取代的哌嗪-1,4-二酰胺类化合物在制备治疗和/或预防衰老的药中的应用

取代的哌嗪-1,4-二酰胺类化合物在制备治疗和/或预防衰老的药中的应用
【专利摘要】本发明涉及取代的哌嗪?1,4?二酰胺类化合物在制药中的应用。取代的哌嗪?1,4?二酰胺类化合物可作为SIRT1的激活剂，激动核受体LXRα和LXRβ，调节靶蛋白ABCA1/G1的表达，促进脂质和胆固醇外排，调节炎症关键蛋白p65的表达、调节衰老相关基因p66shc等的表达，发挥对胆固醇代谢、炎症相关以及衰老基因或蛋白的调节作用，用于治疗心脑血管疾病、调节血脂、抗动脉粥样硬化病症、抗炎症反应以及抗衰老疾病。
【专利说明】取代的脈瞎-1，4-二醜胺类化合物在制备治疗和/或预防衰老 的药中的应用
[0001 ]本申请是申请号为201410224804.X、发明名称为"取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合 物在制药中的应用"的专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明设及取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物的用途，尤其设及在制备治疗和/或 预防衰老的药中的应用。
【背景技术】
[0003] 遗传因素、饮食和老龄化对于体内胆固醇和脂肪的内稳态均有一定的影响。越来 越多的研究表明，通过热量限制（calorie res化iction,CR)降低甘油Ξ醋、总胆固醇和低 密度脂蛋白胆固醇，增加高密度脂蛋白胆固醇，可W延缓衰老，降低屯、血管疾病的发病率。 CR是唯一被科学界普遍公认的一种能够在酵母、蠕虫、果蛹W及哺乳类动物中延长寿命的 调控手段。据报道，CR是通过调节沉默信息调节因子2(silent information regulator 2, Sir2)信号通路来发挥作用的，并具有抗动脉粥样硬化、抗炎、抗衰老、氧化应激、抗调亡、调 节能量代谢、屯、脑血管保护、血脂调节等作用。
[0004] Sir2是一类首先在酵母菌中发现的通过染色体沉默机制和细胞能量代谢机制调 节细胞寿命的重要基因，具有组蛋白去乙酷化酶活性，与多种细胞的衰老密切相关。哺乳动 物Siruins家族共包括7个蛋白，分别命名为SIRT1-7,其中SIRT1和酵母Sir2同源性最高，目 前也被研究最多。它一方面通过修饰组蛋白，去乙酷化化K26、H3K9和H4K16,维持染色质处 于沉默状态和基因组稳定；另一方面通过去乙酷化众多非组蛋白，参与调控细胞的能量代 谢、增殖、调亡、衰老和肿瘤发生。SIRT1的去乙酷化底物有p53蛋白、叉头转录因子 (forkhead-0-box transcription factors ,F0X0s)、过氧化物酶增殖激活受体丫共激活因 子-1口（peroxisome-proliferated activated receptor c coactivator,PGC-1口）、固酉享调 节元件结合蛋白（sterol regulatoiT element binding protein,SREBP-lc)W及肝X受 体（liver X receptor,LXR)等。
[0005] LXRs是核受体家族中的一员，受配体激活时，能够促进胆固醇的逆向转运，促进胆 汁内胆固醇的分泌，抑制肠内胆固醇的吸收，在维持细胞内和机体胆固醇稳态中具有十分 重要的意义，在胆固醇逆转运过程中发挥着极其重要的作用。所谓胆固醇逆转运，即：将胆 固醇转运至肝脏，由肝脏代谢或W胆汁的形式排出，该过程是防止过量的胆固醇在周围组 织蓄积的一个重要生理过程。文献报道，SIRT1与LXRs相互作用并使其发生去乙酷化化XRa 的43 2位赖氨酸、LX祕的43 3位赖氨酸)而激活，调节LXRs下游祀基因的表达，在SIRT1基因缺 失小鼠体内，胆固醇含量显著升高。
[0006] SIRT1对屯、血管疾病的发生发展具有一定的保护作用。最早研究发现，SIRT1-方 面去乙酷化血管内皮细胞中的一氧化氮合酶(eNOS)，活化eNOS抑制血管紧张素受体AT1;另 一方面，抑制血管内皮细胞的衰老，延缓动脉粥样硬化的发生。随后研究发现，SIRT1通过去 乙酷化用，活化LXRs和FXR(fa;rnesoid X rec巧tor)调节脂类和胆固醇代谢，促进高密度脂 蛋白与胆固醇结合，减少胆固醇沉积，调节血脂水平，影响动脉粥样硬化的形成。此外， SIRT1还可W抑制血管紧张素受体AT1的表达，预防屯、脏的病理肥大。SIRT1能够调节肝脏糖 类代谢和脂肪代谢。在短期禁食小鼠肝脏中，敲除SIRT1基因会导致肝脏脂肪酸β氧化基因 的表达降低。
