一株灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产漆酶和β-葡聚糖的方法

专利名称：一株灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产漆酶和β-葡聚糖的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株高产漆酶和β-葡聚糖的菌株，特别涉及一种漆酶与灰树花β-葡聚糖联产的菌株和生产方法。
背景技术：
灰树花(Grifola frondosa)又名贝叶多孔菌，俗称栗子蘑，在分类学上属于担子菌亚门、多孔菌科、多孔菌属。长期以来人们对灰树花进行的大量研究主要集中在多糖方面，而对其产酶特性的研究极少。1883年，日本学者吉田首次从日本紫胶漆树漆液中发现一种可催化漆固化过程的
蛋白质。1894年，Bertrand将这种蛋白质命名为漆酶(Laccase)。漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的作用底物，不仅能氧化多种芳香族化合物，还能降解木质素、去除许多有毒酚类物质的毒性，还可以使多种染料脱色及去除有机废水的毒性。近年来在造纸、环保、食品等领域有了广泛的应用。我国最早研究漆酶的是刘国智、黄葆同等，他们于20世纪50年代末利用漆酶在催化反应中需要消耗氧气的特性，设计了漆酶酶活的测定方法。但直到20世纪80年代末，国内对漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的测定、漆酶表观特性的描述性研究上。专利CN201010289892. 3公开了一种利用密孔菌属菌株以豆柏(或硝酸钠)为氮源、以麦芽糖(或葡萄糖、果糖、纤维二糖)等为碳源发酵生产漆酶的方法；专利CN200810198678. X公开了一种产漆酶的灵芝菌株，该灵芝菌是韦伯灵芝TZCl (Ganodermaweberianum TZC1),它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 2648 ;赵玉良等报道了一种利用灰树花发酵制备漆酶的方法，其所用菌株购自上海食用菌研究所，为灰树花子实体栽培菌株，液体培养采用葡萄糖天冬酰胺培养基，260C下，摇瓶液体培养10天，发酵液中的酶活达到最高值，期间采用I. 5%浓度的木质素进行产酶诱导。所产漆酶采用30%的硫酸铵沉淀回收。上述漆酶制备方法中，仅仅是利用灰树花菌株发酵制备漆酶，通过硫酸铵沉淀获得粗酶，未涉及如何利用灰树花发酵菌丝体，由于发酵的目标产物和发酵时间不同，使得菌丝体内的多糖构成和多糖的含量均与现有的不同。以葡聚糖为目标产品时，发酵周期仅为48-96h，而以漆酶为目标产物时，发酵周期长达196-240h,此时菌丝体老化，或者易发生自溶而消亡，或者多糖开始变化，水溶多糖减少，有生物活性的β_葡聚糖大量损失。菌丝体一般被当做废弃物低价出售，不及时处理时，会因腐烂造成环境污染。另外，在漆酶的分离过程中，使用了高浓度的硫酸铵作为沉淀剂，分离漆酶之后的发酵液成为高浓度含盐废水，虽然含有大量的N元素，但由于含S元素过高，不能直接作为肥料使用，需耗费大量资金进行处理才能够达标排放。且以硫酸铵作为沉淀剂，实际上是实验室中作为分离蛋白质的常用方法，不适于工业化应用。因此该方法无法应用于实际生产中，缺乏使用价值。发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一株的灰树花菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo. 1709，该菌株可以用于生产漆酶。发明人发现其发酵菌丝体中含有大量β_葡聚糖，故该菌株可用于β_葡聚糖的生产。 此外，发明人还发现经过适当调整后在灰树花的发酵液中，含有大量漆酶活性的蛋白，因此可利用该菌株作为漆酶的产生菌。利用该菌株发酵生产漆酶，发酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌丝体中β -葡聚糖含量高，达到漆酶与灰树花水溶性β -葡聚糖联产，适合工业化生产。
本发明首先获得了一株灰树花菌株，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No. 1709，发明人进一步发现通过调整发酵工艺，该菌株既可产生漆酶，又可产生葡聚糖。
该菌株可以应用于常规生产，特别是可以应用于漆酶及灰树花葡聚糖的生产，该生产过程主要包括灰树花液体发酵、固液分离、漆酶分离提取、β -葡聚糖分离提取等步骤。在灰树花的发酵过程中应用了漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序。
所述的漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序具体步骤如下
Α.诱导因子筛选
从漆酶可以作用的底物、菌株发酵过程所需的生长因子、酶系的调控三个方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或灰树花生长因子或漆酶底物；
