葡糖苷酶的制造方法、酶组合物和生物量的水解方法

专利名称：葡糖苷酶的制造方法、酶组合物和生物量的水解方法
技术领域：
本发明涉及添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的制造方法、包含该酶的酶组合物和使用该酶组合物的生物量的水解方法。
背景技术：
纤维素的糖化有各种方法，但开发反应条件温和且糖收率高的酶糖化法已经成为主流。如果将作为纤维素分解酶的纤维素酶大致分类，则分为作用于纤维素的结晶区域的纤维二糖水解酶、从纤维素分子链内部开始作用而降低分子量的内切葡聚糖酶。已知这 些纤维素酶受到作为生成物之一的纤维二糖阻抑。另外β_葡糖苷酶是作用于水溶性寡糖或纤维二糖，催化其β_糖苷键的水解反应的酶。特别是，β_葡糖苷酶是用于获得作为发酵原料有用的葡萄糖所必需的酶。另外，已知纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶由于纤维素分解所生成的纤维二糖的积累而发生反应阻抑。即，β_葡糖苷酶能够大幅降低由纤维素分解而生成的纤维二糖的积累，因此具有大幅提高纤维素分解效率这样的效果。纤维素在草本系植物、木本系植物中大量含有，因此将这些植物总称为纤维素系生物量。纤维素系生物量中除了纤维素之外，还包含木聚糖、阿拉伯聚糖等半纤维素、和木质素。特别是已知由于纤维素系生物量中所含的木质素是芳香族系的高分子化合物，因此在使用来源于丝状菌的纤维素酶的酶糖化中发挥阻抑作用。关于由木质素产生的来源于丝状菌的纤维素酶的阻抑机制目前尚未完全阐明，据说纤维素酶吸附于木质素而分解效率降低是要因之一(非专利文献I)。耐热性酶由于稳定性高、即使在高温条件下也能长期保持活性，因此被研究了作为产业用酶的应用。确认了这样的耐热性酶在嗜热菌、或超嗜热菌所具有的酶中更多地存在。关于耐热性的β -葡糖苷酶，已经从数种嗜热菌或超嗜热菌中鉴定出，具体地，从强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏热球菌(Pyrococcus horikoshii)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)等微生物中鉴定出了耐热性的β_葡糖苷酶。已知来源于丝状菌的纤维素酶或β -葡糖苷酶被进行了糖链修饰(非专利文献2)。作为这样的糖链所具有的一般功能，已知提闻蛋白质的可溶性、提闻物理稳定性、提闻蛋白酶耐性等的效果(非专利文献3)。作为纤维素酶等糖化酶具有糖链的功能，公开了通过对木聚糖酶赋予N型糖链从而其表达量增大(专利文献I)。现有技术文献专利文献专利文献l:W0/2005/093072非专利文献非专利文献l:Hetti P.等，Journal of Biotechnology, 107，65-72 (2004)
非专利文献2:Christian P.等，Trichoderma and GliocladiumiBasicBiology, Taxonomy and Genetics. , vol. I, 121-138 (1998)非专利文献3:H. Ohba 等，Biosci. Biotech. Biochem.，59，1581-1583(1995)

发明内容
发明要解决的课题本发明的目的是提供添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶，进而通过混合本葡糖苷酶和纤维素酶，从而提供在纤维素、特别是含有木质素的木质纤维素的水解工序中分解效率高的酶组合物。解决课题的手段·
本发明者们为了实现上述目的而进行了深入研究，结果发现，添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶能够应用于纤维素的分解。即，本发明由以下技术的手段构成。(I)选择性地添加了糖链、且具有葡糖苷酶活性的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的制造方法，该方法包括以下工序(i)对编码本来不具有糖链添加序列的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA，导入编码Asn-X-Ser或Asn-X-Thr (X是除脯氨酸以外的任意氨基酸)的DNA序列，制备编码来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的DNA，进一步对编码该突变型葡糖苷酶的DNA添加编码分泌信号序列的DNA序列，(ii)将添加了该编码分泌信号序列的DNA序列的编码该突变型葡糖苷酶的DNA导入真核微生物，使由该突变型葡糖苷酶DNA编码的突变型葡糖苷酶作为分泌蛋白质表达，以及(iii)分离·纯化作为分泌蛋白质表达的突变型葡糖苷酶。(2)根据⑴的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，糖链是高甘露糖型糖链。(3)根据⑴或⑵的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是来源于选自硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)中的 I 种的葡糖苷酶。。