专利名称：一种利用蛹虫草液体发酵生产纤溶酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康、导致死亡率最高的疾病之一，包括急性心肌梗死、缺血性心脏病、心血管疾病、心脏瓣膜病、周边血管疾病、心律失常、高血压、脑栓塞、肺栓塞等。日渐成胁着人类的健康。根据发表在美国心脏协会的《循环心血管质量与结果》杂志上的一项研究预计，仅仅由于2010年到2030年的衰老和人口增长，世界范围内的年心血管疾病发病率将增长50%。目前治疗血栓栓塞疾病的最为有效并且可靠的手段是溶栓疗法，因此，溶栓抗栓药物的研制开发已成为国内外研究热点之一。目前用于血栓性疾病治疗的药物都不同程度具有纤维蛋白特异性差、体内半衰期短、生产成本高、需大剂量连续用药等缺点。于是国内外专家学者逐渐将目光投向寻找一些安全性好、副作用小、疗效好的天然来源的溶栓药物。虫草菌是我国传统名贵中药，属子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、幾壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草菌属(Cordyceps Frey Link.),是一种虫生真菌。在民间，常常被称为冬虫夏草。药理学研究表明在增强免疫力、抗肿瘤、抗细菌和抗真菌等方面具有良好功效。蛹虫草(Cordyceps militaris)因与冬虫夏草的活性成分上有着相似的生化结构和药用功能，近年来备受各界关注。由于对蛹虫草的需求增长迅速，野生蛹虫草资源被疯狂采摘而日益稀缺，因此其广泛应用受到药源资源的严重制约。研究发现，通过液体发酵生产与从蛹虫草子实体、菌丝体中直接提取得到的虫草纤溶酶等活性成分在生化结构、生理作用上基本是相同的，而且具有培养周期短、生产流程易控制、活性物质易于提取等优点，已有报道蛹虫草的纤溶酶等活性物质的提取含量及效率都要远高于利用人工栽培虫草进行生产和提取。但是目前的蛹虫草液体培养研究和应用仍是起步阶段，许多发酵技术和工艺仍不成熟，整体产量和发酵水平较低，限制了其工业化生产的发展。扩张蛋白是在植物细胞壁中发现的一类新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白几乎参与了植物的整个发育过程除具有增大细胞的功能外，扩张蛋白在细胞生长、种子萌发、根毛形成、根系生长、叶原基形成、叶子生长发育、果实成熟、器官脱离，以及花粉管生长方面起着重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验表明扩张蛋白是一类细胞壁酶蛋白，能够通过打断细胞壁多聚物之间的氢键诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛，进而可能还是在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸过程中的一个重要调控因子。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于食药用菌蛹虫草的液体发酵进行纤溶酶等次生代谢产物的生产，国内外目前均未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白进行提高蛹虫草液体发酵生产纤溶酶产量的方法。本发明技术方案具体如下一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，包括如下步骤(I)将蛹虫草菌种接种到H)液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10 15%的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为温度 20 25°C，摇床培养24 72h，得种子液；(2)将步骤(I)制得种子液按5 15%的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20 25°C的条件下，液体发酵培养20 30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为I. O 3. 5mg/mL，然后继续培养120 168h，分离去除蛹虫草菌丝体得纤溶酶发酵上清液；(3)从步骤(2)制得的纤溶酶发酵上清液中提取蛹虫草胞外纤溶酶，即得蛹虫草纤溶酶。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的ro液体发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 160r/ min，温度20 25 °C，暗培养活化24 72h。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的种子发酵培养基，每升组分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6_的玻璃珠。经种子发酵培养基培养后，菌球数量可提高60%以上、菌球直径缩小40%以上，菌丝松散均匀。根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3 g KH2PO4'
O.3 gK2HP04。根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I. 5 3. 5mg/mL ;进一步优选的，扩张蛋白的浓度为I. 5 3. Omg/mL ;最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为 2. Omg/mL ο所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液将蚕豆或黄瓜种子经0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水冲洗5 7h，栽入湿蛭石，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗上胚轴或根系4 5cm，置_20°C预冷I 2h,加预冷至O 4°C的匀浆缓冲液匀浆后，用孔径60 80 μ m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液，O 4°C下提取24 30h，过滤，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加 (NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24 30h， 4°C条件下25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心5 lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为25mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙横酸)，3mmol/L Na2S2O5, Immo 1/L EDTA (乙二胺四乙酸)，O. Iwt % Triton X-100, pH 7. O ;所述提取液组分为25mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L EDTA,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性缓冲液配制是将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节PH至4. 