专利名称：一种玉米遗传转化的方法
技术领域：
本发明属于遗传工程技术领域，涉及一种农杆菌介导转化玉米的方法，尤其涉及一种玉米种子整体侵染的方法。
背景技术：
玉米是世界主要粮食作物和重要工业原料之一，在世界农业生产上有着举足轻重的地位。我国为世界第二大玉米生产国，对玉米的需求与日俱增。常规育种技术已无法满足社会对玉米新品种的迫切需求，而基因工程的应用必将大大推进高产、优质、高抗新品种的选育进程，因此玉米的遗传转化研究具有明显的应用和理论意义。已经应用的遗传转化技术有基因枪法、农杆菌介导法、花粉管通道法、PEG介导法、子房注射法、超声波法、阳离子转化法、电击法等。其中玉米遗传转化主流方法是基因枪轰击法和农杆菌介导法。基因枪轰击法有整合模式相对复杂、外源基因表达传代相对不稳定、容易受技术限制的缺点。农杆菌介导法尽管有载体骨架甚至染色体片段可被转移的缺点，但有整合模式相对简单外源基因表达传代相对稳定，操作简便、成本低，也可转移大片段等优点。因此，农杆菌介导的转基因法是目前玉米遗传转化的主流方法之一。在农杆菌介导的玉米遗传转化中，建立良好的受体系统是玉米遗传转化的重要环节，涉及提供适宜转化的受体材料和转基因后的细胞能否再生植株等问题。常用的受体材料包括:外植体(幼胚、幼胚盾片、茎尖分生组织、茎节、幼雄穗、发芽玉米种子、芽尖、胚芽鞘、花粉、小孢子胚等)、胚性愈伤组织、由胚性愈伤组织建立的悬浮细胞系和由胚性愈伤组织或悬浮细胞系分离出的原生质体。大量研究表明，基因型是外植体形成的愈伤组织重要限制因素，受基因型限制很大，且存在着再生频率低、再生细胞部位与感受态细胞不一致，对农杆菌侵染不敏感且实验周期长、工作量大、培养困难等。而玉米种子不经过愈伤组织培养及再生阶段，侵染后直接发育成植株，不受这些限制。学术界普遍认为 单子叶植物能否利用农杆菌转化的关键因素是农杆菌能否吸附在植物细胞表面，以及外源基因是否能够整合到植物基因组中。早期研究认为，单子叶植物尤其是禾本科作物不是农杆菌的天然宿主，细胞缺乏农杆菌的附着位点，不能被吸附。许东辉等还从水稻中分离出一种高效抑制农杆菌生长及抑制其在水稻细胞表面附着的信号分子。Roberta等(1995)发现玉米等单子叶植物完全能够被农杆菌吸附，而且在转化过程中加入外源酚类物质通常会提高转化频率。因此，农杆菌能否吸附在植物细胞表面是农杆菌转化的关键限制因素之一。Schlappi等(1992)用带有玉米条斑病毒基因感染玉米幼胚和胚芽鞘，通过农杆菌对玉米幼胚亲和性的研究，证明只有那些再生和整合能力强的感受态细胞或处于分裂时期的细胞才能整合外源DNA，得到转化植株，但大多数基因型玉米缺乏感受态的细胞。而玉米种子是具有潜在分生能力的组织或细胞，在其吸胀阶段用含有目标基因的菌液浸泡，使其在吸胀阶段将含有目标基因的菌液吸进去，在吸胀后，种子萌发，这个时期，种子中的细胞处于分裂时期，且此时细胞表面吸附有农杆菌，从而将外源基因整合到玉米基因组中。目前，这方面的研究还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有玉米遗传转化受体系统取材受限、工作量与难度大、再生困难、转化周期长、效率低及如何在细胞分裂时期保证细胞表面吸附有含有目标基因的农杆菌的难点，提供一种玉米种子整体侵染的方法，以提高玉米的转化效率。本发明的目的是按以下技术方案实现的:
一种玉米遗传转化的方法，该方法是采用玉米种子整体侵染的方法实现的，步骤包括:①、测成熟玉米种子的生理吸胀曲线，②、目标发根农杆菌的培养，③、玉米种子灭菌，④、结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的玉米种子转入到OD6c 值为0.2-0.5左右的发根农杆菌的菌液中振荡侵染18-21小时，⑤、在25°C黑暗条件下共培养3天，⑥、移栽侵染植株，⑦、转基因植株分子检测；其中:
步骤①所述测成熟玉米种子的生理吸胀曲线的方法是:取12份等量的成熟玉米种子，每隔3小时取I份浸泡·到水中，分别浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小时，记录玉米种子不发生损伤的吸胀停滞点为18-24小时；
步骤②所述目标发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌A4于LB固体培养基平板上接种活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有20 Ug.ml-1利福平和50Ug.πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下,培养5-8小时,然后取I ml转接于40 ml含有20 Ug πιΓ1利福平、50 ug ^r1卡那霉素和200 umol -Γ1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后；用含20 Ug.πιΓ1利福平、50 Ug.πιΓ1卡那霉素和200 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液体培养基稀释上述菌液至0D_=0.2-0.5备用；
