专利名称：识别含对硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸适体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种识别含对硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸适体及其应用。
背景技术：
配体指数富集系统进化(SystematicEvolution of Ligands by Exponentialenrichment, SELEX)技术是一种在体外从组合核酸文库中筛选出特异识别某一个或一类革巴标的核酸分子(核酸适体)的新的组合化学技术。目前，SELEX技术在基础研究、生物筛选等方面得到了很好的应用，并且在临床诊断方面也有广阔的应用前景。核酸适体(aptamer)是一类能特异紧密结合相应靶分子的单链核酸序列，通常由15到150个核苷酸组成,包括DNA、RNA、肽核酸或化学修饰的核酸。核酸适体通过范德华力、氢键或静电作用与靶分子高亲和力，高特异性地相互结合作用。它的高亲和力和特异性可以与抗体相媲美，因此它又称为核酸或者化学的“抗体”。迄今为止，已筛选出了数百个核酸适体，它们的靶物质范围很广，包括无机金属离子、有机小分子、生物大分子、以及病毒、细菌、细胞和组织切片等。与单克隆抗体相比,核酸适体具有以下优点(1)在体外筛选,无需免疫动物或细胞。因此其靶目标范围更广，可以是无机金属离子、激素、毒素，还可以是细胞，从理论上上讲任何靶标都可以筛选得到其核酸适体；(2)低毒性或免疫源性，且具有很好的水溶性，可以直接进行大剂量的皮下静脉注射；(3)可以在生理条件以外的条件下进行筛选和应用；可进行大量化学合成制备，批间差异小；(5)很容易进行结构改造、修饰、标记或固定化；(6)稳定性好，容易保存和运输；(7)分子量小，一般在4-50KD。基于这些优点，核酸适体作为一种新型识别分子已经被广泛应用于分析化学、生物传感器、疾病治疗和诊断等诸多领域。目前所筛选得到的核酸适体都是识别某一单一靶标，难以实现对一类化合物或某一特定基团进行识别和用于对该类化合物的富集、分析检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种识别含对硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸适体及其应用。本发明提供的核酸适体是序列表的序列I、序列3或序列5所示的单链DNA片段。将序列表的序列I、序列3或序列5所示的单链DNA片段进行修饰或改造得到的核酸适体的衍生物也属于本发明的保护范围。
所述核酸适体衍生物可为如下任意一种①将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；③将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；④将所述核酸适体改为肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；⑤将所述核酸适体的一端或中间接上信号分子(如荧光素FITC，FAM，罗丹明B，或放射性分子)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)或其它功能基团后，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。本发明还保护核酸探针，为核酸探针甲、核酸探针乙或核酸探针丙；所述核酸探针甲由DNA片段甲-I和DNA片段甲_2组成；所述DNA片段甲-I由序列表的序列I所示核苷酸组成 且5’末端具有荧光报告基团(核酸适体元件)；所述DNA片段甲-2由9-11个与序列表的序列I反向互补的核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团(互补元件)；所述核酸探针乙由DNA片段乙-I和DNA片段乙-2组成；所述DNA片段乙-I由序列表的序列3所示核苷酸组成且5’末端具有荧光报告基团(核酸适体元件)；所述DNA片段乙-2由9-11个与序列表的序列3反向互补的核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团(互补元件)；所述核酸探针丙由DNA片段丙-I和DNA片段丙-2组成；所述DNA片段丙-I由序列表的序列5所示核苷酸组成且5’末端具有荧光报告基团(核酸适体元件)；所述DNA片段丙-2由9-11个与序列表的序列5反向互补的核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团(互补元件)。所述DNA片段甲_1、DNA片段甲_2、DNA片段乙_1、DNA片段乙_2、DNA片段丙-I和DNA片段丙-2均为单链DNA。所述核酸探针的功能为如下(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f) (a)检测待测化合物是否为含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(b)检测待测物质中是否存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(c)检测待测物质中含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度；(d)检测待测化合物是否为烷基胺类化合物；(e)检测待测物质中是否存在烷基胺类化合物；(f)检测待测物质中烷基胺类化合物的浓度。所述DNA片段甲-2具体可由序列表的序列2所示核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团。所述DNA片段乙-2具体可由序列表的序列4所示核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团。所述DNA片段丙-2具体可由序列表的序列6所示核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团。所述荧光报告基团为FAM(如6-FAM)、罗丹明B、FITC、TAMRA、Cy3或Cy5。所述荧光淬灭基团为BHQl、DABCYL或BHQ2。所述(a)和/或(b)和/或(C)中，所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物具体可为Ne -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸。所述(d)和/或(e)和/或(f)中，所述烷基胺类化合物为氨基上连接有两个以上碳的烷基链化合物。所述(d)和/或(e)和/或(f)中，所述烷基胺类化合物具体可为L-赖氨酸。所述DNA片段或所述核酸探针可用于如下(A)、(B)、(C)、(D)、(E)或(F) (A)检测待测化合物是否为含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(B)检测待测物质中是否存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(C)检测待测物质中含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度；(D)检测待测化合物是否为烷基胺类化合物；(E)检测待测物质中是否存在烷基胺类化合物；(F)检测待测物质中烷基胺类化合物的浓度。