(4)根据(I) (3)的任一项的葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是下述⑴或(ii)的蛋白质(i)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质，(ii)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列具有85%以上的同一性的氨基酸序列、且具有β-葡糖苷酶活性的蛋白质。(5)根据(I) (4)的任一项的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，真核微生物是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。(6)根据(I) (5)的任一项的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，分泌信号序列是α因子分泌信号序列。(7)根据(I) ￠)的任一项的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶包含序列号6、序列号38、序列号40、序列号42、序列号44、序列号46、序列号48、序列号50、序列号52、序列号54和序列号56的任一项所示氨基酸序列。(8)生物量糖化用的酶组合物，其包含纤维素酶和通过(I) (7)的任一项的制造方法获得的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶。(9)根据(8)的生物量糖化用的酶组合物，其中，纤维素酶是来源于丝状菌的纤维素酶混合物。(10)根据⑶或(9)的生物量糖化用的酶组合物，其中，来源于丝状菌的纤维素酶混合物是来源于木霉属(Trichoderma)的纤维素酶混合物。(11)生物量的水解方法，其中，使用(8) (10)的任一项的酶组合物。 (12)根据(11)的生物量的水解方法，其特征在于，将由上述酶组合物产生的水解物通过超滤膜进行过滤，分离回收使用后的该酶组合物。本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2010-044242号的说明书和/或说明书附图所记载的内容。发明的效果本发明所得的添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶，在纤维素系生物量的水解中，与纤维素酶混合物中使用未添加糖链的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的情况相比，可以获得高的纤维素分解效率。该效果在木质纤维素的水解中特别显著。另外，本发明的添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶，对纤维素系生物量、特别是木质纤维素以及超滤膜的吸附性低，另外对从水解物分离糖液时所使用的超滤膜的吸附性低，从水解物的酶回收性优异。


图I是显示实施例I中的、序列号4的来源于强烈炽热球菌的β_葡糖苷酶(PfuBGL)、与序列号I的来源于里氏木霉(Trichoderma reesei)的β -葡糖苷酶(TriReBGL)、和序列号2的来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的β -葡糖苷酶(AspNgBGL)的比对的图。序列号I、序列号2的糖链添加序列用下划线表示，另外对于序列号4的糖链添加序列导入位置(Η60，L61，Υ62)也同样地用下划线表示。图2-1是显示实施例2中的、序列号6的氨基酸序列(gPfuBGL)与序列号8 (ThAggBGY)、序列号 10 (CmGHFP)、序列号 12 (SaBGAL)、序列号 14 (SsoBGAL)、序列号16 (PtBGAL)、序列号18 (TvBGAL)和序列号20 (FnGHFP)的氨基酸序列的比对图。将序列号6中的导入的糖链添加序列Asn-Arg-Thr(N-R-T)用序列中的下划线表示。进而,序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20中的、与序列号6的糖链添加部位Asn-Arg-Thr(N-R-T)对应的位置也同样地用序列中的下划线表示。图2-2是图2-1的接续。图3是显示比较例I中制备的PfuBGL (左)、与实施例2中制备的糖链添加突变型PfuBGL在无EndoH处理(右)、有EndoH处理(中央)条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳的条带图案的图。糖链添加突变型PfuBGL可以确认通过EndoH处理产生的分子量降低。