步骤③所述玉米种子灭菌的方法是:挑选饱满的玉米种子，Cl2灭菌4.5小时，然后用无菌水洗涤5-6次，准备侵染用；
步骤④所述结合玉米种子的生理吸胀曲线，侵染玉米种子18-21小时的方法是:结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟玉米种子转入到装有步骤②制备好的发根农杆菌菌液的无菌器皿中，农杆菌菌液量以刚浸没玉米种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于温度26°C、振荡转速166 rpm条件下，培养18-21小时；
步骤⑤所述的共培养的方法是:待步骤④侵染18-21小时后，从摇床中取出小瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗三次后，置于共培养培养基上，25°C黑暗条件下，共培养3天；
步骤⑥所述移栽侵染植株的方法是:当步骤⑤获得的种子萌发的苗长达到1-2 cm时，用镊子将种子夹出，用含150mg -Γ1头孢霉素的溶液浸泡1-2分钟后，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内用含150mg *L_1头孢霉素的溶液烧水,保持土壤湿度80%左右,且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后,栽入大花盆中，于温室培养。上述方法各步中采用的培养基及其配方是:
LB液体培养基是由IOg.Γ1 NaCl，IOg.Γ1蛋白胨，5g.Γ1酵母浸膏组成，pH值
7.0 ；
LB固体培养基是指在LB液体培养基中，再添加15g.L—1琼脂；
共培养培养基是指=MS加7 g.Γ1琼脂，pH值5.80-5.82 ；其中 MS 培养基组成为:ΚΝ03 1900 mg. Λ NH4NO3 1650 mg. Λ CaCl2.2Η20 440mg.ΙΛ MgSO4.7Η20 370 mg. Λ KH2PO4 170 mg. Λ H3BO3 6.2 mg. Λ MnSO4.H2O16.9 mg.ΙΛ ZnSO4.7Η20 8.6 mg. Λ KCl 0.83 mg. Λ Na2MoO4.2Η20 0.25 mg. ΛCuSO4.5Η20 0.025 mg. Λ CoCl2.6Η20 0.025 mg. Λ Na2EDTA 37.3 mg. Λ FeSO4.7Η2027.8 mg.171,肌醇20 g.L-1,烟酸100 mg.L—1,盐酸批P多酉享100 mg.171,盐酸硫胺素100mg.I71，甘氨酸 400 mg.L-1,鹿糖 30 g.L-1, pH 值 5.80-5.83。上述玉米种子整体侵染的方法中:步骤②所述目标农杆菌菌株是发根农杆菌(Ageobacterium rhizogenes) A4 菌株；该菌株已在 ZL200710055462.3 公开并使用。上述玉米种子整体侵染的方法中:
步骤②制备好的用于侵染的农杆菌菌液浓度OD6tltl优选0.3左右。步骤④所述的玉米种子吸胀的时间段为0-18/24小时，农杆菌浸泡侵染玉米种子时间优选18-21小时。步骤⑥所述头孢霉素的浓度为150 mg.L'本发明具有以下积极的效果:1、为实现发明目的，本发明使用成熟玉米种子作为实验材料、结合玉米种子生理吸胀曲线、在玉米种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液振荡侵染成熟玉米种子18-21小时，来达到提高转化率、缩短实验周期的效果。2、本发明以成熟玉米种子作为转化受体，缩短了实验周期、提高了转化率及转化后的移栽成活率。3、本发明的方法操作简单可行，具有明显优势和突破性特点。与显微注射法、电击法和其他农杆菌介导的方法相比，转化率显著提高、实验周期明显缩短、操作简单可行。对于玉米基因工程方面的理论研究以及遗传育种实践均具有重要意义。
图1:转基因植株PCR检测。其中CK-以未转化植株为阴性对照，1-7-以转化植株为样品。图2:转基因植株Southern blot检测。CK-未转基因的玉米的Southern blot检测情况，1-7-玉米Tl代转基因植株的Southern blot检测情况。
具体实施例方式下面结合实施案例对本发明作进一步说明:
一、培养基的配制和灭菌
1.LB液体培养基的配制:分别称量10 g NaClUO g蛋白胨和5 g酵母浸膏放入到I L三角瓶中，加入蒸馏水定容到I L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121°C高压湿热灭菌20分钟，冷却后放在4°C冰箱中，备用；