所述(A)和/或(B)和/或(C)中，所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物具体可为Ne -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸。所述(D)和/或(E)和/或(F)中，所述烷基胺类化合物为氨基上连接有两个以上碳的烷基链化合物。所述(D)和/或(E)和/或(F)中，所述烷基胺类化合物具体可为L-赖氨酸。本发明还保护一种检测待测化合物是否为含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的方法，包括如下步骤将溶液甲与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将溶液乙与所述核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测化合物为候选的含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测化合物为候选的不含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；所述核酸探针溶液为以上任一所述核酸探针的溶液；所述溶液甲由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液乙为所述缓冲液。 所述方法中，所述孵育条件具体可为室温、30分钟。所述方法中，具体可将195 μ L核酸探针溶液与5 μ L所述溶液甲混合并将195 μ L核酸探针溶液与5μ L所述溶液乙混合。所述核酸探针溶液可由所述核酸适体元件、所述互补元件和探针缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为O. 05 μ Μ，所述互补元件的浓度为O. 15 μ Mo所述缓冲液具体可为探针缓冲液。所述探针缓冲液具体如下含100mMNa2HP04、20mM KH2PO4和500禮NaCl，其它为水。所述探针缓冲液的pH具体可为7. 4。所述溶液甲中，所述待测化合物的浓度可为4 μ Μ-4000 μ M0所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm,发射波长 500-600nm。具体可米用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)进行检测。所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物具体可为Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸。本发明还保护一种检测待测物质中是否存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的方法，包括如下步骤将溶液甲与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将溶液乙与所述核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测物质疑似存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测物质疑似不存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；所述核酸探针溶液为以上任一所述核酸探针的溶液；所述溶液甲由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液乙为所述缓冲液。所述方法中，所述孵育条件具体可为室温、30分钟。所述方法中，具体可将195 μ L核酸探针溶液与5 μ L所述溶液甲混合并将195 μ L核酸探针溶液与5μ L所述溶液乙混合。所述核酸探针溶液可由所述核酸适体元件、所述互补元件和探针缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为O. 05 μ Μ，所述互补元件的浓度为O. 15 μ Mo所述缓冲液具体可为探针缓冲液。所述探针缓冲液具体如下^lOOmM Na2HPO4^20mM KH2PO4和500禮NaCl，其它为水。所述探针缓冲液的pH具体可为7. 4。所述溶液甲中，所述待测化合物的浓度可为4 μ Μ-4000 μ M0
所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm,发射波长 500-600nm。具体可米用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)进行检测。所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物具体可为Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸。本发明还保护一种检测待测化合物是否为烷基胺类化合物的方法，包括如下步骤将衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液与溶液丙混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶 液混合孵育，作为实验组；将衍生剂的N，N-二甲基甲酰胺溶液与溶液丁混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测化合物为候选的烷基胺类化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测化合物为候选的非烷基胺类化合物；所述核酸探针溶液为以上任一所述核酸探针的溶液；所述衍生剂为硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液丁为所述缓冲液。所述衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，所述衍生剂的浓度具体可为1M。所述核酸探针溶液可由所述核酸适体元件、所述互补元件和探针缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为O. 05 μ Μ，所述互补元件的浓度为O. 15 μ M0所述探针缓冲液具体如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mM NaCl，其它为水。所述探针缓冲液的pH具体可为7. 4。所述溶液丙中，所述待测化合物的浓度为10mM。所述缓冲液可为Na2C03/NaHC03缓冲液。所述缓冲液的PH具体可为10. O。所述缓冲液具体为由Na2C03、NaHCO3和水组成，Na2CO3的浓度为0. 06M, NaHCO3的浓度为0. 04M。所述方法中，具体可将10 μ L衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丙混合并室温孵育30分钟，然后再将5uL混合液与100 μ L核酸探针溶液混合并室温孵育3h。所述方法中，具体可将10 μ L衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丁混合并室温孵育30分钟，然后再将5uL混合液与100 μ L核酸探针溶液混合并室温孵育3h。所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm,发射波长 500-600nm。