图4是显示实施例4中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的PfuBGL的葡萄糖生成量的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图5是显示实施例4中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型PfuBGL的葡萄糖生成量的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图6是显示实施例5中的、对木质纤维素底物作用来源于木霉属的纤维素酶+糖链添加突变型PfuBGL和来源于木霉属的纤维素酶+ PfuBGL的酶组合物时的葡萄糖生成量的变化的比较结果的图。以5重量％的木质纤维素为底物，反应在50°C进行至28小时，适宜取样测定生成的葡萄糖浓度。酶添加量为纤维素酶O. 5mg/mL、葡糖苷酶O. 005mg/mL(纤维素酶的1/100量)。图7是显示N型糖链的基本结构的图。以相对于来源于嗜热菌的葡糖苷酶的Asn侧链，结合有2个N-乙酰葡糖胺、以及3个甘露糖的结构为基本结构。
图8是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的AggBGY的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。图9是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型AggBGY的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图10是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的CmGHFP的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。图11是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型CmGHFP的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图12是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的SaBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。图13是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型SaBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图14是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的SsoBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。图15是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型SsoBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图16是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的PtBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。图17是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型PtBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图18是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的TvBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。图19是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型TvBGAL的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。图20是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的FnGHFP的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化,从而评价酶的热稳定性的结果的图。 图21是显示实施例12中的、通过50 90°C的保温时间测定纤维二糖分解中的糖链添加突变型FnGHFP的残存活性(相对于保温O小时的相对值)的变化，从而评价酶的热稳定性的结果的图。