0，水定容至1L。根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离是在4°C 12000r/min条件下离心分离 10 15min。根据本发明优选的，所述步骤(3)中提取蛹虫草胞外纤溶酶的方法，步骤如下在0°C条件下，向步骤(2)制得的纤溶酶发酵上清液中按O. 14g/mL的添加量添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，(TC静置沉淀4 8h去除杂蛋白，4 12000rpm离心IOmin,弃沉淀,按O. 51g/mL的添加量将研磨后的硫酸铵加入上清液，静置4 8h ;4°C条件下，12000rpm离心lOmin，弃上清液，沉淀溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；用截留分子量为3000Da的透析袋透析，然后用截留分子量为3000Da的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得蛹虫草胞外纤溶酶。所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是将O. 69g磷酸二氢钠、O. 012g柠檬酸溶于蒸馏水中，定容至lL，pH 8.0。本发明同现有技术相比有如下优点I.本发明将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于蛹虫草纤溶酶的液体发酵生产，大幅度提高了虫草纤溶酶的液体发酵产量，使产量达到每升发酵液93270U，是传统发酵生产方法(对比例I)产量的2. 69倍以上，具有极好的工业化应用前景。2、本发明采用液体好氧发酵方法，一般为6 8天，相对于现有技术，产量高，周期短，无需静置培养及诱导合成产物等过程，生产效率较高，所生产的蛹虫草的纤溶酶活性成分可直接用于治疗心血管疾病、高血压、脑栓塞、肺栓塞等血栓栓塞性疾病药物的制备；3、本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物中提取，来源广泛，成本较低，本发明的制备方法经优化后步骤也相对简单，产量高，可规模提取生产，对蛹虫草纤溶酶类活性物质的发酵生产具有很好的促进和提升效果；4、本发明所采用的蛹虫草液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，而且全发酵过程可控，不受外部环境条件限制，非常适合工业规模化发酵罐培养生产。本方法也适用于其它普通香菇栽培品种5、本发明对液体发酵培养基和种子发酵培养基的配方进行了优化，能够大幅度提高蛹虫草的纤溶酶活性成分的产量。
图I是不同浓度的扩张蛋白溶液对蛹虫草的纤溶酶产量的影响曲线；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。原料及培养基实施例中所述的蛹虫草(Cordyceps militaris)发酵菌种，菌种保藏号为CGMCCNo. 5. 700和CGMCC No. 3. 4655，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。实施例中的凝血酶、纤维蛋白原琼脂、尿激酶标准品均购自济南盛伟生物科技有限公司；实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下将蚕豆(Vicia fabaL.;购自济南茂丰种苗有限公司)或黄瓜(Cucumis sativus L. CV. JinnianNo. 6 ;购自济南伟丽种业有限公司)种子经O. 15wt% HgCl2消毒6min,流水冲洗6h，栽入湿蛭石中，27°C暗培养4d。剪取幼苗上胚轴4 5cm，即生长区约100g， 置-20°C冰箱预冷lh，加预冷至4°C的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用70 μ m尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置2h，得静置液；向静置液中加入提取液，4°C下提取24h，过滤，滤液按O. 4g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4，添加(NH4)2SO4S程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24h，4°C条件下25000g 离心5min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4 °C条件下用截留分子量为3000Da的聚偏氟乙烯 (PVDF)透析袋(购自北京博润莱特科技有限公司)透析，透析液经20000g离心5min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步骤可参照McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J,Durachko D M,Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 以及https://homes, bio. psu. edu/expansins/ProtocoIs/Extraction. htm 中的描述进行。上述匀浆缓冲液组分为25mmol/LHEPES (4_羟乙基哌嗪乙磺酸)，3mmol/ LNa2S2O5, Immol /T, EDTA, O. Iwt% Triton X-100, pH 7. 0 ；上述提取液组分为25mmol/LHEPES, I. OmmoI/L EDTA,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/ LNaCl，pH 6. 8 ；所述酸性缓冲液每升按如下方法配制将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4. 0，水定容至1L。扩张蛋白溶液浓度的测定方法采用考马斯亮蓝法检测，具体可参照(《精编蛋白质科学实验指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中记载的考马斯亮蓝法进行操作， 以牛血清白蛋白作标准曲线，经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为O. 31g/mL。实施例中所述的ro液体发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至lOOOmL。实施例中所述的种子发酵培养基，每升组分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6mm的玻璃珠。实施例中所述的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3 g KH2PO4'
