一种玉米遗传转化方法

专利名称：一种玉米遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及一种玉米遗传转化方法。
背景技术：
玉米是一种喜温作物，是世界上分布最广的作物之一，从北纬58度到南纬35 40 度的地区间均有大量的栽培。全球玉米播种面积约在每年1. 35-1. 40亿公顷之间，总产量近7亿多吨，约占全球粮食总量的35%左右，主要分布国家有美国、中国、巴西、阿根廷，这四个国家的玉米总产量约占全球总产量的70%以上，其中美国占40%以上，中国占20%左右。玉米占世界粗粮产量的65%以上，占我国粗粮产量的90%。玉米籽粒中含有70-75% 的淀粉，10%左右的蛋白质，4-5%的脂肪，2%左右的多种维生素。以玉米为原料制成的加工产品有3000种以上。玉米是制造复合饲料的最主要原料，一般占65-70%。玉米也是世界上最重要的三大粮食作物之一，也是重要的工业原料和生物能源物质。玉米起源于南美洲高温多湿的热带地区，需水较多，其耐旱性不强。国际玉米小麦改良中心从墨西哥高原征集的大量地方品种群体中，经过严格筛选鉴定出耐旱性较强的材料不到3%。近年来随着生态条件的恶化，干旱已成为玉米生产的主要非生物胁迫因子之一，是许多国家和地区玉米生产的主要限制因素。1992年Edmeades等调查表明，在热带地区，由于干旱引起的玉米产量损失每年约为MOO万吨，相当于正常水份条件下玉米产量的 17%。非生物逆境包括干旱、盐碱、高温低温等，其中影响最大造成作物大面积减产的因素是干旱，其次是盐碱。生物逆境就是指各种生物因素对作物的生长造成的危害，主要指各种病虫杂草等。土壤干旱和各类盐分胁迫是抑制植物生长并降低作物产量的重要非生物胁迫，目前全世界有约50%的农作物受到干旱和盐碱的威胁。每年由于干旱和盐碱化使全球的粮食产量减少10-20%。农杆菌是存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或者发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌分别含有Ti和Ri质粒，其上有一段可转移的DNA片段称为T-DNA，农杆菌通过侵染植物受伤组织而进入植物细胞，可以将T-DNA片段插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化载体。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助T-DNA的转移实现外源基因在植物基因组中整合。由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，起初农杆菌介导法只被用于双子叶植物的转化中。90年代以来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)转化中取得了成功。遗传转化是进行基因功能分析和改良作物性状的必要手段，目前玉米所使用的遗传转化方法包括基因枪法和农杆菌介导的幼胚浸染法。基因枪法多采用愈伤组织培养，可以转化质粒大片段，但却存在诱导愈伤困难的问题，转化效率受到基因型的影响，由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用高；以幼胚为受体的农杆菌介导的转基因方法主要依赖受体细胞的脱分化和再分化过程获得转基因植株。该方法具有很多缺点，例如转化周期长、操作繁琐、影响因素众多、基因型依赖性强。随着组培时间的延长，体细胞发生变异的可能性增大，进而使转基因植株育性降低或丧失及基因沉默等从而大大降低了目的基因的表达效率并影响了转化的目的性和真实性。

发明内容
本发明的目的是提供一种玉米的遗传转化方法。本发明的方法包括如下步骤向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因，再对转入外源基因的雌穗进行授粉，授粉后的雌穗继续发育，得到转入外源基因的结实穗。所述方法还包括如下步骤将转入外源基因的结实穗中的玉米粒进行播种、种植和抗性筛选，得到转入外源基因的玉米植株。所述受体玉米植株为如下发育时期的玉米植株具有根、茎、叶、雌穗和雄穗，雌穗生长出叶鞘且抽出叶鞘2. 0-3. 0cm，雌穗轴长约4. 0-6. 0cm，穗轴直径1. 5-2. 0cm，花丝未伸出苞叶；雌穗生长出叶鞘且抽出叶鞘具体为2. 0cm、2. 5cm或3. 0cm，雌穗轴长具体为4. 