B.诱导因子使用方法
含特定金属离子的盐、特定生长因子及漆酶底物添加入培养基中用于调控菌丝体细胞内酶系；
C.发酵控制
首先用普通浓度的碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳源、氮源，并始终使碳源浓度维持在相对较低但较稳定的浓度水平上，通过不断补料把菌体维持在生长状态，从而提闻漆酶的广率。
其中所述诱导因子中的特定金属离子选自含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物；生长因子选自B族维生素；底物选自愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等中的一种或几种混合物。
之所以选择上述的物质作为诱导因子，主要是由于漆酶是含铜离子的酶系，它的底物主要是愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等富含木素等物质，发明人经过研究后发现针对本发明所述的菌株而言，要使其产生漆酶，诱导调控的方法主要通过三种方式1、添加底物，如愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等富含木素等物质；2、补充生物生长必须的营养因子，如B族维生素等；3、补充菌体中各种酶系的辅酶离子，主要选择自特定金属离子，一般可以采用其可溶性金属盐的形式，发明人发现通过上述三种方式的诱导，结合对于发酵过程的碳源和氮源浓度调整及参数条件控制，可以实现胶漆酶产量的提高。在灰树花产酶发酵的过程中，首先用正常浓度的碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳、氮源，并始终使碳源浓度维持在相对较低但较稳定的浓度水平上，通过不断补料把菌体维持在生长状态，从而提闻漆酶的广率。
整个生产工艺的具体生产步骤如下CN 102972213 A书明说3/9页
(I)灰树花液体发酵
A.斜面菌种活化；
B.液体摇瓶种子制备；
C.诱导产酶的液体发酵培养基制备；
D.发酵菌种活化后，经液体发酵扩繁种子菌悬液，再利用液体深层发酵方法生产得到发酵液；
发酵的具体过程为，将液体种子以2-10% (v/v)的接种量接到液体发酵培养基中， 初始还原糖浓度为18. 26mg/mL，26°C培养72h，流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w) 的氮源，控制发酵液还原糖在O. 5-2mg/mL水平,氨基氮在100_500mg/L之间，同时控制代谢过程的pH在5. 0-6. 5之间，共培养120-240h ;经上述工艺发酵后，漆酶发酵水平达到500U/ HlL以上；
在上述液体发酵培养基制备时，除培养基正常组成成分外，发明人还加入上述的产酶诱导因子，如一定量含特定金属离子的盐，可以是含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物；或者加入漆酶的底物，如愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等中的一种或几种混合物；或者在培养基灭菌后加入B族维生素的一种或几种；上述诱导因子的加入，再加上流加碳源物质和氮源物质控制还原糖和氨基氮水平， 两个作用积累，使漆酶发酵水平较现有技术提高了 5-10倍。
上述发酵过程中，液体发酵培养基中加入的产酶诱导剂中，所筛选出的金属离子对β -葡聚糖的产量影响不大，而加入发明人筛选出的漆酶底物虽然会稍微延长葡聚糖积累的时间，但对β -葡聚糖产量影响不大，而选用的灰树花生长因子B组维生素会促进菌丝体的产量提高，进而提高葡聚糖的产量，可见本发明发明人筛选添加的诱导因子对于 β-葡聚糖的生产并没有造成不利影响，实现了与漆酶生产的共存；而菌丝体中积累葡聚糖的过程和菌丝体向胞外分泌漆酶的过程在时间上有一个差异。菌丝体生长过程中，有限积累β -葡聚糖，在48-96h之间达到高峰，然后增长缓慢，并逐渐处于平稳状态；而漆酶的产生在72-240h之间达到最高峰，之后开始下降。可见，在同时以葡聚糖和漆酶作为目标产物时，由于控制了发酵培养基中的还原糖水平和氨基氮水平始终保持一个较低而平稳的水平，虽然整个培养时间的加长会会使β-葡聚糖产生的时间延长，但不会使β-葡聚糖的产量下降反而会有所上升，同时保证了漆酶的产量。因而从总体经济产量来看，总的产品收益要高于单一产品的收益的总和。总体来说，本发明所筛选的产酶诱导因子在发酵过程中的加入不会影响葡聚糖的产量，更不会抑制葡聚糖的产生。此外，由于葡聚糖属于灰树花细胞壁成分，经诱导后，会使胞内蛋白溶出，从而提高β_葡聚糖的纯度， 反而更加有利于葡聚糖的纯化。
(2)漆酶提取分离和纯化步骤
Α.发酵液预处理调整发酵液pH值6-8，固液分离；固体菌丝做提取灰树花水溶性β-葡聚糖使用；
B.膜分离固液分离后的发酵液采用孔径O. 1-0. 5 μ m的膜微滤，澄清液用2-6KD 的超滤膜浓缩，得到2-5wt%的漆酶浓缩液，添加保护剂，混合均匀后干燥；
C.干燥进风温度180_260°C、出风温度60_90°C的条件下，将加入保护剂的浓缩液喷雾干燥，得到漆酶产品；
