专利名称：一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法，属于生物发酵工程技术领域。
背景技术：
蛹虫草Cordyceps militaris是虫菌结合的药用真菌，是子囊菌亚门 Ascomycota、肉座菌目 Hypocreales、麦角菌科 Clavicipitaceae、虫草属 Cordyceps 的模式种，又名北冬虫夏草、北蛹虫草等，为现代珍稀中草药，其所含的药用成分和多种药效可与传统名药——冬虫夏草相媲美，其中的虫草酸是主要的生理活性物质，有抗自由基、抗氧化的性质。而且，虫草酸含量的高低被作为衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的虫草的药用价值高。试验测定，冬虫夏草含虫草酸成分约为7%，而蛹虫草中的虫草酸活性成分含量要明显高于冬虫夏草，使其应用价值得到人们的广泛关注。药理学研究表明，虫草酸具有促进人体新陈代谢，改善人体微循环系统，明显降低血脂，抑制细菌，增强对疾病的抵抗力等作用，以及镇咳、祛痰、平喘的功效。虫草的增强免疫功可使肝脏的解毒作用增强，抗肝组织纤维化，抗脂质过氧化，能够有效保护肝细胞，同时可预防和治疗脑血栓、 脑出血、心肌梗塞、长期衰竭等。由于对蛹虫草虫草酸等活性成分的需求增长迅速，野生蛹虫草资源被疯狂采摘而日益稀少昂贵，通过化学合成其活性成分的途径工艺复杂且产量极低，因此其广泛应用受到药源资源的严重制约。研究发现，通过液体发酵生产与从蛹虫草子实体、菌丝体中直接提取得到的虫草酸等活性成分在生化结构、生理作用上基本是相同的，而且具有培养周期短、 生产流程易控制、活性物质易于提取等优点，虫草酸等活性物质的提取含量及效率都要远高于利用人工栽培虫草进行生产和提取。但是目前的蛹虫草及虫草酸等活性成分的生产仍是以传统的固体栽培为主，液体培养研究和应用由于发展时间短，许多发酵技术和工艺仍不成熟，整体产量和发酵水平较低，限制了其工业化生产的发展。扩张蛋白是在植物细胞壁中发现的一类新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白几乎参与了植物的整个发育过程除具有增大细胞的功能外，扩张蛋白在细胞生长、种子萌发、根毛形成、根系生长、叶原基形成、叶子生长发育、果实成熟、器官脱离，以及花粉管生长方面起着重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验表明扩张蛋白是一类细胞壁酶蛋白，能够通过打断细胞壁多聚物之间的氢键诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛，进而可能还是在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸过程中的一个重要调控因子。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于食药用菌蛹虫草的液体发酵进行虫草酸等次生代谢产物的生产，国内外目前均未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白进行蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法。本发明技术方案如下一种利用蛹虫草的液体发酵生产虫草酸的方法，包括如下步骤(I)将蛹虫草菌种接种到H)液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10 15%的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为温度 20 25°C，摇床培养24 72h，得种子液；(2)将步骤(I)制得种子液按5 15%的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20 25°C的条件下，液体发酵培养20 30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为O. 5 2. 5mg/mL，然后继续培养96 144h，分离，得到蛹虫草菌丝体；(3)从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内虫草酸，即得虫草酸。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的ro液体发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至1000mL。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 160r/ min，温度20 25 °C，暗培养活化24 72h。根据本发明优选的，所述步骤(I)中的种子发酵培养基，每升组分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6_的玻璃珠。经种子发酵培养基培养后，菌球数量可提高60%以上、菌球直径缩小40%以上，菌丝松散均匀。根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3g KH2PO4' 0. 3g K2HPO4。根据本发明优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I. O 2. 5mg/mL ;进一步优选I. 8 2. Omg/mL。最优选的,所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I. 5mg/mL。所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液可参照现有技术制备,如采用McQueen-Mason等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall ext ension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 中的记载的方法制备；也可以按照如下方法制备扩张蛋白溶液将蚕豆或黄瓜种子经0. 05 0. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水冲洗5 7h，栽入湿蛭石，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗上胚轴或根系4 5cm，置_20°C预冷I 2h，加预冷至O 4°C的匀浆缓冲液匀浆后，用孔径60 80 μ m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液，O 4°C下提取24 30h，过滤，按0. 3 0. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加 (NH4)2SO4,添加(NH4)2SO4过程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24 30h， 4°C条件下25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心5 lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。上述扩张蛋白溶液制备方法中，所述匀浆缓冲液组分为25mmol/LHEPES(4-羟乙基哌嗪乙横酸)，3mmol/L Na2S2O5, Immol /T, EDTA, 0. Iwt % Triton X-100, pH 7. 0 ;所述提取液组分为25mmol/L 4-轻乙基哌嗪乙磺酸，I. 0mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸)，3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl，pH 6. 8 ;所述酸性缓冲液配制是将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节PH至4. 0，水定容至1L。
根据本发明优选的，步骤(2)中所述的分离是在4°C 12000r/min条件下离心分离
5 IOmin0根据本发明优选的，所述步骤(3)中提取蛹虫草虫草酸活性成分的方法，步骤如下将步骤⑵制得的蛹虫草菌丝体65°C烘干I 3h，研成粉末，取O. Ig蛹虫草菌丝体粉末加20mL体积浓度为50%的乙醇溶液，以500W的功率微波处理lmin，然后12000r/ min离心5min，取上清液，沉淀中加入20mL体积浓度为50%的乙醇溶液，按前述步骤微波处理并离心，合并上清液，制得虫草酸。本发明与已有技术相比有如下优点I、本发明将扩张蛋白应用于蛹虫草的虫草酸液体发酵生产,产量可达2. 621g/L, 是对照(对比例I)虫草酸发酵产量的7. 3倍以上；本发明大大提高了整体蛹虫草的虫草酸有效成分的产量，具有很好的工业化应用前景；2、本发明采用液体好氧发酵方法，一般为5 7天，相对于现有技术，产量高，周期短，无需静置培养及诱导合成产物等过程，生产效率较高，所生产的蛹虫草的虫草酸活性成分可直接用于免疫力调节、降脂保肝、降血糖等药物的制备；3、本发明所述扩张蛋白可从大多数双子叶和单子叶植物中提取，来源广泛，成本较低，本发明的制备方法经优化后步骤也相对简单，产量高，可规模提取生产，对蛹虫草虫草酸类活性物质的发酵生产具有很好的促进和提升效果；4、本发明所采用的蛹虫草液体发酵工艺简单，环保无毒，原材料成本低廉，而且全发酵过程可控，不受外部环境条件限制，适合工业化生产及推广应用。5、本发明对液体发酵培养基和种子发酵培养基的配方进行了优化，能够大幅度提高蛹虫草的虫草酸活性成分的产量。
图I是不同浓度的扩张蛋白溶液对蛹虫草的虫草酸产量的影响曲线；
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细说明，但本发明所保护范围不限于此。原料及培养基实施例中所述的蛹虫草(Cordyceps militaris)发酵菌种，菌种保藏号为CGMCC No. 5. 701和CGMCC No. 3. 4655，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。实施例中的甘露醇、鼠李糖、乙酸胺、乙酰丙酮均购自济南盛伟生物科技有限公司；实施例中所述的扩张蛋白溶液的制备步骤如下将蚕豆(Vicia faba L.;购自济南茂丰种苗有限公司)或黄瓜(Cucumis sativus L. CV. Jinnian No. 6 ;购自济南伟丽种业有限公司)种子经O. 15wt% HgCl2消毒6min,流水冲洗6h，栽入湿蛭石中，27°C暗培养4d。剪取幼苗上胚轴4 5cm，即生长区约100g， 置-20°C冰箱预冷lh，加预冷至4°C的匀浆缓冲液，高速匀浆后，用70 μ m尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置2h，得静置液；向静置液中加入提取液，4°C下提取24h，过滤，滤液按O. 4g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24h，4°C条件下 25000g离心5min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C条件下用截留分子量为3000Da的聚偏氟乙烯(PVDF)透析袋(购自北京博润莱特科技有限公司)透析，透析液经20000g离心5min， 取上清液即为制备的扩张蛋白溶液，置4°C下保存。其他未描述步骤可参照McQueen-Mason 等在 McQueen-Mason S J, Durachko D M, Cosgrove D J. Two endogenous proteins that induce cell wall extension in plants. Plant Cell, 1992,4 :1425 1433 以及https:// homes, bio. psu. edu/expansins/ProtocoIs/Extraction. htm 中的描述进行。上述匀浆缓冲液组分为25mmol/LHERES (4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，3mmol/ LNa2S2O5, Immol /T, EDTA, O. Iwt% Triton X-100, pH 7. 0 ；上述提取液组分为25mmol/LHERES, I. OmmoI/L EDTA(乙二胺四乙酸)，3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaCl, pH 6. 