0cm、 5. Ocm或6. Ocm,穗轴直径具体为1. 5、1. 8或2. Ocm0所述受体玉米植株的叶的数目为16-18片、雄花序刚刚露出旗叶鞘，处于抽雄期； 所述受体玉米植株的叶的数目具体为16片、17片或18片。向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因的方法为将含有外源基因的重组农杆菌的溶液注射入雌穗中。含有外源基因的重组农杆菌的溶液的注射量为1.5-2. Oml/穗，含有外源基因的重组农杆菌的溶液的0D_值为0. 5-0. 8 ；所述注射量具体为1. 5ml、1. 8ml或 2. Oml/个雌穗，含有外源基因的重组农杆菌的溶液的OD6tltl值具体为0. 5,0. 7或0. 8。所述含有外源基因的重组农杆菌的溶液按照如下方法制备将所述含有外源基因的重组农杆菌悬于YEP培养基中，得到菌悬液，将菌悬液与蔗糖、Silwet L-77、乙酰丁香酮混合，得到所述含有外源基因的重组农杆菌的溶液；蔗糖的浓度为25g/L，SilwetL-77的浓度为40μ L/L，乙酰丁香酮的浓度为0. 02mg/ml，所述浓度为各物质在含有外源基因的重组农杆菌的溶液中的浓度。所述YEP液体培养基由酵母提取物、胰蛋白胨10g/L、氯化钠和水组成，所述酵母提取物在所述YEP液体培养基中的浓度为10g/L，所述胰蛋白胨在所述YEP液体培养基中的浓度为10g/L，所述氯化钠在所述YEP液体培养基中的浓度为5g/L，所述YEP液体培养基的 PH值为7.0。所述注射的位置为雌穗的中下部；所述重组农杆菌为重组根癌农杆菌，所述重组根癌农杆菌为将载体PCAMBIA3301转到了根癌农杆菌C58C1中得到的重组根癌农杆菌。所述授粉的方法包括如下步骤破坏所述转入外源基因的雌穗的苞叶，至花丝露出，但不伤及花丝，对露出的花丝进行授粉。所述授粉的时机为自向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因时计起第5天-6天， 所述向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因计为第0天；所述授粉的时机具体为自向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因时计起第5天或6天。所述抗性筛选的方法包括如下步骤用浓度为0. 5% (质量百分含量)的草铵膦的溶液喷洒或涂抹2叶1心期的玉米幼苗的第一叶，5天-7天后，检测幼苗是否存活，存活的幼苗即为转入外源基因的玉米抗性幼苗。所述0. 5% (质量百分含量)的草铵膦的溶液按照如下方法配制将草铵膦、水和羊毛脂混合得到的溶液，所述草铵膦在所述溶液中的浓度为0. 5% (质量百分含量)，所述羊毛脂在所述溶液中的浓度为80% (体积百分含量)。上述方法在基因功能分析和/或改良作物性状中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，本发明采用农杆菌介导浸染玉米花序的方法成功建立适用于玉米的基因转化方法，该方法可以避免组织培养过程，不受基因型的限制，简便、高效、规模化的转化体系，以期使在玉米中进行基因功能研究与利用基因工程技术快速、适时改良玉米成为可能，促进更多的基因工程品种应用于生产，进而推动当前农作物生物工程的发展。 本发明在未经历组织培养过程的阶段，而将外源的基因整合到玉米基因组中，为一种新的玉米基因遗传转化方法。


图1为农杆菌浸染齐319穗与齐319正常结实穗的比较图2为转基因植株和齐319野生型对1. 0%草铵膦敏感性试验图3为草铵膦浓度梯度试验图4为0.5%草铵膦田间筛选转基因植株图5为TO代转pCAMBIA3301玉米植株PCR检测图6为玉米转基因系的Southern杂交图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、转pCAMBIA3301玉米的获得 玉米材料以玉米优良自交系齐319 (利用外源种质选育优良玉米自交系及强优势杂交种的实践与思考，《山东农业科学》，叶金才，03 :11_13，2000，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。)为转基因受体和对照材料。菌种大肠杆菌E.ColiDH5a，农杆菌菌株 C58C1 (Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential forcrown gall-inducing ability, Nature, VAN LAREBEKE, N.