其中保护剂可以是玉米淀粉、糊精、可溶性玉米淀粉中的一种或几种混合物；(3)灰树花β -葡聚糖的提取分离和纯化步骤如下Α.干燥粉碎将上述发酵的菌丝体经固液分离后，菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉；B.水提菌丝粉加入10-30 (w/w)倍质量的水提取，提取温度80_140°C，提取时间O. 5-2h，提取次数1-2次，经固液分离后，得到固形物I，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物；C.碱提向水处理所得固形物I中加入氢氧化钠溶液，加入的氢氧化钠溶液体积为固形物I体积的10-30倍(v/v)，氢氧化钠溶液浓度为4%-12% (w/v)，处理温度为80-90°C，搅拌反应时间lh，提取1-2次；碱提取后所得清液用乙酸中和，中和时，控制清液的PH范围为5. 0-6. 0，离心，得到清液，沉淀经处理用于饲料加工； D.脱盐碱提后的清液采用孔径O. 1-0. 5 μ m的微滤膜过滤，澄清液再用6KD的超滤膜脱盐；E.酶解脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度l_2wt%，调整pH值在7. 5-8. 5，添加O. 01-0. 1% (w/v)的蛋白酶在50-60°C的条件下，酶解2_4h，100°C灭活IOmin ；所述蛋白酶可以是中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的一种或几种混合物。F.浓缩、干燥酶解液采用孔径O. 1-0. 5 μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，喷雾干燥条件进风温度180-260°C、出风温度60-90°C的条件下干燥，得到水溶性灰树花葡聚糖。更为具体的过程如下(I)灰树花液体发酵Α.菌种活化将4°C条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20-25 °C)活化 4-8h ；B.液体种子制备在无菌操作台上，用IOmL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，I支试管菌种接种I个三角瓶，振荡培养24-48h制备得到种子液；C.发酵在液体发酵培养基中添加占培养基总重量O. 01-0. 05%的含特定金属离子的盐，如含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物，及占培养基总重量O. 005-0. 02%的生长因子，如维生素B6、B12等，以及占培养基总重量O. 1-5%的底物，如愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等富含木素等物质；生长因子将液体种子以5-10% (v/v)的接种量在无菌条件下接到已灭菌的液体发酵培养基中，26°C培养72h,流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源，控制发酵液还原糖在O. 5_2mg/mL水平，氨基氮在100-500mg/L之间，同时控制代谢过程的pH在5. 0-6. 5之间，共培养120-240h。发酵终止时，发酵液中的酶活为506U/mL，发酵液中的多糖含量为I. 2g/L，菌丝体中的β -葡聚糖含量为60g/kg (干基计)；(2)漆酶提取分离和纯化步骤A.发酵液预处理调整发酵液pH值6-8，固液分离；固体菌丝做提取灰树花水溶性β -葡聚糖使用；预处理结束时，酶活为458U/mL ；
B.膜分离固液分离后的发酵液采用孔径O. 1-0. 5 μ m的膜微滤，澄清液用2-6KD 的超滤膜浓缩，得到2-5wt%的漆酶浓缩液，添加保护剂，保护剂可以是玉米淀粉、糊精、 可溶性玉米淀粉中的一种或几种混合物，混合均匀后干燥；浓缩结束时，浓缩液的酶活为 2085U/mL ；
C.干燥进风温度180_260°C、出风温度60_90°C的条件下，将加入保护剂的浓缩液喷雾干燥，得到漆酶产品。该产品的酶活为34300U/g。
(3)灰树花β -葡聚糖的提取分离和纯化步骤如下
Α.干燥粉碎将上述发酵的菌丝体经固液分离后，菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉；
B.水提菌丝粉加入15-30 (w/w)倍质量的水提取，提取温度90_140°C，提取时间l_2h，提取次数1-2次，经固液分离后，得到固形物I，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物；
C.碱提向水处理所得固形物I中加入碱溶液，加入的碱溶液体积为沉淀I体积的10-30倍，碱溶液浓度为4%-12%(w/v)，处理温度为80-90°C，搅拌反应时间lh，提取1_2 次，碱提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH范围为5. 0-6. 0，离心，得到清液；