[0007] 一系列体内外的实验证实，SIRT1对炎症基因表达及组织炎性损伤具有显著的抑 制效应。在SIRT1基因敲除的小鼠 RAW264.7巨隧细胞，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)诱 导的核因子KB(nuclear factorKB，NF-KB)激活及TNF-a、化-1β、化-6等多种促炎细胞因子 的表达显著增高。越来越多研究表明，动脉粥样硬化斑块中不仅含有脂质，而且有大量炎症 细胞浸润，W血管壁积聚大量的单核细胞和淋己细胞为特征，运提示炎症在介导动脉粥样 硬化发生、发展过程中的地位，也体现了 SIRT1、动脉粥样硬化W及炎症之间的内在联系与 重要作用。
[000引式1是已知的在赃嗦-1,4-二酷胺类化合物表达式
[0009]
[0010] 上述式1的赃嗦-1,4-二酷胺中R1和R2可W分别是表1所示的取代基。

【发明内容】

[0011] 本发明的目的是提供取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物的新用途，即在制药中的 应用。
[0012] 具体地，本发明设及取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物作为制备治疗和/或预防动 脉粥样硬化疾病的药中的应用。
[0013] 设及取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物作为制备治疗和/或预防屯、脑血管疾病的 药中的应用。
[0014] 设及取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物在制备治疗和/或预防调节血脂的药中的 应用。
[0015] 设及取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物在制备治疗和/或预防炎症反应的药中的 应用。
[0016] 设及取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物在制备治疗和/或预防衰老的药中的应用。
[0017] 本发明的取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物可W其本身给药，或者W药物组合物 的形式给药。本发明的药用组合物包括有效剂量的本发明化合物或其可药用盐W及一种或 多种生理学上接受的可药用载体。
[0018] 本发明的药物组合物可按常规方式配制，使用一种或多种生理学上可接受的载 体、赋形剂和助剂，有利于将活性化合物加工成可药用制剂。适当的制剂取决于所选择的给 药途径，可W按照本领域熟知的方法进行制备。
[0019] 本发明的取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物或其药用盐可W通过各种给药途径或 方式释放至患者。适合的给药途径包括但不限于吸入、透皮、口服、直肠、经粘膜、肠内和肠 胃外给药，肠胃外给药包括肌内、皮下和静脉内注射。
【附图说明】
[0020] 图1是白襲芦醇在SIRT1激活剂筛选模型上激活活性量效曲线。
[0021] 图2是小分子化合物抗动脉粥样硬化、抗炎、抗衰老、调血脂的作用示意图。
[0022] 图3是化合物（I)胞内去乙酷化功能活性验证。其中，图3中a为化合物（I)作用后 U20S细胞内p53和Ac-p53的蛋白印迹图；图3中b为蛋白灰度定量图。
[0023] 图4是化合物（I)与SIRT1蛋白分子间相互作用，具体是E123与SIRTI-N-CC-C蛋白 相互作用传感图。
[0024] 图5是化合物（I)对LXRs去乙酷化程度的影响。其中，图5中a为化合物（I)作用后 HepG2细胞内乙酷化LXRs (具体为LXRa、LXRi3)的蛋白印迹图；图5中b为蛋白灰度定量图。
[002引图6是化合物（I)激动LXRs活性量效曲线。