，G. ENGLER，Μ. HOLSTERS, S. VAN DEN ELSACKER, I. ZAENEN, R. A. SCHILPER00RT, and J. SCHELL, 252 169-170，1984，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。)。质粒pCAMBIA3301 (http://www. cambia. org，澳大利亚CAMBIA研究所)。EB和Agarose购自Sigma公司。其它化学药品均为国产分析纯；各种限制性内切酶和修饰酶购自Τ0Υ0Β0公司，New England Biolab公司和Promega公司；回收 DNA用德国QIAGEN公司产品和鼎国公司的DNA片段快速纯化/回收试剂盒；引物合成由北京奥科生物技术有限公司和北京英骏生物技术有限公司完成；测序由北京奥科生物技术有限公司和中国农业科学院重大工程开放实验室完成。1、制备侵染菌液A、重组农杆菌的获得
将5 μ g质粒pCAMBIA3301采用冻融法转染根癌农杆菌C58C1 ；进行菌落PCR验证， 引物Bar-Fffl5， -TCAAATCTCGGTGACGGGC-3，CaMV35S2-RVl 5’ -ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’目的片段长度672bp，证明pCAMBIA3301载体转到了根癌农杆菌C58C1中，将含有 PCAMBIA3301的重组根癌农杆菌命名为C58Cl/pCAMBIA3301。B、浸染液的配制1)挑取重组根癌农杆菌C58Cl/pCAMBIA3301的单菌落，接种到2ml的YEP (含Kan， 50mg/L)液体培养基(酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH7. 0)中，200rpm
培养 30hr。2)菌液 1 :400 转接 300ml YEP (Kan, 50mg/l)，200rpm 培养 24hr 至 0D600 = 0. 6-1. O03)3000-;3500rpm，4°C离心5min，所收集的菌体重悬于150ml YEP培养基中，4°C保存；4)配制 50g/L 的蔗糖溶液 150ml，含 80 μ L/L Silwet L_77，0. 04mg/ml 的乙酰丁香酮，4°C保存。幻使用时将上述两种溶液按1 1混合得到C58Cl/pCAMBIA3301侵染菌液，侵染菌液的0D600为0. 5，蔗糖的浓度为25g/L，Silwet L-77的浓度为40 μ L/L,乙酰丁香酮的浓度为 0. 02mg/ml。2、选择用于遗传转化的玉米用作转化的玉米自交系植株应生长相对健壮，雌穗、雄花序发育及雌、雄抽穗时间与顺序均正常。玉米优良自交系齐319生长到60d(自播种时计起)时大概长到16片叶， 此时雄穗从旗叶抽出，雌穗开始生长出叶鞘1)自交系齐319的雌穗发育长度在4. 0cm，直径1. 5cm，抽出叶鞘2. 0cm，未吐丝。2)雄花序刚刚露出旗叶鞘，此时的胚珠可能处于正在发育的时期。3)选择下午4点以后，气温下降至20°C。3、侵染用无菌注射器吸取1. 5ml上述1得到的C58Cl/pCAMBIA3301侵染菌液，在雌穗的中下部注射进幼穗，注意不要太快，防止液体流出，注射后套袋，并做好标记，得到侵染后雌穗。4、侵染后授粉侵染雌穗后第5天对上述得到的侵染后雌穗进行授粉，所述向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因计为第0天。在早晨露水退去前约早晨6:00-7:00时，用剪刀剪开苞叶， 露出花丝约2. 0cm，不要伤及穗轴，套回原袋。10:00-13:00之间授粉，得到授粉后的雌穗。5、授粉后发育，得到转基因玉米籽粒授粉后的雌穗继续发育，得到转入外源基因的结实穗。实验重复三次，每次转化60个玉米雌穗，统计结穗率，结果取平均值，平均结穗率为 50. 0%。观察转入外源基因的结实穗，以野生型玉米为对照，结果见图1所示1-7为浸染后的结实穗(转入外源基因的结实穗)，与野生型玉米(齐319)相比，转入外源基因的结实穗的穗轴比较细小，前端已经溃烂死亡，大小状态停留在浸染前后的穗轴发育状态，没有结实部分的玉米穗轴更加细小。