专利名称：一种番茄遗传转化的方法
技术领域：
本发明涉及一种农杆菌介导转化番茄的方法，属于遗传工程技术领域，具体涉及番茄种子整体侵染转化的方法。
背景技术：
番茄是一种世界性种植的最重要的鲜食和加工原料。它的基因组较小，是一种理想的模式植物。另外，番茄还具有自花授粉易于纯合、生长周期短、在温室内可周年生长等优点，因而其遗传转化研究备受关注。自从1986年McCormick等首次用农杆菌介导的方法获得转基因番茄植株以来，番茄的遗传转化研究不断发展，但转化效率有很大差异。影响农杆菌介导番茄遗传转化的因素很多，如番茄基因型、侵染时间、分化培养基等，其中基因型对植物生长调节剂的专一性，使得需要对每个番茄基因型的转化过程分别进行研究，以寻求不同基因型植株最适合的转化方法，即由于再生受基因型限制，从而使转化变得较困难；外植体大小对番茄的再生也有重要影响，理想的外植体大小为叶片0.5cm2，外植体的放置方向有近轴面向上和背面向上两种方式，但基本原则是使外植体的伤口与培养基有较好的接触，以利于外植体愈伤组织的诱导和芽的分化；基因型、分化培养基都是基于再生体系而形成的限制，从而使番茄的遗传转化变得更困难。番茄是植物基因工程中进行遗传转化的重要模式植物之一。目前在番茄的遗传转化过程中还存在一些问题，如转化率低，转化体、转化植株后代遗传不稳定，操作复杂等。这些问题阻碍了番茄基因工程的研究。因此，建立高效的番茄遗传转化体系，为植物功能基因研究及基因工程改良提供高效的遗传转化平台，从而促进其产业化发展。农杆菌所携带的目标基因能否成功转入到植物基因组中，对后续实验有着重要影响。在常规的农杆菌介导的植物遗传转化方法中，常选用的外植体为具有分生能力的细胞、幼嫩的组织、子叶及下胚轴等，也采取预培养等使细胞处于感受态的技术，这些都有利于转化率的提高。但目前这些方法转化效率还很低、操作过程也较繁琐，实验周期较长。
发明内容
针对上述不足，本发明的目的在于克服现有番茄遗传转化效率低、转化周期长及操作过程繁琐的难点，提供一种番茄种子整体侵染的方法，从而提高番茄的转效率。本发明是按以下技术方案实现的:
一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括:①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，②含有目标基因的发根农杆菌培养，③番茄种子消毒灭菌，④结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到0D_值为
0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤在25°C黑暗条件下共培养3天，⑥抗性植株的筛选，⑦抗性植株的生 根及培育，⑧转化植株炼苗及移栽等步骤；其中:
步骤①所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是:取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取I份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；
步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有50 Ug πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养5_8小时，然后取I ml转接于50 ml含有50 Ug.πιΓ1卡那霉素和110 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25°C、转速3500 rpm条件下离心10分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg.Γ1 6-BA和110 umol.Γ1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至0D_值为0.8-1.3备用；
步骤③所述番茄种子灭菌的方法是:挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，C12灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；
步骤④所述结合番茄种子的生理吸胀曲线，侵染番茄种子7-9小时的方法是:结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备好的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于26°C, 166 rpm条件下振荡培养7-9小时；
步骤⑤所述的共培养的方法是:待步骤④侵染7-9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25°C黑暗条件下，共培养3天；共培养培养基是指:在MS培养基中加入6 mg -Γ1 6-BA和110 umol -Γ1乙酰丁香酮和7 g.L-1琼脂，pH值5.80-5.82 ；