[0026] 图7是化合物(I)调节ABCA1启动子转录活性。
[0027] 图8是化合物（I)调节RAW264.7细胞中ABCA1和ABCG1蛋白表达。其中，图8中a为化 合物(I)作用后RAW264.7细胞内ABCA1和ABCG1的蛋白印迹图；图8中b为蛋白灰度定量图。 [00%]图9是化合物（I)调节化pG2细胞内ABCG5/G8蛋白。其中，图9中a为化合物（I)作用 后HepG2细胞内ABCG5和ABCG8的蛋白印迹图；图9中b为ABCG5蛋白灰度定量图；图9中C为 ABCG8蛋白灰度定量图）
[0029] 图10是化合物（I)促进RAW264.7细胞胆固醇外排。其中，图10中a为化合物（I)促进 RAW264.7细胞内皿L介导的胆固醇外排；图10中b为化合物（I)促进RAW264.7细胞内Apo-AI 介导的胆固醇外排。
[0030] 图11是化合物（I)抑制巨隧细胞泡沫化油红0染色镜检照片。其中，a是空白细胞 (不加 Ox-LDL);b是溶剂对照（80μg/ml Ox-LDL); C是ΙΟμΜ化合物（I )+80μg/ml Ox-LDL;d是 阳性对照（ΙΟμΜ 9CRA+80μg/ml Ox-LDL)。
[0031 ]图12是化合物(I)对RAW264.7胞内总胆固醇含量的影响。
[0032] 图13是化合物（I)抑制炎症关键蛋白p65的表达。其中，图13中a为化合物（I)作用 后THP-1细胞内p65的蛋白印迹图；图13中b为蛋白灰度定量图。
[0033] 图14是化合物（I)对apoE^/^小鼠主动脉全长中斑块的影响。主动脉全长油红染色 结果显示，化合物（I)明显减少apoE^/^小鼠主动脉硬化斑块的形成，减少胆固醇和脂质聚 积。其中a是空白组(普通饲料）；b是模型组(高脂饮食）；c是化合物（I)20mg/kg(高脂饮食）。
[0034] 图15是化合物（I)对apoE-/-小鼠屯、脏流出道的影响。屯、脏流出道的油红染色结果 显示化合物（I)能明显减少apoE^/^小鼠屯、脏流出道中斑块的面积和数量，减少胆固醇和脂 质聚积。其中，a是空白组(普通饲料）；b是高脂饮食模型组;C是化合物（I)20mg/kg(高脂饮 食)。
[0035] 图16是化合物（I)对C57化/6小鼠主动脉衰老相关基因 p66shc、PAI-1、p21的mRNA 表达影响。
【具体实施方式】
[0036] 为了更清楚地理解本发明的实质，我们首先对取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物 激活SIRTl的活性进行测定，结果见表1。从表1中可W看出，取代的赃嗦-1，4-二酷胺类化合 物具有不同程度的激活SIRT1的活性。下面W标号巧123Γ的取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化 合物(简称为化合物（I))的病理试验和结果来深入说明取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物 在制药中的应用。
[0037] 首先，借助大肠杆菌表达系统成功获得目的蛋白SIRT1。基于均相时间分辨巧光技 术，利用有活性的蛋白建立高通量SIRT1激活剂筛选模型，模型优化后，利用已知公认的阳 性药白襲芦醇对模型进行验证，ECso值与文献报道相符，见图1，表明所表达的蛋白是高活性 的目的蛋白，并且筛选模型是可信的。对组合化合物库（国家新药(微生物)筛选实验室)进 行活性物质筛选，获得数个活性化合物，并测定所有化合物对SIRT1蛋白的激活作用。选择 代表性活性化合物（I)进行了进一步的活性研究，在细胞水平上证实了化合物（I)能够使得 SIRT1蛋白的祀蛋白p53的去乙酷化程度增加，确实是SIRT1蛋白的激活剂。在表面等离子共 振实验中测得了化合物（I)与蛋白SIRT1之间的Kd值为9.61μΜ。最后，对化合物（I)进行了分 子药理学方面的研究，发现化合物（I)能够使LXRs的去乙酷化程度增加，激动核受体LXRa和 LXRi3，调节祀蛋白ABCA1 /G1的表达，促进胞内胆固醇外排，抑制巨隧细胞泡沫化，上调 ABCG5/G8表达，促进胆固醇分泌。探讨了化合物(I)对泡沫细胞内炎症因子相关代谢通路的 作用，发现其能够抑制炎症转录因子NF-kB关键蛋白p65的表达。研究了化合物（I)对小鼠 主动脉衰老相关基因表达的影响，发现其能够抑审虹66shc、PAI-l、p21的mRNA表达。