具体可米用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)进行检测。所述待测化合物可为乙醇胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-赖氨酸或含L-赖氨酸的多肽。所述烷基胺类化合物可为氨基上连接有两个以上碳的烷基链化合物，具体可为乙醇胺、L-赖氨酸或含L-赖氨酸的多肽。本发明还保护一种检测待测物质中是否存在烷基胺类化合物的方法，包括如下步骤将衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液与溶液丙混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将衍生剂的N，N-二甲基甲酰胺溶液与溶液丁混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测物质疑似存在烷基胺类化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测物质疑似不存在烷基胺类化合物；所述核酸探针溶液为以上任一所述核酸探针的溶液；所述衍生剂为硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液丁为所述缓冲液。所述衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，所述衍生剂的浓度具体可为1M。所述核酸探针溶液可由所述核酸适体元件、所述互补元件和探针缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为O. 05 μ Μ，所述互补元件的浓度为O. 15 μ M0所述探针缓冲液具体如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mM NaCl，其它为水。所述探针缓冲液的pH具体可为7. 4。所述溶液丙中，所述待测化合物的浓度为10mM。所述缓冲液可为Na2C03/NaHC03缓冲液。所述缓冲液的PH具体可为10. O。所述缓冲液具体为由Na2C03、NaHCO3和水组成，Na2CO3的浓度为O. 06M, NaHCO3的浓度为O. 04M。所述方法中，具体可将IOyL衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丙混合并室温孵育30分钟，然后再将5uL混合液与100 μ L核酸探针溶液混合并室温孵育3h。所述方法中，具体可将10 μ L衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L所述溶液丁混合并室温孵育30分钟，然后再将5uL混合液与100 μ L核酸探针溶液混合并室温孵育3h。所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm,发射波长 500-600nm。具体可米用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)进行检测。所述待测物质可为乙醇胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-赖氨酸和含L-赖氨酸的多肽中的至少一种。所述烷基胺类化合物可为氨基上连接有两个以上碳的烷基链化合物，具体可为乙醇胺、L-赖氨酸和含L-赖氨酸的多肽中的至少一种。本发明还保护一种检测待测物质中含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度的方法，包括如下步骤将待测物质溶液与核酸探针溶液混合孵育后检测荧光信号，通过对照标准曲线得到待测物质中所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度；所述核酸探针溶液为以上任一所述核酸探针的溶液。所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物具体可为Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸。所述标准曲线具体可为用Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸作为标准品制作的标准曲线。所述方法中，所述孵育条件具体可为室温、30分钟。所述方法中，具体可将195 μ L核酸探针溶液与5 μ L待测化合物溶液混合。所述核酸探针溶液可由所述核酸适体元件、所述互补元件和探针缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为0. 05 μ Μ，所述互补元件的浓度为0. 15 μ M0所述待测化合物溶液可由待测化合物和探针缓冲液组成。所述探针缓冲液具体如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mMNaCl，其它为水。所述探针缓冲液的pH具体可为7. 4。所述待测化合物溶液中，所述待测化合物的浓度可为4 μ Μ-4000 μ Μ。 所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm,发射波长 500-600nm。具体可米用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)进行检测。
本发明还保护一种检测待测物质中烷基胺类化合物的浓度的方法，包括如下步骤将衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液与待测化合物溶液混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，然后检测荧光信号，通过对照标准曲线得到待测物质中所述烷基胺类化合物的浓度；所述核酸探针溶液为以上任一所述核酸探针的溶液；所述衍生剂为硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘。所述烷基胺类化合物可为氨基上连接有两个以上碳的烷基链化合物，具体可为L-赖氨酸、乙醇胺或含L-赖氨酸的多肽。所述标准曲线具体可为用L-赖氨酸作为标准品制作的标准曲线。所述衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液中，所述衍生剂的浓度具体可为1M。所述核酸探针溶液可由所述核酸适体元件、所述 互补元件和探针缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为O. 05 μ Μ，所述互补元件的浓度为O. 15 μ M0所述探针缓冲液具体如下^lOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4和500mM NaCl，其它为水。所述探针缓冲液的pH具体可为7. 4。所述待测化合物溶液的制备方法如下将所述待测化合物溶于检测缓冲液中，使待测化合物的浓度为10mM。所述检测缓冲液可为Na2C03/NaHC0d^冲液。所述检测缓冲液的PH具体可为10. O。所述检测缓冲液具体为由Na2C03、NaHCO3和水组成，Na2CO3的浓度为 O. 06M, NaHCO3 的浓度为 O. 04M。所述方法中，具体可将IOyL衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液和100 μ L待测化合物溶液混合并室温孵育30分钟，然后再将5uL混合液与100 μ L核酸探针溶液混合并室温孵育3h。所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm,发射波长 500-600nm。具体可米用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. DevicesCorporation, USA)进行检测。本发明的方法具有操作简单、灵敏、快速、特异、成本低等优点。