具体实施例方式以下详细说明本发明。本发明中的“葡糖苷酶”，是具有水解形成β -糖苷键的二糖的活性(即，β -葡糖苷酶活性)的酶。作为EC编号EC 3.2. I. 21记载了属于β-葡糖苷酶的酶群，但在本发明中，虽然在EC编号中不属于β-葡糖苷酶但具有上述β-葡糖苷酶活性的蛋白质也包含在葡糖苷酶中。可列举例如，半乳糖苷酶、甘露糖苷酶、糖苷键水解酶家族蛋白等。本发明中的嗜热菌是指能够在50°C以上生长的微生物群的总称，另外特别地超嗜热菌是指能够在80°C以上生长的微生物群。作为该嗜热菌，可例示硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)等。来源于嗜热菌的葡糖苷酶是公知的，例如在GenBank等作为NP 577802登录，本发明中可以利用这些来源于嗜热菌的葡糖苷酶。优选来源于嗜热菌的葡糖苷酶包含序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列。进一步优选来源于嗜热菌的葡糖苷酶由序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列组成。在本发明中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶还包含在序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列中具有I个或多个或者I个或几个氨基酸的缺失、替换、添加或插入，且具有β_葡糖苷酶活性的蛋白质。这里对“I个或几个”的范围不特别限定，例如为10个以内，进一步优选5个以内，特别优选4个以内，或为I个或2个。另外，在本发明中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶还包含以下蛋白质包含使用BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for BiologicalInformation(美国国家生物信息中心的基本本地比对检索工具))等(例如，默认即初始设定的参数)计算时与序列号4、8、10、12、14、16、18和20所示的氨基酸序列具有85%以上、更优选90%以上、最优选95%以上的同一性的氨基酸序列，优选由该氨基酸列组成，且具有β_葡糖苷酶活性的蛋白质。这里，“同一性”是指在2个氨基酸序列中导入间隙或不导入间隙使其排列的情况下的最适比对中，相对于重叠的全部氨基酸残基的相同氨基酸和类似氨基酸残基的比例(百分率)。同一性可以使用本领域技术人员周知的方法、序列分析软件等(例如BLAST、FASTA等公知的算法)求出。“ β -葡糖苷酶活性”如上述定义的那样，该活性的测定如下进行例如，在溶解于50mM乙酸-乙酸钠缓冲液(pH值5.0)中的纤维二糖的底物溶液中添加酶液，在30 85°C反应30分钟，然后根据需要进行pH值改变等来停止反应，然后使用葡萄糖定量试剂盒来定量反应液中的葡萄糖浓度。在本发明中，“来源于嗜热菌的葡糖苷酶”不包含天然其氨基酸序列中具有糖链添加序列的蛋白质，仅限于天然不具有糖链添加序列的蛋白质。本发明所说的“糖链”，具有单糖以糖苷键连接而成的结构，该糖链的末端与来源于嗜热菌的葡糖苷酶的肽序列中的氨基酸侧链共价结合。“糖链 ”有无可以通过一般已知的过碘酸-席夫碱(periodic acid-Schiff base PAS)反应将SDS电泳等分离的葡糖苷酶染色，从而确认。糖链主要分为与天冬酰胺的侧链结合的N型糖链、和与丝氨酸、苏氨酸的侧链结合的O型糖链，优选为N型糖链。作为N型糖链，对天冬酰胺侧链，可以例示以2个N-乙酰葡糖胺、3个甘露糖为基本骨架的结构(图7)。相对于这样的基本结构，通过酶作用而进一步结合糖分子，从而构成多样的糖链结构。糖链结构根据作为宿主的微生物的种类、该宿主的培养条件等不同而变化。添加了糖链的来源于嗜热菌的葡糖苷酶是指添加了各种糖链结构的组合物。与来源于嗜热菌的葡糖苷酶结合的糖链是N型还是O型可以如下确认例如，对葡糖苷酶分别作用特异性地水解N型糖链的末端部分的N-聚糖酶和特异性地水解O型糖链的末端部分的O-聚糖酶，然后进行SDS电泳，通过比较其分子量的变化来确认。作为这里使用的N-聚糖酶,可以使用来源于脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)的 N-葡糖苷酶 F (PNGaseF)、来源于裙皱链霉菌(Streptomycesplicatus)的内-β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶等。另外，作为O-聚糖酶，可以使用来源于链球菌属(Streptococcus)的内_ α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶等。本发明的突变型葡糖苷酶中的糖链优选为高甘露糖型。这里所说的高甘露糖型是指在N型糖链中相对于构成糖链的N-乙酰葡糖胺或葡糖胺2个，连接有4个以上甘露糖的糖链。作为除甘露糖以外的糖，还可包含葡萄糖等其他单糖。在包含葡萄糖的情况下，通常与高甘露糖型的甘露糖的非还原末端部分结合。作为除高甘露糖型以外的N型糖链，可以例示复合型糖链。在复合型中，具有作为除甘露糖、N-乙酰葡糖胺以外的糖而含有果糖、唾液酸等多种糖作为构成成分的特征。与高甘露糖型相比，糖链所含的N-乙酰葡糖胺的比率增加，相对于N-乙酰葡糖胺2个，甘露糖的比率为3个以下。N型糖链是高甘露糖型还是混合型可以如下确认例如，将电泳的葡糖苷酶转印于PVDF膜，使其与糖链特异性的凝集素反应，通过其发色来确认。作为这里使用的糖链特异性的凝集素，例如，可以使用生物素、进行了 HRP标记的刀豆凝集素(ConA)、蓖麻凝集素(RCA120)、荆豆凝集素(UEA-I)、花生凝集素(PNA)等。如果能用ConA染色，则可确认为N型糖链中的高甘露糖型，如果能用RCA120染色，则可确认为N型糖链混合型。另外，作为其他判定方法，从充分纯化后的葡糖苷酶中分离糖链构成糖，将分离的糖用MALDI-T0F/MS、或HPLC分析来定量构成的单糖成分，从而确认糖链结构。“糖链添加序列”是指在通过真核生物被表达·翻译时受到糖链添加修饰的部位的