[0038] 因此，W化合物（I)为代表的取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物可作为SIRT1的激 活剂，发挥对胆固醇代谢、炎症、衰老相关疾病的基因的调节作用(见图2)，可用于动脉粥样 硬化、炎症、衰老、屯、脑血管等疾病预防和/或治疗。
[0039] 实施例1.取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物对SIRT1激活活性的测定
[0040] 1)蛋白表达
[0041 ]首先，从质粒PCDNA3.1-SIRT1 (中国医学科学院基础医学研究所刘德培教授课题 组馈赠)扩增获得了人SIRT1的催化域及包含N端、C端部分序列的cDNA，与克隆载体地lunt- Simple Vector连接测序正确后，与大肠杆菌表达载体祀T-30a( + )连接，构建的重组表达质 粒命名为pET-SIRTl，转化大肠杆菌表达宿主化21 (DE3)，挑取单克隆，测序鉴定。将测序正 确的单菌落摇瓶培养，在OD600值为0.6-0.別寸，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳 糖巧（1?了6)，15°(：，200巧111，培养24}1后收集菌液。用超声波破碎菌体后12,000巧111离屯、 30min。收集上清，经0.45μΜ滤膜过滤。采用iilCTAexplorer系统进行蛋白纯化工作，使用 1ml预装柱化sTrapFF crud作为纯化介质。其原理是目的蛋白通过其N端的化s-tag与柱中 的化elating Sepharose?上的Ni2+离子藝合，进而吸附在柱子上，而其他杂蛋白因不能与 Ni2+离子藝合，直接随上样缓冲液流出柱子，再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，从而得到高纯 度的目的蛋白SIRT1。
[0042] 2)化合物对SIRT1激活活性的测定
[0043] 本活性测定采用Cisbio公司人SIRT1激活剂筛选试剂盒进行化合物活性的测定。
[0044] 测定原理：
[0045] 检测体系如下：重组人SIRT1蛋白，底物subs化ate-d2为巧光基团d2标记的p53小 肤片段，NA护为SIRT1发挥酶活性必须的辅因子，anti-acetyl-ciTptate是Eu2+标记的穴状 化合物。若加入的化合物对酶有激活作用，底物去乙酷化程度增加，底物与cryptate之间的 距离变远，不足w产生共振能量转移，表现为巧光读数降低。
[0046] 测定方法：
[0047] (1)在Reaction buffer中加入终浓度为ImM的DTT，配制成linzymatic buffer。
[004引 （2)用Enzymatic buffer依次稀释重组蛋白、底物substrate-d2W及辅酶NA护，使 其终浓度分别为0.5mUAU、6nM、ISOiiM。
[0049] (3)用化zymatic buffer稀释化合物至一定的浓度。
[0050] (4)依次加入化1待测化合物、2μ1ΝΑ0+、4μ1底物至384孔板，最后加入化1重组蛋 白，启动酶促反应。设置不加蛋白的No en巧me组W及不加化合物的化gative con化〇1组， 每组3个平行孔。
[0化1] (5)室溫解育120min。
[0化2] (6)加入10μ1终浓度为7.5nM的Anti-acetyl-cryptate，室溫解育化或过夜，用酶 标仪测定巧光值化X: 340nm，血:665/615nm)。
[0053] (7)计算方法：
[0化4] Ratio: (665nm/615nm)Xl〇4
[0化5]底物去乙酷化比率（％):100-(Rati〇Sample/Rati〇N。enzyme X 100)
[0化6] 上调率（％ )=去乙酷化比率Sample/去乙酷化比率Negative con付。iX 100%
[0057] 若上调率大于等于150%视为初筛阳性，进行下一步的复筛和量效曲线测定。