2.LB固体培养基的配制:分别称量10 g NaClUO g蛋白胨、5 g酵母浸膏和15 g琼脂放入到I L三角瓶中，加入蒸馏水定容到I L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121°C高压湿热灭菌20分钟，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4 °C冰箱中，备用；
3.MS培养基的配制:(I) MS培养基母液的配制I)大量元素母液的配制:
①KNO3母液的配制:称取190g KNO3放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为100倍。②NH4NO3母液的配制:称取330g NH4NO3放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸
馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。③MgS04.7H20母液的配制:称取74g MgS04.7H20放入到1000 ml的烧杯中，
用800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。④KH2PO4母液的配制:称取34g KH2PO4放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸
馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml ,转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。⑤CaCl2.2H20母液的配制:称取88g CaCl2.2H20放入到1000 ml的烧杯中，
用800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。
2)微量元素母液的配制:分别称取6.2 g H3BO3,16.9 g MnSO4.H20,8.6 gZnSO4.7Η20，0.83 g KCl,0.25 g Na2MoO4.2H20，0.025 g CuSO4.5H20，0.025 g CoCl2.6Η20放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转
移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为1000倍。3)铁盐母液的配制:分别称取18.65 g Na2-EDTA和13.9 g FeSO4.7H20，分别放入2个500 ml烧杯中，分别加入200 ml蒸馏水，加热并不断搅拌，使之完全溶解；冷却，将2种溶液混合，调pH至5.5，加蒸馏水定容至500 ml，转移至棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为500倍。4) B5有机母液的配制:分别称取10 g肌醇，0.05 g烟酸，0.05 g盐酸吡哆醇、0.05 g盐酸硫胺素和0.2 g甘氨酸,放入到500 ml的烧杯中，用300 mL蒸懼水使之完全溶解，加蒸馏水定容至500 ml，高压灭菌，转移至无菌棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为200倍。(2) MS培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:10 ml KN03、5 ml NH4NO3>5ml MgS04.7H20、5 ml KH2PO4,5 ml CaCl2.2Η20、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5 有机，加入到盛有800 ml蒸馏水的1000 ml三角瓶中，加入30 g蔗糖，加入蒸馏水定容到I L，充分溶解，调pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，然后采用121°C高压湿热灭菌20分钟；
4.共培养培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:10 ml KN03、5 ml NH4NO3>5 mlMgS04.7H20、5 ml KH2PO4,5 ml CaCl2.2H20、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5 有机，力口入到盛有800 ml蒸馏水的1000 ml三角瓶中，加入30 g蔗糖、7 g琼脂，加入蒸馏水定容到I L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121°C高压湿热灭菌20分钟；
二、玉米种子整体侵染转化法1、测成熟玉米种子的生理吸胀曲线:植物材料为玉米种子，取12份等量的成熟玉米种子，每份4.5-5 g，每隔3小时取I份浸泡到水中，分别浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30,33小时，记录玉米种子不发生损伤的吸胀停滞点为18-24小时；