氨基酸序列。糖链添加序列可列举例如，作为N结合型糖链的共有序列的Asn-X-Ser或Asn-X-ThHX为除脯氨酸以外的任意氨基酸)、作为O结合型糖链的共有序列的Cys-X-Ser-X-Pro-Cys (X为除脯氨·酸以外的任意氨基酸)，但不限于这些。优选为N结合型糖链的共有序列。这里，作为除脯氨酸以外的任意氨基酸X，可列举Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe> Tyr> Trp> Met> Cys> Ser> Thr> Asp、Glu、His、Lys、Arg、Asn、Gin。本发明中的添加了糖链的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶(以下称为“突变型葡糖苷酶”)，是在上述来源于嗜热菌的葡糖苷酶的氨基酸序列中导入了构成上述糖链添加序列的氨基酸序列的突变型葡糖苷酶，且该氨基酸序列中选择性地添加了糖链。导入的糖链添加序列可以是一个也可以是二个以上，其种类可以完全相同，也可以包含多种糖链添加序列。糖链添加序列的导入位置优选选择不会由于该导入而使本来的酶活性消失的位置。作为这样的糖链添加序列的导入位置的确定方法，可以通过以下的步骤I)、步骤2)来实施。步骤I)将本来具有糖链添加序列的来源于丝状菌的葡糖苷酶、与本来不具有糖链添加序列的来源于嗜热菌的葡糖苷酶进行氨基酸序列比对分析，明确来源于丝状菌的葡糖苷酶的糖链添加序列在来源于嗜热菌的葡糖苷酶中的相对位置关系，特定糖链添加序列的导入位置。作为比对工具，可以使用ClustalW等多数广为人知的软件。本来具有糖链添加序列的来源于丝状菌的葡糖苷酶优选为来源于木霉属的葡糖苷酶、或来源于曲霉属(Aspergi I Ius)的葡糖苷酶。这些来源于丝状菌的葡糖苷酶的氨基酸序列是公知的，优选利用包含序列号I记载的氨基酸序列的来源于里氏木霉的β -葡糖苷酶、或包含序列号2记载的氨基酸序列的来源于黑曲霉的葡糖苷酶。步骤2)接着，确认通过上述比对分析特定的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的糖链添加序列的导入位置是否存在于酶表面。是否存在于酶表面，可以使用目标的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的晶体结构来获知。如果这样的晶体结构是已知的，则可以从Protein DataBank等数据库获取。另外，也可以实际进行X射线晶体结构分析等来获取晶体结构。在本发明中，优选按照上述步骤I)、步骤2)来选定糖链添加序列的导入位置，作为其他方法，也可以按照下述步骤3)、步骤4)来选定。步骤3)使用ASA (Accessible Surface Area :溶剂露出表面积)分析软件求出氨基酸残基的ASA(12),由该值选定露出来源于嗜热菌的葡糖苷酶的表面附近的氨基酸残基。各氨基酸残基的ASA，可以使用例如能够从AREAIM0L(ccp4 package) (UK Science andEngineering Research Council 的 CCP4(Collaborative Computing Project Number4) λ SURFace (Barry Honig’ s group,the Department of Biochemistry and MolecularBiophysics and Center of Computational Biology and Bioinformatics of Columbia)、ASAP (Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland and the ARCCentre in Bioinformatics)等的网站获得的ASA分析软件来算出。对于算出的ASA为ιΛ2以上的氨基酸残基，则认为是露出表面的残基，作为糖链添加序列的导入位置，优选选择ASA为2Λ2以上的氨基酸残基。特别是为了导入作为N结合型糖链的共有序列的3个氨基酸残基(Asn-X-Ser或Asn-X-Thr Χ为除脯氨酸以外的任意氨基酸)，更优选选择的ASA为2Λ2以上的氨基酸残基3个残基以上连续的部位。步骤4)在上述步骤3所选择的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的糖链添加序列导入位置中，选择离来源于嗜热菌的葡糖苷酶的酶活性部位有充分距离、不会由于糖链添加序列导入而导致酶活性降低的位置。离酶活性部位的距离与上述同样地使用目标的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的晶体结构来获知。具体地，优选将离酶活性部位距离为3.5人以内的氨基酸残基排除，选择距离更远的氨基酸残基。例如，如果相对于序列号4的氨基酸序列所示的PfuBGL应用上述步骤3)、步骤4)则如下。首先，使用AREAIM0L(ccp4 package)以溶剂分子1.4Λ为前提计算出ASA，提取出ASA为2Λ2以上的氨基酸残基(表I Q))。接着，提取出ASA为2人2以上的氨基酸残基3个残基以上连续的部位(表l(ii))。进而，根据PfuBGL的晶体结构信息特定出离酶活性部 位的距离为3.5A以下的氨基酸残基(S13、R78、N207、1263、1303、G304、V305、N306、Y307、S343、D344、L367、I370、I371、T372、D378、R384、Y387、H391、D404、V405、R406、N407、Y408、L409、H410、W411、F427的23个残基)，并将它们排除在外。以上的结果可以作为糖链添加序列导入位置选定(表l(iii))。表IPfuBGL中的糖链添加序列的导入位置的选定例