[0058] 读取巧光读数，根据公式计算后，W化合物浓度的对数值作为横坐标，底物的去乙 酷化程度为纵坐标，用GraphPad Prism软件拟合曲线，得ECso值及最大上调率，结果见表1。
[0059] 该测定结果说明本发明中取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物对SIRT1具有显著的 去乙酷化激活作用。其中，活性最好的化合物（I)最大上调率为384.09 %，ECso值为0.43ιχΜ。 由于SIRT1在参与胆固醇代谢和脂肪酸、糖类代谢等生理过程中具有重要意义，因此该结果 说明本发明中的取代的赃嗦-1,4-二酷胺类化合物能够通过激活SIRT1在调控设及相关生 理过程的疾病中发挥作用。
[0060] 实施例2.细胞的培养
[0061 ] HepG2、ABCAl-LUC Η邱G2、U20SW及皿Κ293细胞均为贴壁细胞，约4她传代一次。 待细胞长满后，弃旧培养基，用PBS漂洗细胞后弃掉，加适量膜酶，在室溫下消化细胞约 2min，弃消化液，立即加入含10%FBS的培养基，W抑制膜蛋白酶活力，用弯头吸管反复轻轻 吹打培养瓶内细胞，使细胞完全脱离瓶底且吹打使之分散为单个细胞悬液。再按1:3比例接 种细胞悬液于新的细胞瓶内，或弃去适量细胞悬液，然后补加适量完全培养基，放入培养箱 继续培养。培养条件:37 °C，5 % C〇2。
[0062] 小鼠单核巨隧细胞RAW264.7为半贴壁细胞，约4她传代一次。膜酶消化5min，按1: 4-1:6比例传代，使用DMEM完全培养基。培养条件:37 °C，5 % C〇2。
[0063] 人急性单核细胞白血病细胞THP-1为悬浮细胞，约4她传代一次。待细胞密度为(3- 5) X106个/ml时，用弯头吸管吹打培养瓶内细胞，使之分散为单个细胞悬液。再按1:4比例 接种细胞悬液于新的细胞瓶内，或弃去适量细胞悬液，然后补加适量完全培养基，放入培养 箱继续培养。培养条件:37 °C，5 % C〇2。
[0064] 实施例3.化合物（I)对多柔比星诱导的人骨肉瘤U20S细胞中乙酷化p53蛋白表达 水平的影响。
[0(?日]1)化合物处理细胞:预先将人骨肉瘤细胞U20S用含10%FBS的McCoy's 5a培养基 W每孔3 X 105个细胞接种于6孔板中，37°C，5%C02条件下培养至对数期。待细胞完全贴壁 后，吸取细胞液，换为空白McCoy ' S 5a培养基，加入终浓度为扣Μ的盐酸多柔比星(D0X)，10μ Μ的SIRT1特异性抑制剂EX-527 W及终浓度分别为0.1、1、ΙΟμΜ的阳性化合物，37°C，5%C02 条件下解育化。
[0066] 2)蛋白的制备:6h后，弃去培养基，用预冷的PBS漂洗细胞2次，膜酶消化后用培养 基收集细胞，SOOrpm离屯、3min，再用PBS悬浮细胞，SOOrpm离屯、3min。每管分别加入52μ1的 RIPA细胞裂解液(每1ml裂解液中加入终浓度为l(K)μg/ml的PMSF)，于冰上裂解细胞30minD4 °C，12000 Xg离屯、20min。收集上清，用BCA蛋白质定量试剂盒(Thermo公司）对蛋白进行定 量，用dd此明尋各组蛋白样品浓度调整为化g/μL。加入一定量的5X蛋白上样缓冲液，于沸水 浴中煮lOmin，冷却后短暂离屯、，每孔上样40yg蛋白进行SDS-PAGE电泳。剩余样品于-80 °C保 存。
[0067] 3)Western blot方法测定蛋白水平:SDS-PAGE电泳后，将聚丙締酷胺凝胶和转膜 滤纸放入转移缓冲液中浸泡平衡5min"PVDF膜先浸入甲醇20s活化，再用水洗，置于转移缓 冲液中浸泡平衡2min。用BioRad半干法转膜仪转膜，设置电流5mA/cm2，恒流转膜30min。转 膜结束后，根据目的蛋白的大小分别剪开后放入含5% (W/V)脱脂奶粉的1XTBST中室溫解 育化。封闭结束，用含5% (W/V)脱脂奶粉的IX TBST稀释一抗，置于杂交袋中，室溫解育化 后，4°C解育过夜。用1XTBST洗Ξ次，每次lOmin。之后用含5%(W/V)脱脂奶粉的1XTBST稀 释相应二抗，置于杂交袋中，室溫解育化。从杂交袋中取出PVDF膜，用1 X TBST洗Ξ次，每次 lOmin。显色:在膜的正面，即转有蛋白的一面加入适量增强型HRP(辣根过氧化物酶)底物化 学发光液化化)A、B液的混合液(按1:1比例现用现配），立即置于凝胶成像仪中显色。