O.3g/L K2HPO4。实施例中所述的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是将O. 69g磷酸二氢钠、
O.012g朽1檬酸溶于蒸懼水中，定容至1L, pH 8.0。实施例I :一种利用扩张蛋白提高蛹虫草的纤溶酶成分产量的液体发酵方法，包括如下步骤
(I)将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种，菌种编号为 CGMCC No. 5. 700,接种到ro液体发酵培养基中，进行活化培养，在温度25°C、摇床转速150r/min的条件下暗培养 48h，然后按体积百分数15 %的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为 温度25°C，摇床培养48h，得种子液；(2)将步骤⑴制得种子液按15%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25°C 的条件下，液体发酵培养24h,然后加入扩张蛋白溶液,使扩张蛋白的浓度为I. 5mg/mL,然后继续培养144h, 12000r/min条件下离心分离IOmin,去菌丝沉淀得到发酵上清液；(3)从步骤(2)制得的蛹虫草发酵上清液中提取蛹虫草胞外纤溶酶的方法，步骤如下在0°C条件下，向步骤(2)制得的纤溶酶发酵上清液中按O. 14g/mL的添加量添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，(TC静置沉淀4h去除杂蛋白，4 12000rpm离心IOmin,弃沉淀,按O. 51g/mL的添加量将研磨后的硫酸铵加入上清液，静置6h ;4°C条件下，12000rpm离心lOmin，弃上清液，沉淀溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；用截留分子量为3000Da的透析袋透析，然后用截留分子量为3000Da 的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得蛹虫草胞外纤溶酶。蛹虫草纤溶酶待测样品的制备将通过IL发酵液制得的纤溶酶用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液定容至10mL，取 100 μ L稀释至5mL得蛹虫草纤溶酶待测样品。虫草纤溶酶活性成分的测定采用本领域常规的纤维蛋白平板法，测定方法参见文献(Astrup S，Mullertz. The fibrin Plate method for estimating of fibrinolytic activity[J]Archives of Biochemistry and Biophysics, 1952,40 :346-351)(I)纤维蛋白平板的制作将凝血酶与37°C的纤维蛋白原琼脂溶液混合，即生成纤维蛋白，立即倒平板，待凝固后即为纤维蛋白平板。点样梯度浓度的尿激酶标准品，37°C恒温孵育18h，测其溶解圈直径，log (cm2)与log(U/mL)呈线性相关。根据待测样品的溶圈面积大小计算出蛹虫草纤溶酶待测样品相当尿激酶的活力单位，来表示蛹虫草纤溶酶待测样品的纤溶活性。(2)尿激酶标准曲线的测定配制浓度为100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL 的尿激酶标准溶液。取
以上各浓度的尿激酶标准溶液100 μ L点样于纤维蛋白平板，37°C培养6h，游标卡尺测量水解圈的两垂直直径。以水解圈垂直直径的乘积的对数作为横坐标，尿激酶浓度的对数为纵坐标，做尿激酶标准曲线。(3)样品纤溶活性的测定取100 μ L蛹虫草纤溶酶待测样品点样于纤维蛋白平板的牛津杯小孔内，37°C培养6h，游标卡尺测量水解圈的两垂直直径。参照尿激酶标准曲线的方程计算待测样品的纤溶活性为114. 98U/mL。每升蛹虫草发酵液对应的纤溶酶活力为114. 98U/mLX (5mL/100 μ L) X IOmL = 57490U ;结果如图I所示。实施例2
8
如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2. Omg/mL，然后继续培养144h。经检测计算，每毫升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为93. 27U，即每升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为93270U ;结果如图I所示。实施例3 如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2. 5mg/mL,然后继续培养144h。经检测计算，每毫升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为81. 32U，即每升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为81320U ;结果如图I所示。实施例4如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为3. Omg/mL,然后继续培养144h。经检测计算，每毫升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为82. 02U,即每升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为82020U ;结果如图I所示。实施例5 如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为3. 5mg/mL,然后继续培养144h。经检测计算，每毫升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为77. 75U，即每升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为77750U ;结果如图I所示。实施例6 如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，发酵所用的蛹虫草(Cordyc印s militaris)菌种保藏号为CGMCC No. 3. 4655，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2. Omg/mL,然后继续培养144h。经检测计算，每毫升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为89. 84U，即每升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为89840U。对比例I如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，所述步骤(2)中用不含扩张蛋白的酸性缓冲液替代实施例加入的扩张蛋白溶液，温度25°C的条件下，液体发酵培养168h。经检测计算，每毫升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为34. 66U，即每升蛹虫草发酵液的纤溶酶成分活力为34660U ;结果如图I所示。