图I为核酸探针检测含对硝基苯磺酰胺基的化合物原理示意图。图2为实施例4中核酸适体探针检测不同浓度Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的荧光光谱图。图3为实施例4中核酸适体探针检测不同浓度^ -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸525nm处荧光值与对应浓度值的比例关系图。图4为实施例5中核酸探针甲对L-赖氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应突光光谱图。图5为实施例6中核酸探针甲对乙醇胺的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应荧光光谱图。图6为实施例7中核酸探针甲对L-苯丙氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应荧光光谱图。图7为实施例8中核酸探针甲对甘氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应荧光光谱图。图8为实施例9中核酸探针甲对混合氨基酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应荧光光谱图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Na2C03/NaHC03 缓冲液(pH10、0. 1M):由 Na2C03、NaHCO3 和水组成，Na2CO3 的浓度为
O.06M, NaHCO3 的浓度为 O. 04M。
实施例I、Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸和Ne-对硝基苯甲酰-L-赖氨酸的合成一、Ne -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的合成和表征UNe-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的合成(I)将2. 5毫摩尔CuSO4和5毫摩尔L-赖氨酸溶解在15mL水中，100°C回流lh，然后用IM Na2CO3调节pH至10，过滤收集滤液。(2)取步骤(I)的滤液，边搅拌边在I小时左右滴加10毫升对硝基苯磺酰氯的二氧六环溶液(其中含有4. 7毫摩尔对硝基苯磺酰氯)，滴加完后继续在室温下搅拌12小时，然后离心(3000转/分)收集沉淀。(3)将步骤⑵的沉淀依次用20mL水洗漆三次、用20mL 二氧六环洗漆三次,然后悬浮于IOOmL水，在强烈搅拌条件下慢慢滴加饱和Na2S水溶液直到再无黑色沉淀出现，然后离心(3000转/分)收集上清。(4)取步骤(3)的上清，调节pH至7，重结晶后得到浅黄色固体。2、Ne -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的表征步骤I得到的固体的核磁谱图(一维氢谱，400MHz，DMF_d8) δ 8. 40 (2Η, d，J =
11.2Hz)，δ 8. 05 (2H, d, J = 11. 3Hz)，δ 7. 56 (1H, s)，δ 3. 33 (2H, s)，δ 3. 07 (1Η, t, J =
12.0Hz)，δ 2. 77 (2Η, t, J = 7. OHz)，δ I. 55 (2Η, m)，δ I. 35 (4Η, m)。步骤I得到的固体的质谱(ESI)m/z (理论值)331. I, m/z (测定值)330. I(M-H)'以上结果表明，步骤I得到的固体为Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸。二、Ne-对硝基苯甲酰-L-赖氨酸的合成和表征1、Νε_对硝基苯甲酰-L-赖氨酸的合成(I)将2.5毫摩尔&1504和5毫摩尔1^赖氨酸溶解在151^水中，1001回流111，然后用IM Na2CO3调节pH至10，过滤收集滤液。(2)取步骤(I)的滤液，边搅拌边在I小时左右滴加10毫升对硝基苯甲酰氯的二氧六环溶液(其中含有4. 7毫摩尔对硝基苯甲酰氯)，滴加完后继续在室温下搅拌12小时，然后离心(3000转/分)收集沉淀。(3)将步骤⑵的沉淀依次用20mL水洗漆三次、用20mL 二氧六环洗漆三次,然后悬浮于IOOmL水，在强烈搅拌条件下慢慢滴加饱和Na2S水溶液直到再无黑色沉淀出现，然后离心(3000转/分)收集上清。(4)取步骤(3)的上清，调节pH至7，重结晶后得到灰白色固体。2、Ne-对硝基苯甲酰-L-赖氨酸的表征
步骤I得到的固体的核磁谱图(一维氢谱，400MHz，DMF_d8) : δ 8. 89 (1H，s)，δ 8. 30 (2H, d, J = 3. 1Hz)，δ 8. 10 (2H, d, J = 4. 8Hz)，δ 7. 54 (1H, s)，δ 3. 33 (5Η, m)，δ 3. 12 (1Η, s)，δ I. 73 (2Η, m)，δ I. 56 (2Η, m)，δ I. 39 (2Η, m)。步骤I得到的固体的质谱(ESI)m/z (理论值)295. I, m/z (测定值)294. 1(M-H)_。以上结果表明，步骤I得到的固体为Ne-对硝基苯甲酰-L-赖氨酸。实施例2、核酸适体的筛选和制备结合缓冲溶液(ρΗ7·4):含 137mM NaCl、0. 5mM MgCl2,2. 7mM KCl、2mM KH2PO4 和IOmM Na2HP04。洗脱缓冲液(ρΗ8· 0):含 25mM Tris-HClUOmM EDTA 和 3.5M 尿素。一、甘氨酸和Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的固定将O. 5g环氧活化Sepharose 6B (通用电气医疗集团,瑞典)微球用IOOmL水反复洗涤，获得I. 75mL湿球，然后用O. 2M Na2CO3 (pH 乂 12)置换溶胀的微球中的水分，在3. 5mL反应体系中加入IOOmM甘氨酸或Ne -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸，置于室温条件下振荡反应48h。反应结束后用pH4. 5醋酸钠缓冲溶液(O. IM醋酸钠，O. 5M NaCl)和pH12碳酸钠缓冲溶液(O. 2M NaHC03/Na2C03,0. 5M NaCl)反复交替洗涤微球，最后用水洗涤，并定容至3. 5mL,4 °C冰箱保存。二、随机核酸文库的设计设计两端包括20个固定核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机文库如下5’ -ACGCTCGGATGCCACTACAG-N45-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；N45 代表 45 个随机核苷酸序列。三、核酸适体的筛选I、文库预处理将约60pmol随机核酸文库溶于结合缓冲液，95°C变性5min，冰上冷却15min，室温放置5min。