[0068] 4)显色结果，用ImageJ软件进行扫描，定量处理。结果见图3。
[0069] 多柔比星化oxorubicin，D0X)可诱导细胞发生DNA损伤，使得p53蛋白的382位赖氨 酸发生乙酷化。为了验证化合物在胞内的去乙酷化功能并且考察功能作用的发挥对SIRT1 的依赖性，加入SIRT1特异性抑制剂EX-527。随着化合物（I)浓度的升高，乙酷化p53蛋白的 表达量随浓度梯度明显降低，而细胞内总的p53蛋白的量没有明显变化，说明p53蛋白去乙 酷化程度增加了。加入SIRT1蛋白的特异性抑制剂EX-527，Ac-p53蛋白的表达量又增加了。 因而本发明阐述了化合物（I)对胞内SIRT1底物去乙酷化作用有明显的上调作用，并且运一 作用依赖于SIRT1。
[0070] 实施例4.化合物(I)与SIRT1蛋白的分子间相互作用力测定
[0071] 本测定体系中所用的缓冲液溶液组成为:皿阳S lOmmol/L，化C1 150mmol/L，DTT lmmol/L，NAD+lmmol/L，甘油 10% (V/V)，DMS0 2% (V/V)。缓冲液W及样品均由0.45皿滤膜 过滤，使用前超声去除气泡。由Biacore T200 System(GE Healthcare)仪器完成。
[0072] 测定方法：
[0073] 1)忍片表面的预处理:取出maintenance忍片，更换为CM5忍片，选择Prime，用缓冲 液冲洗忍片表面。选择Normalize，采用Biacore标准化试剂（BIA normalizing solution 70%)对CM5忍片进行标准化。使用两个忍片通道进行实验，对SIRTl蛋白包被所需要的pH 值条件进行摸索（immobilization pH-scouting for pre-concentration)。首先选择3.5< pH<pI ASIRTl)范围内的pH的醋酸钢溶液进行预富集，根据预富集结果，选择抑4.0醋酸钢 溶液稀释蛋白至50μg/ml，进行偶联。设置流速为ΙΟμΙ/min，结合时间为2min，最后W50mM的 NaO取中洗忍片表面20s去除残留的SIRT1蛋白。
[0074] 2)蛋白包被忍片表面:将抓C/NHS等体积混合，W ΙμL/min的流速进样lOmin，对CM5 忍片表面簇基进行活化。按照忍片表面预处理的摸索结果，选择pH值为4.0的醋酸钢溶液作 为缓冲液将SIRT1蛋白稀释至50μg/ml，设置流速为ΙΟμΙ/min，结合时间为20min，并通过氨 基偶联作用将其包被在CM5忍片的表面，设置目标偶联量为7000RU，同时设定一个空白通道 作为对照通道。进样结束后，加入乙醇胺，Wl〇yl/min的流速进样10min，W封闭忍片表面未 结合氨基的活性簇基位点，最终偶联结果为7056 RU。
[0075] 3)加入化合物（I)进行结合检测:对于SIRT1包被的CM5忍片，将不同浓度的化合物 (0、0.39、1.56、3.12、6.25、12.扣M)依次进样，使化合物W30μl/min的流速流经忍片表面， 结合时间设置为60s，解离时间为120s之后，摸索忍片表面的再生条件，发现化合物在一定 时间内可W完全自然解离。
[0076] 由图4,通过RU值的变化可见化合物（I)能够W剂量依赖的方式与人重组SIRT1结 合，Kd值为9.61μΜ。小分子与蛋白结合的Kd值一般为10-3至10-6Μ，因此，化合物（I)与蛋白 SIRT1之间具有很强的亲和力。
[0077] 实施例5.化合物(I)对LXRs去乙酷化程度的测定
[0078] 为了考察化合物对LXRs去乙酷化程度的影响，我们利用免疫共沉淀实验进行验 证。
[0079] 本实验采用化pG2细胞，将其铺于直径为90mm大培养皿中，待细胞完全贴壁后，分 别加入ΙΟμΜ的化合物（I)，设置溶剂对照孔，处理细胞20至2地。提取细胞核蛋白，分别与LXR 曰和LX祕抗体W及Protein A/G agarose beads共同在4°C条件解育地，洗涂beads,煮样，用 acetylated-Lys抗体来进行western blot检测。曝光后的膜用膜再生液按北京普利来基因 技术有限公司的实验步骤再生后，再用相应的LXI?s抗体检测。结果见图5。