6、培育转基因玉米籽粒至得到幼苗将转入外源基因的结实穗中的玉米粒进行播种、种植，得到42株TO代转 PCAMBIA3301玉米幼苗。实验重复三次，结果取平均值，平均发芽率为55. 0%。7、抗性筛选幼苗A、草铵膦抗性筛选1)1.0% (质量百分含量)草铵膦(BASTA)涂抹草铵膦(化学名称为4_[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，购自成都贝斯特试剂有限公司，产品货号BRS009834)与羊毛脂(购自北京恒业中远化工有限公司，产品货号15377)混合成1. 0%的有效成份(将草铵膦溶于水中然后与羊毛脂混合，使草铵膦在水中的浓度为1. 0% )进行叶片涂抹，TO代转pCAMBIA3301玉米五叶期时涂抹第3片叶，除草剂涂抹后5-7d进行观察抗性。以玉米优良自交系齐319(以下简称野生型玉米)为对照。 每种株系各取100株实验，实验重复三次，结果取平均值。结果如图2所示，从图2中看出，TO代转pCAMBIA3301玉米叶片生长正常，野生型玉米涂抹草铵膦处干枯。这是由于Bar基因(pCAMBIA3301上含有Bar基因)的存在，TO代转pCAMBIA3301玉米植株抗草铵膦，而野生型玉米是不具有草铵膦抗性的。统计结果如下，1. 0%草铵膦(BASTA)涂抹后，TO代转pCAMBIA3301玉米(非嵌合体)平均抗性比例为8.5%。2)第1叶对草铵膦敏感性试验为了在早期尽快鉴定出抗性植株，减少对小苗生长的影响，建立了草铵膦梯度试验，即从 0. 05,0. 06,0. 07,0. 08,0. 09,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 8,1. 0%的草铵膦浓度
去涂抹相同大小的玉米的第1叶，一般选择在TO代转pCAMBIA3301玉米(非嵌合体)的2 叶1心期时进行，涂抹后一星期可以观察到抗性的差异。以玉米优良自交系齐319(以下简称野生型玉米)为对照。每种株系各取10株实验，实验重复三次，结果取平均值。结果为见图3所示，从图中看出，随着草铵膦浓度的增加，从涂抹处的干枯面积扩大，至整个叶片甚至植株死亡，而使用0. 5%的草铵膦，叶片受到伤害的程度适中。统计结果如下0. 5%的草铵膦浓度去涂抹TO代转pCAMBIA3301玉米(非嵌合体) 平均抗性比例为5.8%。3)0. 5%草铵膦涂抹玉米第1叶的筛选收获TO代转pCAMBIA3301玉米的种子，播种，得到Tl代转pCAMBIA3301玉米，依次继代，分别得到T2代转pCAMBIA3301玉米、T3代转pCAMBIA3301玉米。选择TO代转pCAMBIA3301玉米(非嵌合体)，Tl代转pCAMBIA3301玉米，T2代转 PCAMBIA3301玉米，T3代转pCAMBIA3301玉米的植株在第1叶的中部涂抹0. 5%草铵膦(所述0.5% (质量百分含量)的草铵膦的溶液按照如下方法配制将草铵膦、水和羊毛脂混合得到的溶液，所述草铵膦在所述溶液中的浓度为0. 5% (质量百分含量)，所述羊毛脂在所述溶液中的浓度为80% (体积百分含量))，，并作好标记，5-7d后观察抗性。以玉米优良自交系齐319(以下简称野生型玉米)为对照。每种株系各取100株实验，实验重复三次，结果取平均值。结果如图4所示，从图中看出，非抗性植株(野生型玉米)草铵膦涂抹处至叶尖干枯，抗性植株(TO代转pCAMBIA3301玉米)则在些处保持青绿，具有抗草铵膦性。统计结果0. 5%草铵膦田间筛选得到18株阳性TO代转pCAMBIA3301玉米(非嵌合体),217株阳性Tl代转pCAMBIA3301玉米，293株阳性T2代转pCAMBIA3301玉米。TO代转PCAMBIA3301玉米(非嵌合体)平均抗性比例为5. 8%;T1代转pCAMBIA3301玉米平均抗性比例为72. 3% ；T2代转pCAMBIA3301玉米平均抗性比例为97. 3% ；T3代转pCAMBIA3301 玉米平均抗性比例为98.2%。8、PCR 鉴定玉米基因组DNA提取(改良的CTAB法)1)取2-2. 5g新鲜步骤6得到的TO代转pCAMBIA3301玉米叶片，在液N2中研成粉末，移到50ml离心管。2)加入 65°C预热的 IOml CTAB 提取缓冲液，65°C保温 30_60min，10_15min 摇动一次。3)加入2. 5ml 5M KAC混勻，冰浴20min ；再加入5ml氯仿/异戊醇04 1)，混勻，轻摇 IOmin ；3000rpm 离心 IOmin。