2、反筛在2-11轮筛选前，将随机核酸文库溶液与固定有甘氨酸的微球混合，95°C下孵育I小时，离心除去甘氨酸微球。在12-20轮筛选的结合缓冲溶液中加入ImM Ne-对硝基苯甲酰-L-赖氨酸以除去和对硝基苯甲酰胺基结合的核酸适体。3、正筛将反筛过程中得到的溶液与固定Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的微球孵育一段时间。再用结合缓冲液清洗微球几次之后，用洗脱缓冲液在95°C加热5min，洗脱结合在Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸微球上的DNA，测定洗脱液的荧光强度。然后，向洗脱液中加Λ I μ L糖原(20mg/mL)和4倍体积的酒精,置于_20°C沉淀30min, 12000rpm离心15min,去上清，真空干燥，用IOOyL millipore水定容。然后进行PCR扩增。PCR扩增程序为(94°C3min，56°C 30s, 72°C 30s)。用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA(ssDNA)序列。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团，瑞典)脱盐，真空干燥，用于下一轮的筛选。为了提高核酸适体的亲和力和特异性，在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛球用量和增加反筛球用量，以增加筛选的压力。20轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’ 和 5’ -GTCACCAGCACGTCCATGAG-3 ’ )进行 PCR 扩增，将 PCR产物进行测序。最终选择的核酸适体(11，12，10，14和115)如下核酸适体Ml:5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGAA GGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCC TTCTAGTCTTACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；核酸适体M2:5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGGGACTA CTAAGCAGGTAGGTATGGATTGGTTGCATTAG
GAGTACTCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；核酸适体M3:
5，-ACGCTCGGATGCCACTACAGAGAGGGCC TGAGACTATGGCGGGCATTGGCAGTGAAATGGTTGGTCT CA
TGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；核酸适体M5:5，-ACGCTCGGATGCCA CTACAGTATGGTGGGTATTGGCATGCAATGGTGCTAGTAG TGCATTCGTGCCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’ ；其中加粗下划线标记的为核心序列。4、核酸适体的优化步骤3得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，通过荧光染料修饰，然后考察它们与Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸糖球的结合能力，挑选结合能力最强的序列用于进一步的应用，优化后的序列长度只有32-41个核苷酸。最终得到的截短核酸适体序列如下核酸适体I:5 ’ -TGAGACTATGGCGGGCATTGGCAGTGAAATGGTTGGTCTCA-3，；核酸适体2:5，-AGAAGGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCCTTCT-3，；核酸适体3:5’ -CTAAGCAGGTAGGTATGGATTGGTTGCATTAG-3’ ；核酸适体4:5，-CTACAGTATGGTGGGTATTGGCATGCAATGGTGCTAGTAG-3，。核酸适体5:5，-GGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCC-3，。5、进一步优化将核酸适体5进一步优化，得到核酸适体6，序列如下5，-ATCATGGTGGGTATCGGCACTCGTTGGTTGAT-3，。实施例3、核酸探针的制备
由上海生物工程公司合成如下三组核酸探针核酸探针甲由两条DNA片段(DNA片段甲-I和DNA片段甲_2)组成；DNA片段甲-I为核酸适体且其5’末端具有6-FAM(荧光报告基团)，简称核酸适体元件；DNA片段甲_2为核酸适体的部分反向互补序列且其3’末端具有BHQl (荧光淬灭基团)，简称互补元件；核酸探针乙由两条DNA片段(DNA片段乙-I和DNA片段乙-2)组成；DNA片段乙-I为核酸适体且其5’末端具有6-FAM(突光报告基团)，简称核酸适体兀件；DNA片段乙-2为核酸适体的部分反向互补序列且其3’末端具有BHQl (荧光淬灭基团)，简称互补元件；核酸探针丙由两条DNA片段(DNA片段丙-I和DNA片段丙-2)组成；DNA片段丙-I为核酸适体且其5’末端具有6-FAM(荧光报告基团)，简称核酸适体元件；DNA片段丙-2为核酸适体的部分反向互补序列且其3’末端具有BHQl (荧光淬灭基团)，简称互补元件；各个DNA片段的核苷酸序列如下DNA 片段甲-I (序列表的序列 I) :5’ -ATCATGGTGGGTATCGGCACTCGTTGGTTGAT-3’ ；DNA 片段甲-2 (序列表的序列 2) :5’ -CACCATGAT-3’。DNA 片段乙-I (序列表的序列 3) :5’ -GGCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTGCC-3’ ；DNA 片段乙-2 (序列表的序列 4) :5’ -CACCATGCC-3’。DNA 片段丙-I (序列表的序列 5) :5’ -AGAAGOCATGGTGGGTATCGGCACTCGCTGGTTCCTTCT-3，；DNA 片段丙-2 (序列表的序列 6) :5’ -ACCATGCCTTC-3’。核酸适体探针的检测原理如图I所示。当检测体系中不存在含对硝基苯磺酰胺基的化合物时，核酸适体兀件与互补兀件杂交，核酸适体兀件5’端的突光报告基团和互补兀件3’端的荧光淬灭基团靠近，荧光被淬灭。当检测体系中存在含对硝基苯磺酰胺基的化合物时，含对硝基苯磺酰胺基的化合物与核酸适体元件的结合能力强于互补元件与核酸适体元件的结合能力，使得荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而产生明显的荧光。实施例4、核酸探针对不同浓度Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的响应考察探针缓冲液(ρΗ7·4):含 IOOmM Na2HPO4,20mM KH2PO4 和 500mM NaCl，其它为水。分别将实施例3制备的三组核酸探针进行如下实验I、制备核酸探针体系核酸探针体系由核酸适体元件、互补元件和探针缓冲液组成，核酸适体元件的浓度为0.05 μ M，互补元件的浓度为O. 15 μ Mo 4°C保存。