步骤⑥所述抗性植株的筛选其方法是:将经步骤⑤共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月，获得抗性植株。压力筛选培养基是由1/2MS培养基中加入0.2mg.L 1 6-BA 和 I mg.L 1 IBA 和 250 mg.L 1 Cef 和 50—100 mg.L 1 Kan 组成。步骤⑦所述抗性植株的生根`及培育的方法是:将步骤⑥筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day /8 night的人工气候箱中培养20-30天，生根培养基是由1/2MS培养基加入0.4 g-Γ1活性炭组成。步骤⑧所述转化植株炼苗及移栽的方法是:当步骤⑦获得的植株根长达到8cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养。上述方法中使用的LB和MS培养基为常规培养基:
LB液体培养基组成为10 g-Γ1 NaCl, 10 g.L—1蛋白胨和5 g.L—1酵母浸膏，pH值
7.0 ；
LB固体培养基是指在LB液体培养基中，再添加15 g.L—1琼脂；
MS 培养基组成为:ΚΝ03 1 900 mg. Λ NH4NO3 1650 mg. Λ CaCl2.2H20 440 mg. ΛMgSO4.7H20 370 mg. Λ KH2PO4 170 mg. Λ H3BO3 6.2 mg. Λ MnSO4.H2O 16.9 mg. ΛZnSO4.7Η20 8.6 mg.L-1，KCl 0.83 mg. Λ Na2MoO4.2H20 0.25 mg.Γ1，CuSO4.5H20 0.025mg.ΙΛ CoCl2.6H20 0.025 mg. Λ Na2EDTA 37.3 mg. Λ FeSO4.7H20 27.8 mg.L'肌醇20 g*L-1,烟酸100 mg.I71,盐酸批卩多醇100 mg.171,盐酸硫胺素100 mg.171,甘氨酸 400 mg.L-1,鹿糖 30 g.L—1, pH 值 5.80-5.83。上述方法中各步骤使用的培养基均用蒸馏水按常规方法配制。上述番茄种子整体侵染的方法中:
步骤②所述农杆菌菌株是含有Gt基因的发根农杆菌(Ageobacterium rhizogenes)A4菌株，该菌株已在ZL200710055462.3公开并使用。在番茄种子整体侵染的方法中，该菌株用于侵染的菌液浓度0D_为0.8-1.3，其中优选1.0。步骤④所述的番茄种子吸胀的时间段为0-7/9小时，农杆菌浸泡侵染番茄种子时间优选7小时。本发明具有以下积极的效果:1、本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染，大大提高了转化效率，提高了转化植株的获得数量。2、经过采用含卡那霉素的压力筛选培养基对抗性植株进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。
3.本发明的方法操作简单实用，与显微注射法、电击法和其它农杆菌介导的方法相比，具有明显优势和突破性特点，对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
图1是转化的番茄经压力筛选培养基培养后，全部白化，确定为转化未成功的番茄植株，见白化苗。图2是转化的番茄经压力筛选培养基培养后，有绿色苗存活，初步确定为转化成功的番茄植株，见绿色苗。图3是转基因番茄经压力筛选后，正常生长，证明转入的外源基因不会对转基因番茄的生长发育有不利影响。图4是转基因番茄经压力筛选获得的抗性植株，移栽后正常生长。图5是转基因番茄植株的PCR检测结果图。P-以质粒为阳性对照；CK-以未转基因的番茄植株为阴性对照；1_以转基因番茄植株为样品；结果
表明获得了 1892 bp的目标PCR扩增产物。
具体实施例方式下面结合实施案例对本发明作进一步说明:
一、培养基的配制和灭菌
1、LB液体培养基的配制:分别称量10g NaClUO g蛋白胨和5 g酵母浸膏放入到
IL三角瓶中，加入蒸馏水定容到I L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121°C高压湿热灭菌20分钟，冷却后放在4°C冰箱中，备用；
2、LB固体培养基的配制:分别称量10g NaClUO g蛋白胨、5 g酵母浸膏和15 g琼脂放入到I L三角瓶中，加入蒸馏水定容到I L，溶解，调pH值到7.0，用封口膜封口，之后采用121°C高压湿热灭菌20分钟，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4 0C冰箱中，备用；
3、MS培养基的配制:(I)、MS培养基母液的配制I)、大量元素母液的配制:
①、KNO3母液的配制:称取190g KNO3放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸馏水使
之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为100倍。②、NH4NO3母液的配制:称取330g NH4NO3放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸
馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。③、MgS04.7H20母液的配制:称取74g MgS04.7H20放入到1000 ml的烧杯中，用
800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。④、KH2PO4母液的配制:称取34g KH2PO4放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸
馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml ,转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。⑤、CaCl2.2H20母液 的配制:称取88g CaCl2.2H20放入到1000 ml的烧杯中，用
800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为200倍。2)、微量元素母液的配制:分别称取6.2 g H3BO3,16.9 g MnSO4.H20,8.6 gZnSO4.7Η20，0.83 g KCl,0.25 g Na2MoO4.2H20，0.025 g CuSO4.5H20，0.025 g CoCl2.6Η20放入到1000 ml的烧杯中，用800 ml蒸馏水使之完全溶解，加蒸馏水定容至1000 ml，转
移至广口瓶中，室温保存；较使用浓度该母液浓缩倍数为1000倍。3)、铁盐母液的配制:分别称取18.65 g Na2-EDTA和13.9 g FeSO4.7H20，分别放入2个500 ml烧杯中，分别加入200 ml蒸馏水，加热并不断搅拌，使之完全溶解；冷却，将
2种溶液混合，调pH至5.5，加蒸馏水定容至500 ml，转移至棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为500倍。4)、B5有机母液的配制:分别称取10 g肌醇，0.05 g烟酸，0.05 g盐酸吡哆醇、
0.05 g盐酸硫胺素和0.2 g甘氨酸,放入到500 ml的烧杯中，用300 mL蒸懼水使之完全溶解，加蒸馏水定容至500 ml，高压灭菌，转移至无菌棕色瓶中，在4°C冰箱中保存；较使用浓度该母液浓度浓缩倍数为200倍。(2)、MS培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:10 ml KN03、5 ml NH4NO3>5ml MgS04.7H20、5 ml KH2PO4,5 ml CaCl2.2Η20、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5 有机，加入到盛有800 ml蒸馏水的1000 ml三角瓶中，加入30 g蔗糖，加入蒸馏水定容到I L，充分溶解，调pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，然后采用121°C高压湿热灭菌20分钟；
4、共培养培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:10 ml KN03、5 ml NH4NO3>5 mlMgS04.7H20、5 ml KH2PO4,5 ml CaCl2.2H20、1 ml 微量元素、2 ml 铁盐、5 ml B5 有机，力口入到盛有800 ml蒸馏水的1000 ml三角瓶中，加入30 g蔗糖、7 g琼脂，加入蒸馏水定容到I L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121°C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后加入6 ml浓度为Img^mr1的无菌6_BA，11 ml浓度为10 mmol.Γ1的无菌乙酰丁香酮，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4°C冰箱中，备用；
5、压力筛选培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:5ml KN03、2.5 ml ΝΗ4Ν03、2.5 ml MgS04.7Η20、2.5 ml KH2PO4'2.5 ml CaCl2.2H20、0.5 ml 微量元素、I ml 铁盐、2.5ml B5有机，加入到盛有800 ml蒸馏水的1000 ml三角瓶中，加入15 g蔗糖、7 g琼脂，加入蒸馏水定容到I L，充分溶解，调pH值到5.80-5.82，用封口膜封口，然后采用121°C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，冷却10分钟后分别加入6 ml浓度为I mg.mL—1的无菌6-BA, I ml浓度为I mg.mL 1的无菌IBA, I ml浓度为250 mg.mL 1的无菌Cef和1.5 ml浓度为50 mg ml/1的无菌Kan,充分混勻,倒入无菌培养皿中，冷却后放在4 0C冰箱中，备用；