4)取上清于一新的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇，轻轻混勻，4°C静置 Ihr ；用枪头挑出絮状沉淀，置于1. 5ml Eppendorf离心管中。5)先用70%乙醇洗涤，再用无水乙醇洗涤，真空干燥器干燥，溶于500 μ 1 TE，4°C 过夜溶解。6)加入等体积的酚氯仿异戊醇05 24 1)，柔和充分混合，12000rpm离心IOmin ；上清移至一新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇04 1)，充分混合， 12000rpm，离心 IOmin07)转移上清至另一新离心管中，加入RNase至终浓度20ug/μ 1，37°C保温Ihr。8)加入等体积氯仿异戊醇(24 1)，充分混合，12000rpm离心IOmin ；转移上清至一新离心管中，加入IOM乙酸铵至终浓度为2. 5M ；9)加入2-2. 5倍体积的_20°C预冷无水乙醇，混勻_20°C放置30min ； 12000rpm4°C 离心lOmin，弃上清。10)加入Iml 70%乙醇，4°C洗涤，12000rpm离心lOmin，弃上清；加入Iml无水乙醇，4°C洗涤，12000rpm离心lOmin，弃上清，吹干，溶于适量TE中，得到基因组DNA。转基因植株的PCR检测以上述提取的基因组DNA为模板，以下述引物进行PCR，Bar基因与35S启动子上的一对特异引物Bar-Fffl5’ -TCAAATCTCGGTGACGGGC-3’CaMV35S2-RVl 5’ -ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3，PCR 反应条件94°C 预变性 5min ;94°C Imin(变性)；67°C Imin(引物退火)； 72 0C Imin (引物延伸)；循环35次；72°C延伸IOmin。以野生型玉米(wt)、水作为阴性对照，以质粒pCAMBIA3301为阳性对照(P)。每种株系各取100株实验，实验重复三次，结果取平均值。
结果如图5所示，可以看出，编号为3、8、9、13、15、17的TO代转pCAMBIA3301玉米得到672bp的片段(35S启动子+Bar基因的各一部分)，野生型玉米没有目的片段，证明 PCAMBIA3301已经转入玉米种得到TO代转pCAMBIA3301玉米。统计PCR阳性株检出率，TO代转pCAMBIA3301玉米的阳性株检出率10. 2%。9、Southern 杂交检测1)将上述步骤6得到TO代转pCAMBIA3301玉米的基因组DNA的大量酶切基因组DNA 10 μ g酶(10U/ml)2mlIOXBuffer 40mlTotal400ml混勻后于37°C酶切2-3hr ；补加2ml (20U)限制性内切酶，于37°C继续酶切3hr ；检查酶切效果；酶切产物酚/氯仿和氯仿各抽提一次；沉淀酶切反应产物；2)酶解完全的DNA中加入5μ 1 IOXLoading buffer混勻。上样于0.8%的琼脂糖凝胶，在IXTAE缓冲液中电泳。先在100V电压下使得所有样品从点样孔进入凝胶，然后 30V恒压电泳，直至溴酚蓝跑至凝胶的边缘；3)电泳后凝胶经变性处理，在0. 4M NaOH转膜液下吸印20_24hr ；将膜移至滤纸上，超净台上吹干；80-120°C烘箱中烘Ι-air。用保鲜膜包裹，4°C保存。4)按 Promega 公司的 Prime-a-Gene Labelling System Kit 说明，标记探针序列如下所示catgccagttcccgtgcttgaagccggccgcccgcagcatgccgcggggggcatatccgagcgcctcgt gcatgcgcacgctcgggtcgttgggcagcccgatgacagcgaccacgctcttgaagccctgtgcctccagggacttcagcaggt gggtgtagagcgtggagcccagtcccgtccgctggtggcggggggagacgtacacggttgactcggccgtccagtcgtaggcgtt gcgtgccttccaggggcccgcgtaggcgatgccggcgacctcgccgtccacctcggcgacgagccagggatagcgctcccgcaga cggacgaggtcgtccgtccactcctgcggttcctgcggctcggtacggaagttgaccgtgcttgtctcgatgtagtggttgac gatggtgcagaccgcc5) 2XSSC预湿的杂交膜放入杂交管，附有核酸的膜面向里，按0. lml/cm2加入适量预热到65°C的Church缓冲液预杂交5个小时以上，然后加入变性好的探针，于65V杂交 16hr以上。