8 ；所述酸性缓冲液每升按如下方法配制将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4. 0，水定容至1L。扩张蛋白溶液浓度的测定方法采用考马斯亮蓝法检测，具体可参照(《精编蛋白质科学实验指南》，ISBN:703018086，出版日期1900-1-1)中记载的考马斯亮蓝法进行操作， 以牛血清白蛋白作标准曲线，经检测上述扩张蛋白溶液中扩张蛋白浓度为O. 33g/mL。实施例中所述的ro液体发酵培养基，每升组分如下马铃薯200g、葡萄糖20g,蒸懼水定容至lOOOmL。实施例中所述的种子发酵培养基，每升组分如下3g葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0. 03g CaCl2,0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6mm的玻璃珠。实施例中所述的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0. 03g CaCl2,0. 3g KH2PO4'
0.3g/L K2HPO4。实施例I :一种利用扩张蛋白提高蛹虫草的虫草酸产量的液体发酵方法，包括如下步骤(I)将蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种，菌种编号为 CGMCC No. 5. 701,接种到ro液体发酵培养基中，进行活化培养，在温度25°C、摇床转速150r/min的条件下暗培养 48h，然后按体积百分数15 %的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为 温度25°C，摇床培养48h，得种子液；(2)将步骤⑴制得种子液按15%体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25°C 的条件下，液体发酵培养24h，然后加入扩张蛋白溶液,使扩张蛋白的浓度为I. 0mg/mL，然后继续培养120h, 12000r/min条件下离心分离IOmin,去发酵上清液得到蛹虫草菌丝体；(3)从步骤⑵制得的蛹虫草菌丝体中提取虫草酸，步骤如下将步骤(2)由IL发酵液制得的蛹虫草菌丝体65°C烘干I 3h，得4. 072g蛹虫草菌丝，研成粉末，取0. Ig蛹虫草菌丝体粉末加20mL体积浓度为50%的乙醇溶液，以500W的功率微波处理lmin，然后12000r/min离心5min，取上清液，沉淀中继续加入20mL体积浓度为50%的乙醇溶液，按前述步骤微波处理并离心，合并上清液，制得虫草酸。
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虫草酸待测样品的制备取上述步骤制得的虫草酸，用体积浓度为50%的乙醇溶液定容至50mL。虫草酸活性成分的测定采用本领域常规的高碘酸钠比色法测定(参照温鲁，尹起范，唐玉玲等.蛹虫草与有关虫草活性成份检测比较[J].食品科学，2004，25 (8) =155-157)(I)标准曲线的建立以甘露醇为基准的标准曲线制作称取105°C干燥2h并冷却至室温的甘露醇粉末，配成5mg/mL的标准溶液。精确吸取甘露醇标准溶液0mL、0. lmL、0. 2mL、0. 3 mL、0. 4mL、
0.5mL、0. 6mL、0. 7mL、0. 8mL、0. 9mL置试管中，分别加蒸懼水水至I. OmL,然后加ImL 15mM的高碘酸钠试液(3. 2g高碘酸钠溶于蒸馏水中，加10. 2mL浓盐酸，蒸馏水定容至1L)混匀，室温放置IOmin,加2mL O. Iwt %鼠李糖，4mL新配制的Nash试液(称取乙酸胺150g,蒸懼水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，摇匀，置于53°C水浴中保温15min。用分光光度计在420nm下测定反应溶液的吸光度值，以甘露醇含量(mg/mL)为横坐标，吸光度值 A4m为纵坐标,绘制得到标准曲线。(2)虫草酸活性成分产量的检测取虫草酸待测样品500yL于试管中，用蒸馏水定容至l.OmL，摇匀。空白对照为
1.OmL水。然后加ImL 15mM的高碘酸钠试液(3. 2g高碘酸钠溶于蒸馏水中，加10. 2mL浓盐酸，蒸懼水定容至1L)混勻，室温放置IOmin,加2mL O. I %鼠李糖,4mL新配制的Nash试液(称取乙酸胺150g，蒸馏水溶解，加入2mL冰醋酸，2mL乙酰丙酮，定容至1L)，摇匀，置于 53°C水浴中保温15min。用分光光度计在420nm下测定反应溶液的吸光度值。根据标准曲线计算虫草酸待测样品中虫草酸含量为237. 23 μ g。每升发酵液对应菌丝体的虫草酸产量为237. 23 μ gX IOOX 10X4. 072 =
O.966g;结果如图I所示。实施例2 如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为I. 5mg/mL,然后继续培养120h。经检测计算，每克菌丝体(干重)中含有虫草酸271. 55mg,即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有2. 621g蛹虫草虫草酸。结果如图I所示。实施例3 如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2. Omg/mL，然后继续培养120h。经检测计算，每克菌丝体(干重)中含有虫草酸257. 07mg,即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有2. 097g蛹虫草虫草酸。结果如图I所示。实施例4如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，步骤(2)中在温度25°C的条件下，加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为2. 5mg/mL,然后继续培养120h。经检测计算，每克菌丝体(干重)中含有虫草酸252. 39mg,即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有1.949g蛹虫草虫草酸。结果如图I所示。对比例I
