85 90 95Val Ser Asp Ser Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp100 105 110Phe Asn Asp Met Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys115 120 125Val Thr Thr Thr Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val130 135 140Arg Thr Ser Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr145 150 155 160Val Pro Thr Thr Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr165 170 175Met Thr Val Ser Thr Thr Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ser Ile Pro180 185 190Thr Thr Thr Ser Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro195 200 205Pro Met Pro Leu Pro Arg Gln Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro210 215 220Ser Ser Pro Gln Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gln Gly Ala225 230 235 240Ile Arg Arg Glu Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp245 250 255Gly Asn Asp Thr Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn260 265 270Gln Thr Gln Leu Phe Leu Glu His Ser Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr275 280 285Lys Gly Ile Tyr Ala Gly Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala290 295 300Leu Leu Gly Val Ile Ile Ala Iys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val305 310 315 320Gln Gln Leu Arg Pro His Lys Ser Cys Ile His Gln Arg Glu325 330
权利要求
1．一种纯化和分离的DNA分子，该分子具有SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所描述的核苷酸序列。
2．一种纯化和分离的DNA分子，该分子选自a)SEQ ID NO:1的DNA分子或者其互补链；b)SEQ ID NO:2的DNA分子或者其互补链；c)SEQ ID NO:4的DNA分子或者其互补链；d)SEQ ID NO:6的DNA分子或者其互补链；e)在严格条件下与a)、b)、c)或d)中定义的DNA分子杂交的DNA分子或其片段；f)如果没有遗传密码的简并性，与a)、b)、c)、d)或e)中定义的DNA分子杂交的DNA分子。
3．按照权利要求1或者2的重组DNA分子，该分子可操作地连接于一种表达控制序列上。
4．一种包含纯化和分离的DNA分子的载体，所说的DNA分子具有SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所描述的核苷酸序列。
5．一种生物学上有功能的质粒或者病毒DNA载体，该质粒或载体包含按照权利要求1、2或者3之一的DNA分子。
6．一种由包含权利要求1的DNA分子的载体稳定地转化或者转染的原核或者真核宿主细胞。
7．一种由按照权利要求1、2或3的DNA分子编码的多肽产物的产生方法，所说的方法包括在合适的培养条件下培养以允许DNA分子表达的方式利用DNA分子转化或者转染的原核或者真核宿主细胞，以及回收所说表达的多肽产物。
8．一种由权利要求7的方法产生的多肽产物。
9．一种有一个氨基酸序列的蛋白质，所说的序列包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:7的序列。
10．一种由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQID NO:6的DNA编码的纯化和分离的蛋白质。
11．权利要求9或者10的蛋白质，其本质上不含其它的人类蛋白质。
12．一种蛋白质，其是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:7的变体。
13．一种按照权利要求9、10、11或者12的蛋白质的可溶性变体。
14．一种包含权利要求9、10、11、12或者13蛋白质的IgG融合蛋白质。
15．权利要求13的可溶性蛋白质，该蛋白质融合于毒素、可成像化合物或者放射性核素上。
16．一种抗权利要求9、10、11或者12蛋白质的特异性单克隆抗体。
17．权利要求16的抗体，其与毒素、可成像化合物或者放射性核素缔合。
18．一种杂交瘤细胞系，其产生抗权利要求9、10、11、12或者13的蛋白质的特异性抗体。
19．一种由权利要求18的杂交瘤产生的抗体。
20．一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求9、10、11、12、13、14或15的蛋白质，还包含一种药理学上可接受的载体。
21．一种药物组合物，其包含治疗有效量的权利要求16、17或者19的抗体，还包含一种药理学上可接受的载体。
22．一种治疗肾病患者的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求9、10、11、12、13、14或15的蛋白质。
23．一种治疗肾病患者的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求16、17或19的抗体。
24．一种治疗肾病患者的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求20的药物组合物。
25．一种促进患者体内新生组织生长的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求9、10、11、12、13或14的蛋白质。
26．权利要求25的方法，其中所说的组织是肾组织。
27．一种促进患者体内受破坏组织存活的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求9、10、11、12、13或14的蛋白质。
28．权利要求27的方法，其中所说的组织是肾组织。
29．一种治疗肾病患者的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求16、17或者19的抗体。
30．一种治疗肾病患者的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求21的药物组合物。
31．一种促进患者体内新生组织生长的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求16、17或19的抗体。
32．一种促进患者体内受破坏组织存活的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求16,17或19的抗体。
33．一种治疗肾病患者的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求4或者5的载体。
34．一种促进患者体内新生组织生长的方法，该方法包括对患者施用权利要求4或者5的载体。
35．一种促进患者体内受破坏组织存活的方法，该方法包括对患者施用治疗有效量的权利要求4或者5的载体。
36．权利要求34或者35的方法，其中所说的组织是肾组织。
37．一种用于把可成像化合物导向表达SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:7蛋白质的细胞的方法，该方法包括使细胞与融合于可成像化合物上的权利要求16的单克隆抗体相接触。
38．权利要求37的方法，其中所说的细胞在患者体内，所说的单克隆抗体是施用给患者的。
39．一种确定患者体内肾细胞受破坏或者再生的方法，该方法包括比较患者肾细胞中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQID NO:6的表达水平和对照肾细胞中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6的对照表达水平。
40．一种确定细胞中SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:6正调节的方法，该方法包括使细胞和反义探针接触并测量与细胞内的RNA的杂交。
41．一种确定患者体内肾细胞受破坏或者再生的方法，该方法包括比较患者肾细胞中、肾细胞碎片中或体液中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:7的浓度和对照肾细胞中的SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:7的对照表达水平。
42．权利要求41的方法，其中所说的体液是尿液或者血清。
43．权利要求41的方法，其中所说的肾细胞或者肾细胞碎片得自患者的尿液沉淀物中。
全文摘要
本发明公开了在损伤或再生的组织中得到正调节的蛋白质和编码这些蛋白质的DNA,以及包含这些化合物的治疗组合物和治疗方法。
文档编号A61K39/395GK1223685SQ97195828
公开日1999年7月21日 申请日期1997年5月23日 优先权日1996年5月24日
发明者M·萨尼科拉－纳戴尔, J·V·伯恩万特里, C·A·赫希昂, 市村隆治, H·卫, R·L·卡特 申请人:拜奥根有限公司