6)杂交结束后，分别用 2XSSC+0. 5% SDSUXSSC+0. 5% SDS,0. 5XSSC+0. 5% SDS 和0. 1XSSC+0. 1% SDS在65°C洗膜，每次15min。洗完后，滤纸吸掉膜表面的水分，凉干，保鲜膜包好，压X光片，三天后洗片。结果如图6所示，1 野生型玉米(齐319) ；2-6是TO代转pCAMBIA3301玉米的不同株系，从图中看出，通过农杆菌浸染幼穗方法能够将外源目的基因整合到受体玉米基因组中并在转基因后代中稳定遗传。结合草铵膦筛选、PCR检测和Southern杂交结果证明，该转基因方法能够快速有效的将外源基因转入玉米基因组中，转化率为5.8%，是一种新的简便实用的玉米转基因方法。实施例2、转pCAMBIA3301玉米的获得1、制备侵染菌液方法与实施例1基本相同，不同的是所述侵染菌液的0D600为0. 7。2、选择用于遗传转化的玉米方法与实施例1基本相同，不同的是玉米优良自交系齐319生长到60d (自播种时计起)时大概长到17片叶，此时雄穗从旗叶抽出，雌穗开始生长出叶鞘1)自交系齐319的雌穗发育长度在5. 0cm，直径1. 8cm，抽出叶鞘2. 5cm，未吐丝。2、雄花序刚刚露出旗叶鞘， 此时的胚珠可能处于正在发育的时期。3)选择下午4点以后，气温下降至23°C。3、侵染方法与实施例1基本相同，不同的是吸取1. 8ml C58Cl/pCAMBIA3301侵染菌液。4、侵染后授粉方法与实施例1基本相同，不同的是侵染雌穗后第6天进行授粉。5、授粉后发育，得到转基因玉米籽粒方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。6、培育转基因玉米籽粒至得到幼苗方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。7、抗性筛选幼苗方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。8、PCR 鉴定方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。9、Southern 杂交检测方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。实施例3、转pCAMBIA3301玉米的获得1、制备侵染菌液方法与实施例1基本相同，不同的是所述侵染菌液的0D600为0. 8。2、选择用于遗传转化的玉米方法与实施例1基本相同，不同的是玉米优良自交系齐319生长到60d (自播种时计起)时大概长到18片叶，此时雄穗从旗叶抽出，雌穗开始生长出叶鞘1)自交系齐319的雌穗发育长度在6. 0cm，直径2. 0cm，抽出叶鞘3. 0cm，未吐丝。幻雄花序刚刚露出旗叶鞘， 此时的胚珠可能处于正在发育的时期。3)选择下午4点以后，气温下降至23°C。3、侵染方法与实施例1基本相同，不同的是吸取2. Oml C58Cl/pCAMBIA3301侵染菌液。4、侵染后授粉方法与实施例1基本相同，不同的是侵染雌穗后第5天进行授粉。5、授粉后发育，得到转基因玉米籽粒方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。6、培育转基因玉米籽粒至得到幼苗
方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。7、抗性筛选幼苗方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。8、PCR 鉴定方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。9、Southern 杂交检测方法与实施例1相同，结果与实施例1的结果无显著差异。
权利要求