[0080] 从图5可W看出，加入化合物（I)后，LXRa和LX祕的表达量基本恒定，乙酷化LX地的 表达量有一定程度的下降，然而，乙酷化LXRa的表达量下降显著，表明SIRT1激活剂化合物 (I)能够调节肝细胞中LXRa和LX祕的乙酷化水平。
[0081 ] 实施例6.化合物(I)对LXRs激动活性的测定
[0082]本活性测定采用LXRs的激动剂筛选模型进行化合物活性的测定。
[00削测定原理：
[0084]本检测的原理是，根据LXRs结构中的两个主要结构域:配体结合结构域化BD)和 DNA结合结构域(DBD)，W及酵母中转录因子GAL4具有核受体相似结构的特点，应用酵母双 杂交的原理，分别构建两个质粒:pBIND-LXRs质粒含有GAL4基因的D抓部分和LXRs的L抓结 构域，可W在受到配体激活时改变构象；另一个质粒是PGL4-GAL4，含有GAL4基因启动子区 域反应元件的巧光素酶报告基因 Luc。本发明将两个质粒共转染至肥K293细胞中，W研究化 合物对LXRs的激活作用。在该检测体系中，化合物如果能够激活LXRs,表达质粒表达的LXRs 蛋白构象发生改变，与报告质粒相结合，此时化合物组巧光素酶的表达活性高于未加化合 物的对照组;反之当化合物对LXRs无活性时，则LXRs蛋白构象不发生改变，不与报告质粒相 结合，那么化合物组巧光素酶的表达活性不产生变化。
[00化]测定方法：
[00化]1)在96孔板进行转染，转染前一天，皿K293细胞铺板，密度为1.5-3. ο X ΙΟ5个/ml 细胞。待肥K293细胞长至90%汇合并且其生长状态良好，按照25μ1/孔化ti-MEM培养基稀释 〇.5μ1 脂质体Lipofectamine ? 2000 Reagent,室溫解育5miru2扣1/孔Opti-MEM培养基稀 释200ng质粒DNA，包括PGL4-GAL4和pBIND-LXRa/β，后与稀释脂质体合并混匀，室溫解育 20min〇
[0087] 2)将合并后的DNA-脂质体复合物溶液按照每孔10化1加入MEM完全培养基，使培养 基与DNA-脂质体复合物充分混匀，此时将细胞板中的培养基吸去，将混合后的细胞培养 液-DNA-脂质体复合物溶液加到96孔板中，每孔15化1。将96孔板置于二氧化碳培养箱内37 Γ。
[0088] 3)培养化，吸出转染培养基，将化合物（I)从40μΜ的最高浓度开始，W 2倍浓度梯度 逐级稀释成8个浓度，同时阴性对照孔加入0.1%的DMS0,分别处理细胞，继续培养1她。
[0089] 4) 1化后，吸出96孔板每孔中的培养基。每孔加入15化1 PBS轻轻漂洗细胞，翻转96 孔板倒掉PBS并甩干。每孔中加入20μ1 1X(XLR细胞裂解液，37°C裂解细胞20-30min(根据 细胞数目多少确定时间），在显微镜下观察细胞是否完全裂解。将裂解液全部转移至巧光分 析用96孔不透明白板的相应孔内，注意裂解液尽量避免气泡，否则会使影响读数(如果使用 96孔透明底白板则不需要将裂解液转移）。
[0090] 5)在每孔中迅速加入50μ1巧光分析试剂(Promega公司），立即将分析白板放入酶 标仪中检测。
[0091] 6)用如下方程计算待测样品对巧光素酶活性的改变率：
[0092] 改变率（％)=A/BX100
[0093] 其中，A为加入待测样品后测定的细胞巧光素酶活性(RLU)，B为加入阴性对照样品 (DMS0)后测定的细胞巧光素酶活性(RLU)。改变率（％ )视为化合物对LXR的激动活性，用％ 百分比表示，或者用倍数表示均可。W化合物浓度的对数值作为横坐标，改变率为纵坐标， 用Gra地Pad Prism软件拟合曲线，结果见图6。
[0094] 该测定结果说明本发明中化合物（I)对LXRa/β具有显著的转录激活作用，并且得 到了化合物（I)在LXRa/β激动剂筛选模型上的量效关系曲线。从图6可W看出，化合物（I)W 剂量依赖性方式激动LXRa/β，对LXRa最大激动活性为188.14 %，ECsq值为0.65μΜ;对LX祕最 大激动活性为182.32%，EC5q值为0.0祉M。由于核受体LXR在参与胆固醇代谢和脂肪酸、糖类 代谢等生理过程汇中具有重要意义，因此该结果说明本发明中的化合物（I)能够通过激动 LXR的转录在调控设及相关生理过程的疾病中发挥作用。
[0095] 实施例7.化合物(I)对ABCA1启动子转录活性的测定
[0096] 本活性测定采用ABCA1上调剂筛选模型进行化合物活性的测定。