D.脱盐清液采用孔径O. 1-0. 5 μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜脱盐；
E.酶解脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度l_2wt%，调整pH值在7. 5-8. 5， 添加O. 01-0. I (w/v)的蛋白酶在50-60°C的条件下，酶解2_4h，100°C灭活IOmin ；
F.浓缩、干燥酶解液采用孔径O. 1-0. 5 μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，喷雾干燥条件进风温度180-260°C、出风温度60-90°C的条件下干燥， 得到水溶性灰树花β-葡聚糖；
其中，在发酵过程中，灰树花菌株产漆酶的条件通过如下方法确定
(I)采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量、装液量和培养时间，确定液体种子最佳培养条件和液体发酵最佳培养条件；
(2)采用单因子试验和正交试验，通过改变培养基的碳氮源和无机盐种类，确定该菌株液体种子最佳培养基组成和液体发酵的最佳培养基组成。
经过上述单因子试验和正交试验确定了该菌株液体种子培养基组成及发酵条件如下
液体种子培养基组成，按重量份计(w/w)为马铃薯1%，酵母浸粉O. 15%，麸皮2%， 葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸镁O. 1%，磷酸二氢钾O. 05%,加水至IOOOmL ;灭菌条件为 121。。，O. 15Mpa 灭菌 30min ；
液体种子培养条件接种量为每个三角瓶接种I支菌株斜面培养物,pH值自然，培养温度24°C 28°C，摇床转速75-200r/min，培养时间为24 48h ；
经过上述单因子试验和正交试验所获得菌株液体发酵培养基组成和发酵条件如下
液体培养基组成，按重量份计(w/w)为马铃薯1%，愈创木酚O. 1%，酵母浸粉 O. 15%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸镁O. 1%，硫酸铜O. 02%,磷酸二氢钾O. 05%,加水至IOOOmL ;灭菌条件为121。。，O. 15Mpa灭菌30min ；
利用本发明所获菌株生产漆酶联产灰树花β -葡聚糖具有以下优点
I.采用灰树花菌株发酵生产漆酶，由于采用诱导产酶技术，不仅不影响葡聚糖的产量还有所增加，在菌丝体细胞内蛋白质溶出的同时，使细胞壁β_葡聚糖相对含量增加，减少了杂蛋白的量，有利于β_葡聚糖的提取纯化；2.整个工艺漆酶发酵水平达到500U/mL，产品酶活10000U/g以上，高于市售产品标准；3.生产菌株为灰树花,是一种传统习用的药食两用真菌,利用该菌株生产漆酶的同时，所得副产物灰树花菌丝体也是一种食用真菌，具有较高的附加值；4.该工艺生产漆酶的同时生产灰树花β-葡聚糖,达到漆酶与灰树花β-葡聚糖联产的目的，降低漆酶生产成本的同时，也降低了灰树花β_葡聚糖的成本；综上所述，本发明提供了一株产漆酶的灰树花菌株和利用灰树花生产漆酶联产灰树花β -葡聚糖的工艺，该菌株可应用于生产漆酶，发酵水平500U/mL，产品酶活10000U/g以上；灰树花β -葡聚糖含量> 75wt%，满足欧盟水溶性β -葡聚糖标准。保藏信息保藏时间2006年5月11日保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心保藏编号CGMCCNo. 1709保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所分类命名灰树花，GrifolaFrondosa
具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号为CGMCCNo. 1709的菌种。实施例I(I)菌种活化将4°C条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液体种子制备在无菌操作台上，用IOmL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，无菌条件下冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，I支试管菌种接种I个三角瓶，PH值自然，培养温度24°C，摇床转速200r/min，培养时间为48h ；种子培养基组成(w/w)为按重量计(w/w)为马铃薯1%，酵母浸粉0. 15%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨0. 3%，硫酸镁O. 1%，磷酸二氢钾O. 05%,加水至IOOOmL ；灭菌条件为121°C，0. 15Mpa灭菌30min ；(3)发酵、调控过程将液体种子以10% (v/v)的接种量接到液体发酵培养基中，搅拌转速175r/min，26°C培养48h，同时流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源，其中所述的碳源选自葡萄糖，所述的氮源选自的酵母浸粉，从而使还原糖和氨基氮稳定在一个较低而平稳的水平上，其中控制发酵液还原糖在1.5mg/m L左右的水平，氨基氮在200mg/L的水平，流加时间控制24h，总共培养196h ；液体发酵培养基组成，按重量计(w/w)为马铃薯1%，酵母浸粉0. 15%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸镁O. 1%，硫酸铜O. 02%,磷酸二氢钾O. 05%,加水至 10OOmT,；