6、生根培养基的配制:分别吸取上述MS培养基母液:5ml KN03、2.5 ml NH4NO3^2.5 mlMgS04.7Η20、2.5 ml KH2PO4,2.5 ml CaCl2.2H20、0.5 ml 微量元素、I ml 铁盐、2.5 ml B5有机，加入到盛有800 ml蒸馏水的1000 ml三角瓶中，加入15 g蔗糖、6.5 g琼脂，0.4 g活性炭，加入蒸馏水定容到I L，充分溶解，调pH值到5.80-5.83，用封口膜封口，然后采用121°C高压湿热灭菌20分钟。从高压锅取出，充分混匀，倒入无菌培养皿中，冷却后放在4°C冰箱中，备用；
二、番茄种子整体侵染转化法
1、测成熟番茄种子的生理吸胀曲线
植物材料为番茄种子，取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取I份(200粒)浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；
2、含有目标基因的发根农杆菌的培养
挑选含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株，接种于LB固体培养基平板上活化2次，之后挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有20 Ug.πιΓ1利福平、50 Ug.πιΓ1卡那霉素和10Ug ι Γ1四环素的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速166 rpm的条件下,培养5小时，然后取I ml转接于50 ml含有20 Ug πιΓ1利福平、50 Ug πιΓ1卡那霉素、10 Ug πιΓ1四环素和110 umol *L_1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26°C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25°C、转速3500 rpm条件下离心10 min,弃上清液,用含6mg.L—1 6-BA和110 umol.L-1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至0D600=1.0备用；
3、番茄种子灭菌
挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，用Cl2 (NaClO:浓HCl=25ml:1ml)灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；
4、结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经上述消毒灭菌的成熟番茄种子转入到OD6c 值为1.0的发根农杆菌菌液中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床内控制温度26°C，转速166 rpm培养7小时；
5、共培养:上述番茄种子浸泡侵染7小时后，从摇床中取出置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25°C黑暗条件下，共培养3天；
6、抗性植株的筛选:共培养3天后，取萌发的种子转接到压力筛选培养基上培养2个月，获得无抗性的植株(见附 图说明图1)和抗性植株(见
图2)；
7、抗性植株的生根及培育:筛选之后成活的抗性植株长到2-3cm时，将其移入生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12天day / 8 night的人工气候箱中培养20天，抗性植株正常生长(见
图3)；
8、转化植株炼苗及移栽:当抗性植株的根长达8cm左右时于温室内开盖3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养，移栽后的抗性植株正常生长(见
图4)；
9、转基因植株的分子检测:抗性植株移栽后，取其新鲜幼嫩叶片，用CTAB法从叶片中提取其基因组 DNA，并以其为模板，以 5’ -GAAGATCTATGGTGGGCAGAGGCAAAGGC-3’ 和 5’ -TTGGTCACCCTAATTAATAGTAGTTGTGC-3’为引物，扩增转化植株中的Gt基因。PCR反应条件为:94°C预变性I min，94°C变性30 sec，65°C复性10 min，72°C延伸lmin，共计35个循环，最后再72°C延伸10 min。对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测情况如见
图5所示。其中，M为DNA分子量标准，P-为阳性质粒对照的PCR扩增结果，I为转Gt基因番茄的PCR扩增结果，CK-为阴性对照番茄原种的PCR扩增结果。结果表明获得了1892 bp的PCR扩增 产物。
权利要求