权利要求
1.一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将蛹虫草菌种接种到ro液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数 10 15%的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为温度20 250C，摇床培养24 72h，得种子液；(2)将步骤(I)制得种子液按5 15%的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度 20 25°C的条件下，液体发酵培养20 30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.O 3. 5mg/mL，然后继续培养120 168h，分离去除蛹虫草菌丝体得纤溶酶发酵上清液；(3)从步骤(2)制得的纤溶酶发酵上清液中提取蛹虫草胞外纤溶酶，即得蛹虫草纤溶酶。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 160r/min，温度20 25°C，暗培养活化24 72h。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的种子发酵培养基，每升组分如下3g 葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0.03g CaCl2、0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6mm的玻璃珠。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、3g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0.03g CaCl2,0. 3 g KH2P04、0. 3 gK2HP04。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I.5 3.5mg/mL ;进一步优选的,扩张蛋白的浓度为I. 5 3. Omg/mL ;最优选的,所述步骤⑵中， 扩张蛋白的浓度为2. Omg/mL。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液按照如下方法制备将蚕豆或黄瓜种子经O. 05 O. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水冲洗5 7h，栽入湿蛭石，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗上胚轴或根系4 5cm，置_20°C预冷I 2h，加预冷至O 4°C的匀浆缓冲液匀浆后，用孔径60 80 μ m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液， O 4°C下提取24 30h,过滤，按O. 3 O. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24 30h，4°C条件下 25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液经20000g离心5 lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为25mmol/L4-羟乙基哌嗪乙横酸，3mmol/LNa2S205, lmmol/LEDTA, O. lwt% Triton X-100, pH 7. 0 ;所述提取液组分为25mmol/L 4-轻乙基哌嗪乙磺酸，I. 0mmol/L乙二胺四乙酸,3mmol/L Na2S2O5, 0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性缓冲液配制是将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节 pH至4. 0，水定容至1L。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤⑵中所述的分离是在4°C12000r/min 条件下离心分离10 15min。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取蛹虫草胞外纤溶酶的方法，步骤如下在0°c条件下，向步骤(2)制得的纤溶酶发酵上清液中按O. 14g/mL的添加量添加研磨后的(NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，(TC静置沉淀 4 8h去除杂蛋白，4 12000rpm离心IOmin,弃沉淀,按O. 51g/mL的添加量将研磨后的硫酸铵加入上清液，静置4 8h ;4°C条件下，12000rpm离心lOmin，弃上清液，沉淀溶解于磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中；用截留分子量为3000Da的透析袋透析，然后用截留分子量为 3000Da的透析膜进行超滤浓缩，除去小分子的蛋白质，即得蛹虫草胞外纤溶酶。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制方法是将O. 69g磷酸二氢钠、O. 012g柠檬酸溶于蒸馏水中，定容至lL，pH 8.0。
全文摘要
本发明涉及一种利用蛹虫草的液体发酵生产纤溶酶的方法，(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；(2)将种子液按5～15％的体积比接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养20～30h，然后加入扩张蛋白溶液，继续培养120～168h，分离去除蛹虫草菌丝体得纤溶酶发酵上清液；(3)从纤溶酶发酵上清液中提取蛹虫草胞外纤溶酶，即得蛹虫草纤溶酶。本发明将植物扩张蛋白和优化后的发酵方法应用于蛹虫草纤溶酶的液体发酵生产，大幅度提高了虫草纤溶酶的液体发酵产量，使产量达到每升发酵液93270U，是传统发酵生产方法产量的2.69倍以上，具有极好的工业化应用前景。
文档编号C12N9/68GK102604919SQ201210111230
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者万鲁长, 任海霞, 任鹏飞, 单洪涛, 姚强, 孙涛, 宫志远, 李瑾, 王 琦, 韩建东, 高能 申请人:山东省农业科学院农业资源与环境研究所