荧光假单胞菌及生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物农药领域，特别涉及一株荧光假单胞菌及其生物制剂和在防治甘 蔗鞭黑穗病中的应用。
【背景技术】
[0002] 甘鹿（Saccharumofficinarum)是我国南方地区重要的糖料作物，80%以上的食 糖是以甘蔗作为原料制成的，在国民经济中有着重要的地位和作用。甘蔗原产于高温多湿 的热带亚热带地区，非常有利于甘蔗病虫害的发生发展。迄今世界上已发现真菌病害约有 80多种，在华南地区，甘鹿鞭黑穗病（sugarcanesmut)是目前生产上发生最普遍、为害最 严重的真菌性病害，已给甘蔗生产及糖业的产量和品质带来了严重的损失。目前，生产上对 该病害的控制主要以化学药剂防治为主。
[0003] 焚光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)是一种广泛存在于土壤中的生防细 菌，产生胞外拮抗物质及诱导植物产生系统抗性是其最主要的特征，因而在植物病害生物 防治中具有重要的地位。李爱荣等（2003)筛选到2株对稻瘟病菌有较好抑制作用的2株 生防荧光假单胞杆菌。王刚等（2004)研宄了荧光假单胞菌P2-5菌株对小麦全蚀病的抑 制作用。顾金刚等（2004)报道了 2株荧光假单胞杆菌菌株对烟草黑胫病病原菌的抑制作 用。李国俊等（2008)报道荧光假单胞杆菌菌株7-5对烟草炭疽病菌抑制作用。Hossain等 (2009)的研宄也表明荧光假单胞菌可抑制苹果黑星病菌孢子的萌发。而对于甘蔗鞭黑穗病 的生防菌的筛选，廖咏梅等（2004)进行过研宄，但只鉴定到假单胞菌属。
[0004] 因此，荧光假单胞菌作为一类重要的生防自然资源，已引起国内外研宄者的广泛 关注，具有开发生物农药的潜力。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述现有技术防治甘蔗鞭黑穗病的缺点与不足，开发荧光假单胞菌的应 用，本发明的首要目的在于提供一株以甘蔗根际微生物为筛选对象，分离得到的对甘蔗鞭 黑穗病菌有抑制作用的荧光假单胞菌，命名为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens) HN58,为甘蔗鞭黑穗病的生物防治奠定基础。另外，本发明从甘蔗根际筛选到的生防菌，将 其用于甘蔗病害的防治，其主要生防机制表现为抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、_两个单倍体菌 系的有性配合，因形成不了具有侵染致病力的双核菌丝体，从而达到生防效果。同时又较少 或不影响病原菌的两个无致病性单倍体菌丝本身的形态生长。这种生防机制具有较大的创 新意义。将其应用到甘蔗病害的防治，对甘蔗的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
[0006] 本发明另一目的在于提供一种基于上述荧光假单胞菌制备得到的生物制剂。
[0007] 本发明再一目的在于提供上述荧光假单胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
[0008] 本发明再一目的在于提供上述生物制剂在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
[0009] 本发明的目的通过下述方案实现：
[0010] 一株荧光假单胞菌，将其命名为荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)HN58， 保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCCNo:M2014511，保藏时间为2014年10月24日。
[0011] 所述的荧光假单胞菌在LB培养基上28°C培养，其单菌落为圆形，乳白色，表面光 滑，不透明，略隆起，粘质，边缘整齐无皱褶。
[0012] 所述的荧光假单胞菌从甘蔗根际土壤中分离、纯化得到。
[0013] 一种生物制剂，基于上述荧光假单胞菌制备得到。
[0014] 所述的生物制剂由荧光假单胞菌经液体发酵制备得到，优选包含以下步骤：将荧 光假单胞菌接种至LB液体培养基培养，即可获得生物制剂。
[0015] 所述LB液体培养基的pH值优选为7. 0。
[0016] 所述的培养指在28°C，摇床震荡速率为180?200rpm下培养24h。
[0017] 上述生物制剂在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
[0018] 上述荧光假单胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
[0019] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
[0020] 1、本发明得到的荧光假单胞菌来源于本地甘蔗根际土壤，能适应本地的自然环 境；另外，本发明从甘蔗根际筛选到的生防菌，将其用于甘蔗病害的防治，其主要生防机制 表现为仅抑制甘蔗鞭黑穗病菌+、_两个单倍体菌系的有性配合，因形成不了能侵染致病 的双核菌丝体，从而达到生防效果。同时又较少或不影响病原菌的两个无致病性单倍体菌 丝本身的生长。这种生防机制具有较大的创新意义。将其应用到甘蔗病害的防治，对甘蔗 的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