权利要求
1.选择性地添加了糖链、且具有葡糖苷酶活性的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的制造方法，该方法包括以下工序 (i)对编码本来不具有糖链添加序列的来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA，导入编码Asn-X-Ser或Asn-X-Thr (X是除脯氨酸以外的任意氨基酸)的DNA序列，制备编码来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶的DNA，进一步对编码该突变型葡糖苷酶的DNA添加编码分泌信号序列的DNA序列， ( )将添加了该编码分泌信号序列的DNA序列的编码该突变型葡糖苷酶的DNA导入真核微生物，使由该突变型葡糖苷酶DNA编码的突变型葡糖苷酶作为分泌蛋白质表达，以及 (iii)分离·纯化作为分泌蛋白质表达的突变型葡糖苷酶。
2.根据权利要求I所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，糖链是高甘露糖型糖链。
3.根据权利要求I或2所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是来源于选自硫化叶菌属(Sulofolobus)、热原体属(Thermoplasma)、暖枝菌属(Caldivirgra)、热球形菌属(Thermosphaera)、火球菌属(Pyrococcus)、嗜苦菌属(Picrophilus)、暖枝菌属(Caldivirgra)、闪烁杆菌属(Fervidobacterium)中的 I 种的葡糖苷酶。
4.根据权利要求I 3的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的葡糖苷酶是下述(i)或(ii)的蛋白质 (i)包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列相同的氨基酸序列的蛋白质， ( )包含与序列号4、序列号8、序列号10、序列号12、序列号14、序列号16、序列号18或序列号20所记载的任一氨基酸序列具有85%以上的同一性的氨基酸序列、且具有β -葡糖苷酶活性的蛋白质。
5.根据权利要求I 4的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，真核微生物是巴斯德毕赤酵母。
6.根据权利要求I 5的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，分泌信号序列是α因子分泌信号序列。
7.根据权利要求I 6的任一项所述的突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶包含序列号6、序列号38、序列号40、序列号42、序列号44、序列号46、序列号48、序列号50、序列号52、序列号54和序列号56的任一项所示氨基酸序列。
8.生物量糖化用的酶组合物，其包含纤维素酶和通过权利要求I 7的任一项所述的制造方法获得的来源于嗜热菌的突变型葡糖苷酶。
9.根据权利要求8所述的生物量糖化用的酶组合物，其中，纤维素酶是来源于丝状菌的纤维素酶混合物。
10.根据权利要求8或9所述的生物量糖化用的酶组合物，其中，来源于丝状菌的纤维素酶混合物是来源于木霉属的纤维素酶混合物。
11.生物量的水解方法，其中，使用权利要求8 10的任一项所述的酶组合物。
12.根据权利要求11所述的生物量的水解方法，其特征在于，将由上述酶组合物产生的水解物通过超滤膜进行过滤，分离回收使用后的该酶组合物。
全文摘要
本发明提供有效的生物量的分解方法，其中，制造提高了纤维素分解效率的葡糖苷酶，并利用该葡糖苷酶。本发明提供突变型葡糖苷酶的制造方法，其中，包含以下步骤在编码来源于嗜热菌的葡糖苷酶的DNA中，导入编码分泌信号序列的DNA、和编码Asn-X-Ser或Asn-X-Thr的DNA，然后将其导入真核微生物，使其作为分泌蛋白质表达。本发明还提供包含该突变型葡糖苷酶的酶组合物和使用该酶组合物的生物量的水解方法。
文档编号C12N15/09GK102884184SQ20118001164
公开日2013年1月16日 申请日期2011年1月26日 优先权日2010年3月1日
发明者栗原宏征, 渡边志绪美, 山田胜成, 石川一彦, 和田康史, 门祐示 申请人:东丽株式会社