1.一种玉米的遗传转化方法，包括如下步骤向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因，再对转入外源基因的雌穗进行授粉，授粉后的雌穗继续发育，得到转入外源基因的结实穗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤将转入外源基因的结实穗中的玉米粒进行播种、种植和抗性筛选，得到转入外源基因的玉米植株。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述受体玉米植株为如下发育时期的玉米植株具有根、茎、叶、雌穗和雄穗，雌穗生长出叶鞘且抽出叶鞘2. Ocm-3. 0cm，雌穗轴长为4. Ocm-6. 0cm，穗轴直径为1. 5cm-2. 0cm，花丝未伸出苞叶；雌穗生长出叶鞘且抽出叶鞘具体为2. 0cm、2. 5cm或3. 0cm,雌穗轴长具体为4. 0cm、5. Ocm或6. Ocm,穗轴直径具体为 1. 5、1· 8 或 2. 0cm。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述受体玉米植株的叶的数目为16片-18片、雄花序刚刚露出旗叶鞘，处于抽雄期；所述受体玉米植株的叶的数目具体为 16片、17片或18片。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因的方法为将含有外源基因的重组农杆菌的溶液注射入雌穗中。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于含有外源基因的重组农杆菌的溶液的注射量为1. 5ml-2. Oml/个雌穗，含有外源基因的重组农杆菌的溶液的OD6tltl值为 0. 5-0. 8 ；所述注射量具体为1. 5ml、1. 8ml或2. Oml/个雌穗，含有外源基因的重组农杆菌的溶液的OD6tltl值具体为0. 5、0. 7或0. 8 ；所述含有外源基因的重组农杆菌的溶液按照如下方法制备将所述含有外源基因的重组农杆菌悬于培养基中，得到菌悬液，将菌悬液与蔗糖、Silwet L-77、乙酰丁香酮混合，得到所述含有外源基因的重组农杆菌的溶液；蔗糖的浓度为25g/L，Silwet L-77的浓度为 40μ L/L，乙酰丁香酮的浓度为0. 02mg/ml，所述浓度为各物质在含有外源基因的重组农杆菌的溶液中的浓度。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述注射的位置为雌穗的中下部；所述重组农杆菌为重组根癌农杆菌，所述重组根癌农杆菌为将载体PCAMBIA3301转到了根癌农杆菌C58C1中得到的重组根癌农杆菌。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述授粉的方法包括如下步骤破坏所述转入外源基因的雌穗的苞叶，至花丝露出，但不伤及花丝，对露出的花丝进行授粉；所述授粉的时机为自向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因时计起第5天-6天，所述向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因计为第0天；所述授粉的时机具体为自向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因时计起第5天或6天。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述抗性筛选的方法包括如下步骤用浓度为0. 5% (质量百分含量)的草胺膦的溶液喷洒或涂抹2叶1心期的玉米幼苗的第一叶，5天-7天后，检测幼苗是否存活，存活的幼苗即为转入外源基因的玉米抗性幼田ο
10.权利要求1-9所述方法在基因功能分析和/或改良作物性状中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种玉米的遗传转化方法，本发明的方法包括如下步骤向受体玉米植株的雌穗中转入外源基因，再对转入外源基因的雌穗进行授粉，授粉后的雌穗继续发育，得到转入外源基因的结实穗。所述方法还包括如下步骤将转入外源基因的结实穗中的玉米粒进行播种、种植和抗性筛选，得到转入外源基因的玉米植株。本发明的实验证明，本发明在未经历组织培养过程的阶段，而将外源的基因整合到玉米基因组中，为一种新的玉米基因遗传转化方法。
文档编号C12N15/82GK102443601SQ201010512368
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者赵军, 高建强 申请人:中国农业科学院生物技术研究所