在上述液体发酵培养基中，添加愈创木酚O. 1% (w/w)，作为产酶诱导因子，之后灭菌，灭菌条件为121°C，O. 15Mpa灭菌30min ；
(4)漆酶提取分离取4L发酵液，经检测漆酶酶活550U/mL，调整发酵液pH值7， 4000r/min离心lOmin，固体菌丝做提取灰树花水溶性β -葡聚糖使用；发酵液采用孔径 O. Iym的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，得到浓缩液526mL，添加52. 6g可溶性玉米淀粉，经喷雾干燥，得到漆酶66. 8g，经检测，漆酶酶活达到18600U/g。
(5)灰树花β -葡聚糖的提取分离
将菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉65g ;菌丝粉加入I. 3L的水提取，提取温度120°C，提取时间lh，提取次数2次，经固液分离后，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物14. 5g ;向水处理所得沉淀物I中加入I. 31L4%的碱溶液，处理温度为80°C，搅拌反应时间lh，提取2次。碱提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH 范围为6. O，离心，得到清液。采用孔径0.1 μπι的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜脱盐。脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度2wt%，调整pH值在8. 5，添加O. I (w/v)的碱性蛋白酶在60°C的条件下，酶解4h，100°C灭活IOmin ;酶解液采用孔径O. I μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，得到水溶性灰树花β -葡聚糖2. 7g，经检测多糖含量 81. 6wt%。
实施例2
漆酶的提取制备
取IOL发酵液，经检测漆酶酶活512U/mL，调整发酵液pH值6. 5，4000r/min离心 IOmin,固体菌丝做提取灰树花水溶性β -葡聚糖使用；发酵液采用孔径O. I μ m的膜微滤， 澄清液用6KD的超滤膜浓缩，得到浓缩液482mL，添加48. 2g玉米淀粉，经喷雾干燥，得到漆酶59. 2g，经检测，漆酶酶活达到42200U/g。
实施例3
灰树花β -葡聚糖的提取分离
将菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉168g ;菌丝粉加入3. 36L的水提取，提取温度100°C，提取时间lh，提取次数2次，经固液分离后，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物34. 5g ；向水处理所得沉淀物I中加入3. 36L8%的碱溶液，处理温度为80°C，搅拌反应时间lh，提取2次。碱提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH 范围为6. O，离心，得到清液。采用孔径O. I μπι的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜脱盐。脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度I. 2wt%，调整pH值在8. O，添加O. I (w/v)的碱性蛋白酶在60°C的条件下，酶解4h，100°C灭活IOmin ;酶解液采用孔径O. I μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，得到水溶性灰树花β -葡聚糖6. 5g，经检测多糖含量 84. 2wt%。
实施例4
漆酶提取分离