[0021] 2、本发明的生物制剂对甘蔗鞭黑穗病菌具有强烈的抑制作用，而且该生物制剂来 源环保无毒性，对生态环境影响小。
[0022] 3、本发明得到的荧光假单胞菌，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。
【附图说明】
[0023]图1为荧光假单胞菌对甘蔗鞭黑穗病菌的抑制作用结果图。
[0024] 图2为荧光假单胞菌滤液对甘蔗鞭黑穗病菌的抑制作用结果图。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0026] 实施例1 :焚光假单胞菌的分离、纯化和保藏
[0027] (1)LB培养基的配置：LB培养基的配置：称取胰蛋白胨（Tryptone，OxoidLTD LP0042,England) 10g，酵母提取物（Yeastextract，OxoidLTDLP0021，England) 5g，氯化 钠（NaCl，国药集团化学试剂有限公司，10019318) 10g，加水lOOOmL搅拌均勾，再加15g琼 月旨，充分加热溶解后分装，121°C灭菌20min后贮存备用。
[0028] (2)荧光假单胞菌的分离、纯化：
[0029] 称取华南农业大学跃进农场蔗田甘蔗根际土样10g，加到装有90mL无菌水的三角 瓶中，于28°C、200rpm振荡lh，静置1?2h后，吸取lmL的土壤浸渍上清液以浓度梯度法， 用0. 9%的生理盐水依次稀释至10_6的浓度，分别吸取100yL10 _4、10_5、10_6等3个浓度的 溶液均匀涂布在LB平板上以分离细菌，每个浓度涂3个平板。
[0030] 在无菌超净台上充分吹干后，于28°C、黑暗、倒置培养，1?2d后即有大量细菌菌 落长出。用灭菌牙签挑取菌落特征不同的单菌落于LB平板上纯化培养，得到多种不同生物 形态的菌株，将其中四种分别编号为Al、A2、A3、A4,并作为生防实验待测菌株保存备用，对 其进行生防活性检测后，选取A1为本发明的新菌株。
[0031] 所述纯化所得A1菌株经16SrDNA序列分析，其序列（如下所示）与NCBI数据 库进行核苷酸序列同源性比对，结果显示，在亲缘关系相近的前100个序列中，76个为假 单胞菌属（Pseudomonasspp.)的菌株，本菌株与它们都具有99%的同源性。再通过构建 16SrDNA序列的系统发育树，本菌株与P.fluorescensPf0-1(NC_007492. 2)菌株处于同 一分支，菌株间的相似性达到了 99. 4%，证实其分类命名为焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)，命名为焚光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens)HN58。16SrDNA序列片段 如下：
【主权项】
1. 一株荧光假单胞菌，其特征在于：将其命名为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens)HN58,保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国武汉武汉大 学，保藏号为CCTCC No :M2014511，保藏时间为2014年10月24日。
2. 根据权利要求1所述的荧光假单胞菌，其特征在于：从甘蔗根际土壤中分离、纯化得 到。
3. -种生物制剂，其特征在于基于权利要求1?2任一项所述的荧光假单胞菌制备得 到。
4. 根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于通过包含以下步骤的方法制备得到： 将荧光假单胞菌接种至LB液体培养基培养，获得生物制剂。
5. 根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于：所述LB液体培养基的pH值为7. 0 ; 所述的培养指在28°C，摇床震荡速率为180?200rpm下培养24h。
6. 根据权利要求3?5任一项所述的生物制剂在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
7. 根据权利要求1?2任一项所述的荧光假单胞菌在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物农药领域，公开了一株荧光假单胞菌及其生物制剂和在防治甘蔗鞭黑穗病中的应用。将该株荧光假单胞菌命名为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)HN58，于2014年10月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC No：M2014511。该菌株由甘蔗根际土壤分离得到，能适应本地的自然环境；对甘蔗鞭黑穗病菌具有较好的抑制作用，而且来源环保无毒性，对生态环境影响小；培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。CCTCC No：M201451120141024
【IPC分类】A01P3-00, C12N1-20, A01N63-02, C12R1-39
【公开号】CN104531571
【申请号】CN201410777646
【发明人】习平根, 邓华, 孙飞, 江立群, 孙霞, 袁玉花, 李敏慧, 古佳妍, 沈万宽, 姜子德
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月15日