如实施例I所述的液体发酵方法，不同之处在于，所述步骤(2)中用不含扩张蛋白的酸性缓冲液替代实施例加入的扩张蛋白溶液，温度25°C的条件下，液体发酵培养144h。经检测计算，每克菌丝体(干重)中含有虫草酸175. 25mg,即对应每升发酵液产生的菌丝体中含有O. 356g蛹虫草虫草酸。结果如图I所示。
权利要求
1.一种利用蛹虫草的液体发酵生产虫草酸的方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将蛹虫草菌种接种到ro液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数 10 15%的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为温度20 250C，摇床培养24 72h，得种子液；(2)将步骤(I)制得种子液按5 15%的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度 20 25°C的条件下，液体发酵培养20 30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为 O. 5 2. 5mg/mL，然后继续培养96 144h，分离，得到蛹虫草菌丝体；(3)从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内虫草酸，即得虫草酸。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的活化培养条件为摇床转速100 160r/min，温度20 25°C，暗培养活化24 72h。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的种子发酵培养基，每升组分如下3g 葡萄糖、2. 5g酵母粉上清液、O. Ig MgS04、0.03g CaCl2、0. Ig ΚΗ2Ρ04、0· IgK2HPO4, 2 5颗直径3 6mm的玻璃珠。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下3g 乳糖、2g 糖蜜、2g 豆柏粉、3g 蛋白胨，O. 2g MgS04、0.03g CaCl2,0. 3g KH2PO4'O. 3g K2HPO4。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I.O 2. 5mg/mL。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为I.8 2.Omg/mL ;最优选的,所述步骤⑵中，扩张蛋白的浓度为I. 5mg/mL。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液按照如下方法制备将蚕豆或黄瓜种子经O. 05 O. 15wt% HgCl2消毒4 6min，流水冲洗5 7h，栽入湿蛭石，25 28°C暗培养4 6天；剪取幼苗上胚轴或根系4 5cm，置_20°C预冷I 2h，加预冷至O 4°C的匀浆缓冲液匀浆后，用孔径60 80 μ m的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置I 3h，得静置液；向静置液中加入提取液， O 4°C下提取24 30h,过滤，按O. 3 O. 5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH4)2SO4, 添加(NH4)2SO4S程中不断搅拌，防止(NH4)2SO4局部过饱和，然后静置24 30h，4°C条件下 25000g离心5 IOmin,沉淀用酸性缓冲液复溶，4°C下分子量3000Da的透析袋透析,透析液经20000g离心5 lOmin，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为25mmol/L4-羟乙基哌嗪乙横酸，3mmol/L Na2S2O5, lmmol/L 乙二胺四乙酸，O. Iwt % Triton Χ-100, ρΗ7· O ; 所述提取液组分为25mmol/L 4-轻乙基哌嗪乙磺酸，I. Ommol/L乙二胺四乙酸,3mmol/L Na2S2O5,0. 5mol/L NaGl，pH 6. 8 ;所述酸性缓冲液配制是将2. 05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节PH至4. 0，水定容至1L。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的分离是在4°C12000r/ min条件下离心分离5 lOmin。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取蛹虫草虫草酸活性成分的方法，步骤如下将步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体65°C烘干I 3h，研成粉末，取O. Ig蛹虫草菌丝体粉末加20mL体积浓度为50%的乙醇溶液，以500W的功率微波处理lmin，然后12000r/min离心5min，取上清液，沉淀中加入20mL体积浓度为50%的乙醇溶液，按前述步骤微波处理并离心，合并上清液，制得虫草酸。
全文摘要
本发明涉及一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法，(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，得种子液；(2)将种子液接种于液体发酵培养基中，液体发酵培养20～30h，然后加入扩张蛋白溶液，继续培养96～144h，分离，得到蛹虫草菌丝体；(3)从蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内虫草酸，即得虫草酸。本发明将扩张蛋白应用于蛹虫草的虫草酸液体发酵生产，产量可达2.621g/L，是对照虫草酸发酵产量的7.3倍以上；具有很好的工业化应用前景。
文档编号C12P7/18GK102605005SQ20121011151
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月16日 优先权日2012年4月16日
发明者万鲁长, 任鹏飞, 单洪涛, 姚强, 孙涛, 宫志远, 李瑾, 王 琦, 赵军胜, 韩建东, 高能 申请人:山东省农业科学院农业资源与环境研究所