2、发根农杆菌的培养:挑选发根农杆菌A4菌株于LB固体培养基平板上接种活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有20 Ug.πιΓ1利福平和50 Ug.πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养5_8小时，然后取I ml转接于40 ml含有20 Ug.ml 1利福平、50 Ug.ml 1卡那霉素和200 umol.L 1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后，用含20 Ug.πιΓ1利福平、50 Ug.πιΓ1卡那霉素和200 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液体培养基稀释上述菌液至0D_=0.2-0.5备用；
3、玉米种子灭菌:挑选饱满的玉米种子，用Cl2(NaClO:浓HCl=25ml:1ml)灭菌4.5小时，然后用无菌水洗涤5-6次，准备侵染用；
4、侵染:结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的玉米种子转入到OD6tltl值为
0.2- 0.5左右的发根农杆菌的菌液中，农杆菌菌液量以刚浸没玉米种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于温度2 6°C、振荡转速166 rpm条件下，培养18-21小时；
5、共培养:浸泡侵染18-21小时后,从摇床中取出小瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25°C黑暗条件下，共培养3天；
6、移栽侵染植株到花盆中:共培养3天后，取苗长达到1-2 cm的种子，用镊子夹出，用含头孢霉素浓度为150mg *L_1的溶液浸泡1-2分钟后,移栽到花土中,移栽之后第1_2周内用含头孢霉素浓度为lSOmg.!/1的溶液浇水，保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，于温室培养；
7、转基因植株分子检测:从转化植株叶片中提取其基因组DNA，并以其为模板，以5’ -GATATATGCCAAAITTACACTAG-3’ 和 5’ -GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3’ 为引物，扩增转化植株中的rolC基因。PCR反应条件为:94°C变性45 sec，45°C复性30 sec，72°C延伸45 sec,共计30个循环，最后再72°C延伸10 min。对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测情况如图1所示。其中，M为DNA分子量标准，I为阴性对照玉米原种的PCR扩增结果，1-7为样品转化玉米的PCR扩增结果。结果表明获得了 500bp的PCR扩增产物。对玉米的Tl代转基因植株进行Southern blot检测，以rolC基因全长序列为探针。玉米Tl代转基因植株的Southern blot检测情况如图2所示。其中CK为未转基因的玉米的Southern blot检测情况，1-7为玉米Tl代转基因植株的Southern blot检测情况。
权利要求
1.一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:该方法采用玉米种子整体侵染的方法实现，步骤包括:①测成熟玉米种子的生理吸胀曲线，②目标发根农杆菌的培养，③玉米种子灭菌，④结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的玉米种子转入到0D_值为0.2-0.5发根农杆菌的菌液中振荡侵染18-21小时，⑤在25°C黑暗条件下共培养3天，⑥移栽侵染植株，⑦转基因植株分子检测。
2.根据权利要求1所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:步骤①所述测成熟玉米种子的生理吸胀曲线的方法是:取12份等量的成熟玉米种子，每隔3小时取I份浸泡到水中，分别浸泡0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33小时，记录玉米种子不发生损伤的吸胀停滞点为18-24小时；步骤②所述目标发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌在LB固体培养基平板上接种活化二次，之后挑取单菌落接种到5 ml含有20 Ug.πιΓ1利福平和50 Ug.πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养5_8小时，然后取I ml转接于40 ml含有20 Ug.ml 1利福平、50 Ug.ml 1卡那霉素和200 umol.L 1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后；用含20 Ug ι Γ1利福平、50 Ug ι Γ1卡那霉素和200 umol *L_1乙酰丁香酮的LB液体培养基稀释上述菌液至0D_=0.2-0.5备用；步骤④所述结合玉米种子的生理吸胀曲线，侵染玉米种子18-21小时的方法是:结合玉米种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟玉米种子转入到装有步骤②制备好的发根农杆菌菌液的无菌器皿中，农杆菌菌液量以刚浸没玉米种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，在温度26°C、振荡转速166 rpm条件下，培养18-21小时；步骤⑤所述的共培养的方法是:待步骤④侵染18-21小时后，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3遍后，置于共培养培养基上，25°C黑暗条件下，共培养3天；步骤⑥所述移栽侵染植株的方法是:当步骤⑤获得的种子萌发的苗长达到1-2 cm时，用镊子将种子夹出，用含150 mg.Γ1头孢霉素的溶液浸泡1-2分钟后，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内用含150 mg.L—1头孢霉素的溶液烧水,保持土壤湿度80%左右,且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射,2周后,栽入大花盆中,在温室中培养。
3.根据权利要求2所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:所述方法各步中采用的培养基及其配方是:LB培养基是由IOg.Γ1 NaCl，IOg.Γ1蛋白胨，5g.Γ1酵母浸膏和5g.Γ1琼脂组成的，pH值7.0 ;共培养培养基是指=MS加7 g.Γ1琼脂，pH值5.80-5.82 ；所述 MS 培养基的组成为:ΚΝ03 1 900 mg. Λ NH4NO3 1650 mg. Λ CaCl2.2H20 440mg.ΙΛ MgSO4.7H20 370 mg. Λ KH2PO4 170 mg.Γ1，H3BO3 6.2 mg. Λ MnSO4.H2O16.9mg.ΙΛ ZnSO4.7H20 8.6 mg. Λ KCl 0.83 mg. Λ Na2MoO4.2H20 0.25 mg. ΛCuSO4.5H20 0.025 mg. Λ CoCl2.6H20 0.025 mg. Λ Na2EDTA 37.3 mg. Λ FeSO4.7H2027.8 mg.171,肌醇20 g.L-1,烟酸100 mg.I71,盐酸批卩多醇100 mg.171,盐酸硫胺素100mg.I71，甘氨酸 400 mg.L-1,鹿糖 30 g.L-1, pH 值 5.80-5.83。
4.如权利要求2所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:步骤②所述发根农杆菌菌株是发根农杆菌A4菌株 。
5.如权利要求2所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:步骤②制备好的用于侵染的农杆菌菌液浓度0D600为0.3。
6.如权利要求2所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:步骤④所述的玉米种子吸胀的时间段为0-18/24小时，农杆菌浸泡侵染玉米种子时间为18-21小时。
7.如权利要求2所述的一种玉米遗传转化的方法，其特征在于:步骤⑥所述头孢霉素的浓度为150 mg.L-1.
全文摘要
本发明涉及遗传工程技术领域，具体涉及一种玉米遗传转化的方法。公开了一种发根农杆菌介导的玉米种子遗传转化方法，即玉米种子整体侵染法。该方法包括测玉米种子的生理吸胀曲线、目标发根农杆菌的培养、结合玉米种子生理吸胀曲线将经消毒灭菌的种子转入到发根农杆菌菌液中侵染18-21小时、再经过共培养、移栽侵染植株和转基因植株分子检测等步骤。本发明采用玉米种子整体侵染的方法，使玉米种子在吸胀过程中易将菌液吸进，大大提高了转化效率，整个实验周期缩短2-3个月，提高了移栽成活率。克服了现有玉米遗传转化效率低，实验周期长，操作过程繁琐，实验工作量大的不足，对玉米基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有实际意义。
文档编号C12N15/82GK103074365SQ20121011218
公开日2013年5月1日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者周晓馥, 徐洪伟, 徐民泽 申请人:吉林师范大学