2、取195 μ L核酸探针体系，加入5 μ L Νε-对硝基苯磺酰_L_赖氨酸溶液(用探针缓冲液配制，Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的浓度分别为4 μ M、8 μ M、20 μ M、40 μ M、80 μ Μ、200 μ Μ、400 μ Μ、1000 μ Μ、2000 μ M或4000 μ M ;将探针缓冲液作为O浓度对照)，在室温下孵育 30 分钟，然后用酶标仪 SpectraMax Μ5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录荧光光谱，激发波长485nm，发射波长500_600nm。核酸探针甲的结果见图2。核酸探针甲对Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸有很好的响应，并且其响应信号随着Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸浓度的增大而增大。核酸探针乙和核酸探针丙具有相似的结果。3、以不同Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸浓度下核酸探针在525nm处的荧光值(F)和O浓度对照时核酸探针在525nm处的荧光值(FO)的差值对Ne -对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的浓度作图。
核酸探针甲的结果见图3。在O. 5-10 μ M范围内，核酸探针甲的荧光增强信号对Ne-对硝基苯磺酰-L-赖氨酸的浓度有很好地线性关系。核酸探针乙和核酸探针丙与核酸探针甲具有相似的结果。实施例5、核酸探针对L-赖氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应考察
分别将实施例3制备的三组核酸探针进行如下实验实验组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将L-赖氨酸溶于Na2C03/NaHC03缓冲液(pHIO、
O.1M)，得到浓度为IOmM的L-赖氨酸溶液，4°C保存；3、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L步骤2制备的L-赖氨酸溶液混合,室温孵育30分钟；4、取5uL步骤3得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm,发射波长 500-600nm。
阴性对照组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L Na2C03/NaHC03缓冲液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室温孵育30分钟；3、取5uL步骤2得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm,发射波长 500-600nm。空白对照组进行如下处理取5uL实施例4制备的探针缓冲液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h,用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)记录突光光谱,激发波长485nm,发射波长500_600nm。核酸探针甲的结果见图4。核酸探针甲对含L-赖氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液响应体现为荧光信号大大增强，而对无L-赖氨酸的对照对硝基苯磺酰氯衍生反应液则几乎没有荧光信号响应，这说明本发明的核酸适体探针体系可以很好地通过对硝基苯磺酰氯衍生来实现对L-赖氨酸的检测。核酸探针乙和核酸探针丙与核酸探针甲具有相似的结果O实施例6、核酸探针对乙醇胺的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应考察分别将实施例3制备的三组核酸探针进行如下实验实验组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将乙醇胺溶于Na2C03/NaHC03缓冲液(pHIO、
0.1M)，得到浓度为IOmM的乙醇胺溶液，4°C保存；3、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L步骤2制备的乙醇胺溶液混合，室温孵育30分钟；4、取5uL步骤3得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合,室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长 485nm,发射波长 500-600nm。阴性对照组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L Na2C03/NaHC03缓冲液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室温孵育30分钟；3、取5uL步骤2得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm,发射波长 500-600nm。空白对照组进行如下处理取5uL实施例4制备的探针缓冲液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h,用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)记录突光光谱,激发波长485nm,发射波长500_600nm。核酸探针甲的结果见图5。核酸探针甲对含乙醇胺的对硝基苯磺酰氯衍生反应液响应体现为荧光信号大大增强，而对无乙醇胺的对照对硝基苯磺酰氯衍生反应液则几乎没有荧光信号响应，这说明本发明的核酸适体探针体系可以很好地通过对硝基苯磺酰氯衍生来实现对乙醇胺的检测。核酸探针乙和核酸探针丙与核酸探针甲具有相似的结果。实施例7、核酸适体探针对L-苯丙氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应考察分别将实施例3制备的三组核酸探针进行如下实验
实验组进行如下处理1、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将L-苯丙氨酸溶于Na2C03//NaHC03缓冲液(pH10、0. 1M)，得到浓度为IOmM的L-苯丙氨酸溶液，4°C保存；3、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L步骤2制备的L-苯丙氨酸溶液混合，室温孵育30分钟；4、取5uL步骤3得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h,用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm，发射波长500_600nm。阴性对照组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L Na2C03/NaHC03缓冲液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室温孵育30分钟；3、取5uL步骤2得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm,发射波长 500-600nm。