取5L发酵液，经检测漆酶酶活510U/mL，调整发酵液pH值7，4000r/min离心 IOmin,固体菌丝做提取灰树花水溶性β -葡聚糖使用；发酵液采用孔径O. I μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，得到浓缩液336mL，添加33. 6g可溶性玉米淀粉，经喷雾干燥，得到漆酶36. 8g，经检测，漆酶酶活达到21900U/g。实施例5灰树花葡聚糖的提取分离将菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉78g ;菌丝粉加入I. OL的水提取，提取温度90°C，提取时间lh，提取次数2次，经固液分离后，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物15. 5g ;向水处理所得沉淀物I中加入1L10%的碱溶液，处理温度为90°C，搅拌反应时间lh，提取2次。碱提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH范围为6.0，离心，得到清液。采用孔径O. I μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜脱盐。脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度lwt%，调整pH值在8. 5，添加O. I (w/v)的碱性蛋白酶在60°C的条件下，酶解4h，100°C灭活IOmin ;酶解液采用孔径O. I μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，得到水溶性灰树花β-葡聚糖3. 12g，经检测多糖含量82. lwt%。实施例6(I)菌种活化将4°C条件下保存在PDA培养基上的试管斜面菌种移至室温条件下(20-25 °C)活化 4h ；(2)液体种子制备在无菌操作台上，用IOmL灭菌后的蒸馏水将经过活化的试管斜面菌种制成菌体悬浮液，无菌条件下冲洗入装有灭菌种子培养基的三角瓶中，I支试管菌种接种I个三角瓶，PH值自然，培养温度24°C，摇床转速200r/min，培养时间为48h ；种子培养基组成(w/w)为按重量计(w/w)为马铃薯1%，酵母浸粉O. 15%，麸皮2%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 3%，硫酸镁O. 1%，磷酸二氢钾O. 05%,加水至IOOOmL ；灭菌条件为121 °C，O. 15Mpa灭菌30min ；(3)发酵、调控过程将液体种子以10% (v/v)的接种量接到液体发酵培养基中，搅拌转速200r/min，26°C培养48h，同时流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源，其中所述的碳源选自乳糖，所述的氮源选自的硫酸铵，从而使还原糖和氨基氮稳定在一个较低而平稳的水平上，流加时间控制24h，控制发酵液还原糖在I. 2mg/mL左右水平，氨基氮在400mg/L，同时控制代谢过程的pH在5. 0-5. 5之间，共培养240h。液体发酵培养基组成，按重量计(w/w)为马铃薯1%，酵母浸粉O. 2%，麸皮1%，葡萄糖2%，玉米粉O. 5%，蛋白胨O. 15%，硫酸镁O. 1%，硫酸铜O. 02%,磷酸二氢钾O. 05%,加水至10OOmT,;灭菌条件为 121。。，O. 15Mpa 灭菌 30min ；灭菌完成后，添加入O. 01%过滤除菌后的维生素BI作为诱导因子。(4)漆酶提取分离取IOL发酵液，经检测漆酶酶活525U/mL，调整发酵液pH值7，4000r/min离心lOmin，固体菌丝做提取灰树花水溶性β -葡聚糖使用；发酵液采用孔径O. 22 um的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，得到浓缩液475mL，添加50g可溶性玉米淀粉，经喷雾干燥，得到漆酶63. 5g，经检测，漆酶酶活达到37600U/g。(5)灰树花β -葡聚糖的提取分离将菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉120g ;菌丝粉加入I. 8L的水提取，提取温度100°c，提取时间2h，提取次数2次，经固液分离后，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物36. 5g ；向水处理所得沉淀物I中加入3. 6L10%的碱溶液，处理温度为70°C，搅拌反应时间2h，提取2次。碱提取后所得清液用乙酸中和，中和后清液的PH范围为6. 5，离心，得到清液。采用孔径O. 22 μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜脱盐。脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度2wt%，调整pH值在8. 0，添加O. 05 (w/v)的碱性蛋白酶在50°C的条件下，酶解4h，100°C灭活IOmin ;酶解液采用孔径O. 22 μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，得到水溶性灰树花β -葡聚糖5. 2g，经检测多糖含量 83. 9wt%0
权利要求
1.一株灰树花菌株，保藏号为CGMCC No. 1709，其用于生产漆酶的用途。