1.一种番茄遗传转化的方法，该方法是采用番茄种子整体侵染的方法实现的，步骤包括:①测成熟番茄种子的生理吸胀曲线，②含有目标基因的发根农杆菌培养，③番茄种子的消毒灭菌，④结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到0D_值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时，⑤在25°C黑暗条件下共培养3天，⑥抗性植株的筛选，⑦抗性植株的生根及培育，⑧转化植株炼苗及移栽。
2.根据权利要求1所述的一种番爺遗传转化的方法，其特征在于:步骤①所述测成熟番茄种子的生理吸胀曲线的方法是:取8份等量的成熟番茄种子，每隔2小时取I份浸泡到水中，分别浸泡0、3、5、7、9、11、13、15小时，记录番茄种子的吸胀停滞点为7-9小时；步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌培养的方法是:将发根农杆菌A4在LB固体培养基平板上接种活化2次，挑取该菌株的单菌落接种到5 ml含有50 Ug πιΓ1卡那霉素的LB液体培养基中，在温度26 °C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养5_8小时，然后取I ml转接于50 ml含有50 Ug.πιΓ1卡那霉素和110 umol.L—1乙酰丁香酮的LB液体培养基中，在温度26 °C、振荡转速160-200 rpm的条件下，培养12-16小时后，取50 ml菌液加入到离心管中，置于低温冷冻离心机中，在温度25 °C、转速3500 rpm条件下离心10分钟，弃上清液，得菌体沉淀，用含6 mg.Γ1 6-BA和110 umol -T1乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬上述菌体沉淀至0D_值为0.8-1.3备用；步骤③所述番茄种子灭菌的方法是:挑选饱满的番茄种子，蒸馏水浸泡1.5-2小时，Cl2灭菌20分钟，无菌水冲洗5-6次，准备侵染用；步骤④所述结合番茄种子的生理吸胀曲线，侵染番茄种子7-9小时的方法是:结合番茄种子的生理吸胀曲线，将经消毒灭菌的成熟番茄种子转入到装有步骤②制备的发根农杆菌菌液的无菌三角瓶中，农杆菌菌液量以刚浸没番茄种子为准，用封口膜封住瓶口，置于摇床中，于26 0C, 166 rpm条件下振荡培养7-9小时；步骤⑤所述的共培养的方法是:待步骤④侵染7-9小时后，从摇床中取出三角瓶置于超净工作台内，倒掉菌液，加入无菌水冲洗3次后，置于共培养培养基上，25 °C黑暗条件下，共培养3天；共培养的培养基是指:在MS培养基中加入6 mg.Γ1 6-BA和110umol.L-1 乙酰丁香酮和 7 g.L-1 琼脂，pH 值 5.80-5.82 ；步骤⑥所述抗性植株的筛选其方法是:将经步骤⑤共培养的种子，转接到压力筛选培养基上培养1.5-2个月，获得抗性植株；压力筛选培养基是由1/2MS培养基中加入0.2mg.L 1 6-BA 和 I mg.L 1 IBA 和 250 mg.L 1 Cef 和 50—100 mg.L 1 Kan 组成；步骤⑦所述抗性植株的生根及培育的方法是:将步骤⑥筛选之后成活的抗性植株接种在生根培养基上进行生根及培育，置于光照强度为2000 lx，光照时间为12 day / 8night的人工气候箱中培养20-30天；生根培养基是由1/2MS培养基加入0.4 g-Γ1活性炭组成；步骤⑧所述转化植株炼苗及移栽的方法是:当步骤⑦获得的植株根长达到8 cm左右时，置于温室内开盖2-3天，然后用镊子将苗夹出，用过夜的自来水将植株根部的琼脂洗干净，移栽到花土中，移栽之后第1-2周内保持土壤湿度80%左右，且置于有一定光照的阴凉处，不可被阳光直射，2周后，栽入花盆中，在温室培养。
3.如权利要求2所述番茄遗传转化的方法，其特征在于:步骤②所述含有目标基因的发根农杆菌是含有Gt基因的发根农杆菌A4菌株。
4.如权利要求2所述的番茄遗传转化的方法，其特征在于:步骤②制备的用于侵染番茄种子的农杆菌菌液浓度0D_值为1.0。
5.如权利要求2所述的番茄遗传转化的方法，其特征在于:步骤④所述的番茄种子吸胀的时间段为0-7/9小时,农杆 菌浸泡侵染番爺种子时间为7小时。
全文摘要
本发明涉及一种番茄遗传转化的方法，属于遗传工程技术领域，具体的说公开了一种番茄种子整体侵染的方法，该方法包括测成熟番茄种子的生理吸胀曲线；含有目标基因的发根农杆菌培养；结合番茄种子的生理吸胀曲线，将消毒灭菌的番茄种子转入到OD600值为0.8-1.3的发根农杆菌菌液中振荡侵染7-9小时；在25℃黑暗条件下共培养3天；抗性植株的筛选；抗性植株的生根及培育；转化植株炼苗及移栽等步骤。本发明由于采用在番茄种子吸胀阶段用发根农杆菌菌液侵染，大大提高了转化效率，经过压力筛选培养基进行筛选，缩短了实验周期2-3个月，简化了实验过程，减少了转化后的鉴定工作量。对番茄基因工程的理论研究及遗传育种实践均具有重要意义。
文档编号C12N15/82GK103074364SQ20121011218
公开日2013年5月1日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者徐洪伟, 周晓馥, 吕杰 申请人:吉林师范大学