空白对照组进行如下处理取5uL实施例4制备的探针缓冲液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h,用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)记录突光光谱,激发波长485nm,发射波长500_600nm。核酸探针甲的结果见图6。核酸探针甲对含和不含L-苯丙氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液几乎没有荧光信号响应，这说明本发明的核酸适体探针体系对于在α碳上带有羧基基团的氨基并没有响应，可以区分氨基的α碳上是否含有羧基。核酸探针乙和核酸探针丙与核酸探针甲具有相似的结果。实施例8、核酸适体探针对甘氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应考察分别将实施例3制备的三组核酸探针进行如下实验实验组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将甘氨酸溶于Na2C03/NaHC03缓冲液(pHIO、
0.1M)，得到浓度为IOmM的甘氨酸溶液，4°C保存；3、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L步骤2制备的甘氨酸溶液混合，室温孵育30分钟；4、取5uL步骤3得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合,室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长 485nm,发射波长 500-600nm。 阴性对照组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L Na2C03/NaHC03缓冲液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室温孵育30分钟；3、取5uL步骤2得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h，用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA 记录突光光谱，激发波长 485nm,发射波长500-600nm。空白对照组进行如下处理取5uL实施例4制备的探针缓冲液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h,用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)记录突光光谱,激发波长485nm,发射波长500_600nm。核酸探针甲的结果 见图7。核酸探针甲对含和不含甘氨酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液几乎没有荧光信号响应，这说明本发明的核酸适体探针体系对于在α碳上带有羧基基团的氨基并没有响应，可以区分氨基的α碳上是否含有羧基。核酸探针乙和核酸探针丙与核酸探针甲具有相似的结果。实施例9、核酸适体探针对混合氨基酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液的响应考察分别将实施例3制备的三组核酸探针进行如下实验实验组I进行如下处理1、将硝基苯磺酰氯溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将各种氨基酸溶于Na2C03/NaHC03缓冲液(pH10、0. 1M)，得到甘氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-缬氨酸和L-赖氨酸浓度均为IOmM的混合氨基酸溶液,4°C保存；3、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L步骤2制备的混合氨基酸溶液混合，室温孵育30分钟；4、取5uL步骤3得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育 3h,用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm，发射波长500_600nm。实验组2进行如下处理1、将硝基苯磺酰氯溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将各种氨基酸溶于Na2C03/NaHC03缓冲液(pH10、0. 1M)，得到甘氨酸、L-组氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸和L-缬氨酸浓度均为IOmM的混合氨基酸溶液,4°C保存；3、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L步骤2制备的混合氨基酸溶液混合，室温孵育30分钟；4、取5uL步骤3得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育 3h,用酶标仪 SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation,USA)记录突光光谱，激发波长485nm,发射波长500_600nm。阴性对照组进行如下处理I、将硝基苯磺酰氯溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)，得到浓度为IM的对硝基苯磺酰氯溶液，4°C保存；2、将10 μ L步骤I制备的对硝基苯磺酰氯溶液与100 μ L Na2C03/NaHC03缓冲液(ρΗ10、0· 1Μ)混合，室温孵育30分钟；3、取5uL步骤2得到的溶液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h，用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光光谱，激发波长485nm,发射波长 500-600nm。空白对照组进行如下处理取5uL实施例4制备的探针缓冲液，与100 μ L实施例4的步骤I制备的核酸探针体系混合，室温孵育3h,用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular.Devices Corporation, USA)记录突光光谱,激发波长485nm,发射波长500_600nm。核酸探针甲的结果见图8。核酸探针甲对含L-赖氨酸的混合氨基酸的对硝基苯磺酰氯衍生反应液响应体现为荧光信号大大增强，而对无L-赖氨酸的混合氨基酸的对照对硝基苯磺酰氯衍生反应液则几乎没有荧光信号响应，这说明本发明的核酸适体探针体系可以很好地通过对硝基苯磺酰氯衍生来实现对混 合氨基酸中的L-赖氨酸的检测。核酸探针乙和核酸探针丙与核酸探针甲具有相似的结果。
权利要求
1.序列表的序列I、序列3或序列5所示的单链DNA片段。