2.一种利用权利要求I所述菌株生产漆酶和β_葡聚糖的方法，其特征在于包括灰树花发酵及漆酶提取分离和β -葡聚糖提取分离等步骤，在漆酶的发酵过程中应用漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序 所述的漆酶产生过程的诱导和积累过程的诱导工序具体步骤如下 Α.诱导因子筛选 从漆酶可以作用的底物、菌株发酵过程所需的生长因子、酶系的调控三个方面筛选诱导因子，诱导因子选自含特定金属离子的盐或生长因子或漆酶底物； B.诱导因子使用方法 将酶系调控所需的含特定金属离子的盐、特定生长因子及漆酶底物加入培养基中用于调控细胞内酶系； C.发酵控制 首先用正常浓度的碳源使菌体生长，进入生产期后再陆续补加碳、氮源，通过不断补料把菌体维持在生长状态，从而提闻漆酶的广率。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于所述诱导因子中的特定金属离子选自含钙离子或镁离子或铜离子或锌离子或钴离子或锰离子中的一种或几种盐的混合物；生长因子选自B族维生素；底物选自愈创木酚、木素、木屑、小麦秸杆等中的一种或几种混合物。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于具体步骤如下 (O灰树花液体发酵 Α.斜面菌种活化； B.液体摇瓶种子制备； C.诱导产酶的液体发酵培养基制备； D.发酵菌种活化后，经液体发酵扩繁种子菌悬液，再利用液体深层发酵方法生产得到发酵液； 其中发酵过程具体为将液体种子以2-10% (ν/ν)的接种量接到含有诱导因子的液体发酵培养基中，初始还原糖浓度为18. 26mg/mL，26°C培养72h，流加10-40% (v/w)的碳源及10-20% (v/w)的氮源,控制发酵液还原糖在O. 5-2mg/mL水平,氨基氮在100_500mg/L之间，同时控制代谢过程的pH在5. 0-6. 5之间，共培养120-240h ;经上述工艺发酵后，漆酶发酵水平达到500U/mL以上； (2)漆酶提取分离和纯化步骤 A.发酵液预处理调整上步发酵液pH值6-8，固液分离；固体菌丝做提取灰树花水溶性β-葡聚糖使用； B.膜分离固液分离后的发酵液采用孔径O.1-0. 5μπι的膜微滤，澄清液用2-6KD的超滤膜浓缩，得到2-5wt%的漆酶浓缩液，添加保护剂，混合均匀后干燥； C.干燥进风温度180-260°C、出风温度60-90°C的条件下，将加入保护剂的浓缩液喷雾干燥，得到漆酶产品； (3)灰树花β-葡聚糖的提取分离和纯化步骤如下 Α.干燥粉碎将上述发酵的菌丝体经固液分离后，菌丝体干燥、粉碎，得到灰树花菌丝粉；B.水提菌丝粉加入10-30(w/w)倍质量的水提取，提取温度80-140°C，提取时间O.5-2h，提取次数1-2次，经固液分离后，得到固形物I，合并提取液，经减压浓缩后，经喷雾干燥，得到灰树花提取物； C.碱提向水处理所得固形物I中加入氢氧化钠溶液，加入的氢氧化钠溶液体积为固形物I体积的10-30倍(v/v)，氢氧化钠溶液浓度为4%-12%(w/v)，处理温度为80_90°C，搅拌反应时间lh，提取1-2次；碱提取后所得清液用乙酸中和，中和时，控制清液的PH范围为5.0-6. 0，离心，得到清液，沉淀经处理用于饲料加工； D.脱盐碱提后的清液采用孔径O.1-0. 5 μ m的微滤膜过滤，澄清液再用6KD的超滤膜脱盐； E.酶解脱盐后的清液，用去离子水调整多糖浓度l_2wt%，调整pH值在7.5-8. 5，添加O.01-0. 1% (w/v)的蛋白酶在50-60°C的条件下，酶解2_4h，100°C灭活IOmin ； F.浓缩、干燥酶解液采用孔径O.1-0. 5 μ m的膜微滤，澄清液用6KD的超滤膜浓缩，然后喷雾干燥，喷雾干燥条件进风温度180-260°C、出风温度60-90°C的条件下干燥，得到水溶性灰树花β -葡聚糖。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述的保护剂为玉米淀粉、糊精、可溶性玉米淀粉中的一种或几种混合物。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述的蛋白酶为中性蛋白酶或碱性蛋白酶或其混合物。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于所述的碳源物质为葡萄糖或蔗糖或淀粉中的一种或几种的混合物；所述的氮源物质蛋白胨或酵母浸粉或酵母粉或玉米浆中的一种或几种的混合物。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产漆酶的灰树花菌株及利用该菌株进行液体发酵联产β-葡聚糖和漆酶的方法。本发明所涉及的生产菌株为灰树花(Grifolafrondosa)，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.1709。利用该菌株通过液体发酵、固液分离、超滤浓缩、干燥等步骤生产漆酶，同时，以发酵菌丝体为原料经热水提取、冷碱提取、热碱提取、中和、离心、超滤脱盐浓缩、干燥等过程生产β-葡聚糖。该菌株发酵周期短，漆酶酶活水平高，且菌丝体中β-葡聚糖含量高，达到漆酶与灰树花水溶性β-葡聚糖联产，适合工业化生产。
文档编号C08B37/02GK102972213SQ20121058658
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者栾波, 徐泽平, 高洪奎, 刘辛, 王丽霞 申请人:黄河三角洲京博化工研究院有限公司