2.核酸探针，为核酸探针甲、核酸探针乙或核酸探针丙； 所述核酸探针甲由DNA片段甲-I和DNA片段甲-2组成；所述DNA片段甲-I由序列表的序列I所示核苷酸组成且5’末端具有荧光报告基团；所述DNA片段甲-2由9-11个与序列表的序列I反向互补的核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团； 所述核酸探针乙由DNA片段乙-I和DNA片段乙-2组成；所述DNA片段乙-I由序列表的序列3所示核苷酸组成且5’末端具有荧光报告基团；所述DNA片段乙-2由9-11个与序列表的序列3反向互补的核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团； 所述核酸探针丙由DNA片段丙-I和DNA片段丙-2组成；所述DNA片段丙-I由序列表的序列5所示核苷酸组成且5’末端具有荧光报告基团；所述DNA片段丙-2由9-11个与序列表的序列5反向互补的核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团。
3.如权利要求2所述的核酸探针，其特征在于所述DNA片段甲-2由序列表的序列2所示核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团；所述DNA片段乙-2由序列表的序列4所示核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团；所述DNA片段丙-2由序列表的序列6所示核苷酸组成且3’末端具有荧光淬灭基团。
4.权利要求I所述DNA片段、权利要求2所述核酸探针或权利要求3所述核酸探针在如下(A)、(B)、(C)、(D)、(E)或(F)中的应用(A)检测待测化合物是否为含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(B)检测待测物质中是否存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(C)检测待测物质中含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度；(D)检测待测化合物是否为烷基胺类化合物；(E)检测待测物质中是否存在烷基胺类化合物；(F)检测待测物质中烷基胺类化合物的浓度。
5.一种检测待测化合物是否为含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的方法，包括如下步骤将溶液甲与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将溶液乙与所述核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测化合物为候选的含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测化合物为候选的不含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；所述核酸探针溶液为权利要求2或3所述核酸探针的溶液；所述溶液甲由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液乙为所述缓冲液。
6.—种检测待测物质中是否存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的方法，包括如下步骤将溶液甲与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将溶液乙与所述核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测物质疑似存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测物质疑似不存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；所述核酸探针溶液为权利要求2或3所述核酸探针的溶液；所述溶液甲由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液乙为所述缓冲液。
7.—种检测待测化合物是否为烷基胺类化合物的方法，包括如下步骤将衍生剂的N，N-二甲基甲酰胺溶液与溶液丙混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液与溶液丁混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测化合物为候选的烷基胺类化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测化合物为候选的非烷基胺类化合物；所述核酸探针溶液为权利要求2或3所述核酸探针的溶液；所述衍生剂为硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液丁为所述缓冲液。
8.—种检测待测物质中是否存在烷基胺类化合物的方法，包括如下步骤将衍生剂的N, N- 二甲基甲酰胺溶液与溶液丙混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为实验组；将衍生剂的N，N- 二甲基甲酰胺溶液与溶液丁混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号，如果所述实验组的荧光信号显著高于所述对照组的荧光信号、所述待测物质疑似存在烷基胺类化合物，如果所述实验组的荧光信号和所述对照组的荧光信号没有显著差异、所述待测物质疑似不存在烷基胺类化合物；所述核酸探针溶液为权利要求2或3所述核酸探针的溶液；所述衍生剂为硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘；所述溶液丙由所述待测化合物和缓冲液组成；所述溶液丁为所述缓冲液。
9.一种检测待测物质中含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度的方法，包括如下步骤将待测物质溶液与核酸探针的溶液混合孵育后检测荧光信号，通过对照标准曲线得到待测物质中所述含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度；所述核酸探针溶液为权利要求2或3所述核酸探针的溶液。
10.一种检测待测物质中烷基胺类化合物的浓度的方法，包括如下步骤将衍生剂的N, N- 二甲基甲酰胺溶液与待测化合物溶液混合孵育，然后再将混合液与核酸探针溶液混合孵育，然后检测荧光信号，通过对照标准曲线得到待测物质中所述烷基胺类化合物的浓度；所述核酸探针溶液为权利要求2或3所述核酸探针的溶液；所述衍生剂为硝基苯磺酰氯、硝基苯磺酰溴或硝基苯磺酰碘。
全文摘要
本发明公开了一种识别含对硝基苯磺酰胺基的化合物的核酸适体及其应用。本发明提供的核酸适体为序列表的序列1、序列3或序列5所示的单链DNA片段。所述核酸适体具有如下功能(a)检测待测化合物是否为含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(b)检测待测物质中是否存在含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物；(c)检测待测物质中含对硝基苯磺酰氨基基团的化合物的浓度；(d)检测待测化合物是否为烷基胺类化合物；(e)检测待测物质中是否存在烷基胺类化合物；(f)检测待测物质中烷基胺类化合物的浓度。本发明的方法具有操作简单、灵敏、快速、特异、成本低等优点。
文档编号C12N15/11GK102618546SQ201210111610
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者上官棣华, 刘祥军, 梅宏成, 邴涛 申请人:中国科学院化学研究所