[0097] 测定原理：
[0098] 本检测的原理是，将在巧光素酶的报告基因上游克隆有ABCA1基因上游调控序列 的重组质粒PGL3-ABCA1与PCDNA3.1共转染至人肝癌细胞化pG2细胞，经G418筛选得到稳定 转染细胞株，命名为ABCA1-LUC HepG2细胞。通过加入化合物检测细胞巧光素酶的表达活性 的变化，可W看出化合物对ABCA1启动子转录活性的影响，进而判断出对ABCA1的上调率。
[0099] 测定方法：
[0100] 消化对数生长期的ABCA1-LUC HepG2细胞，用培养基稀释并细胞计数，W5X105 个/ml的密度接种至96孔板，每孔加入100μΙ单细胞悬液。6h后，待细胞充分贴壁，移去含血 清的培养基，用PBS轻轻漂洗细胞一次，每孔加入含不同化合物浓度的无血清RPMI-1640培 养基20化1，同时对照孔内加入相应浓度的DMS0。18-2地后移去培养基，按照实施例6中测定 方法(4)-(6)中所述的方法测定、计算并作图，结果见图7。
[0101] 化合物（I)W剂量依赖性地方式增加 ABCA1-LUC HepG2细胞巧光素酶活性。化合物 (I)上调ABCA1表达活性达最高值226.67%，其ECsq值为0.25μΜ。由于ABCA1在胆固醇逆转运 过程中具有重要意义，因此该结果说明本发明中的化合物（I)能够增强ABCA1启动子转录活 性，在设及相关生理过程的疾病中发挥作用。
[0102] 实施例8.化合物（I)在RAW264.7巨隧细胞中对ABCA1和ABCG1蛋白表达水平的影 响。
[0103] 1)化合物处理细胞:小鼠单核巨隧细胞RAW264.7W4X105个/ml接种于6孔板贴壁 后，用0.1、1和ΙΟμΜ的化合物（I)处理，W浓度为0.1 %DMS0作为阴性对照组，同时设置ΙΟμΜ 的化合物（I)+ΕΧ-527组，均在37°C，5%C02条件下培养20-2地。
[0104] 2)Western blot方法测定ABCA1和ABCG1蛋白表达水平，并用软件定量处理。结果 见图8。
[0105] ABCA1和ABCG1是LXR直接调控的祀蛋白，二者在巨隧细胞中的主要功能都是将细 胞内多余的胆固醇外排，促进胆固醇逆转运过程，防止巨隧细胞中的氧化低密度脂蛋白 (Ox-LDL)蓄积造成巨隧细胞泡沫化。由图8看出，经过化合物（I)20-24h的作用，可W在1- ΙΟμΜ时剂量依赖地上调ABCA1和ABCG1的表达，ABCA1最大上调2.17倍，而ABCG1可达2.48倍。 因而本发明阐述了化合物（I)对巨隧细胞中促进胆固醇外排相关蛋白有明显的上调作用。
[0106] 实施例9.化合物（I)在化pG2细胞中对ABCG5和ABCG8表达水平的影响
[0107] 1)化合物处理细胞:预先将接种于6孔细胞培养板中的化pG2细胞加入不同浓度的 化合物（I)处理，W浓度为0.1 % DMS0作为阴性对照组，在37 °C，5 % C〇2条件下培养20-24h。
[0108] 2)Western blot方法测定ABCG5和ABCG8蛋白表达水平，并用软件定量处理。
[0109] 肝脏中ABCG5，ABCG8蛋白也是LXR下游的祀蛋白，它们受到LXR的直接调控，运两个 转运蛋白在肝细胞小管的膜上表达，从而驱动胆固醇向胆汁中转运表达，促使胆固醇分泌。 如图9所示，本发明中化合物（I)在0 . ΙμΜ时对ABCG5的上调倍数最高，可达1.2倍左右；在 0.1 -1 ΟμΜ范围内剂量依赖地上调ABCG8的表达，在1 OiiM时对ABCG8上调最高可达2.2倍。说明 化合物（I)有可能会通过上调ABCG5和ABCG8表达而促进肝脏中胆固醇分泌。
[0110] 实施例10.化合物(I)促进巨隧细胞胆固醇外排实验
[0111] 1)小鼠单核-巨隧细胞RAW264.7用含10%FBS的DMEM-高糖培养基(500μ1/孔），W2 X 1〇5个/孔接种于24孔细胞培养板上，于37 °C，5 % C〇2条件下过夜培养。
[0112] 2)弃细胞液，换为含有0.2%(胖八)854的0161-高糖培养基(50041/孔），加入1，2- 巧]胆固醇并使其终浓度为化^/1111，37°(：，5%0)2条件下解育2地。
[0113] 3)用PBS( 1ml/孔）洗细胞2次，加入含一定浓度化合物的测定培养基（DMEM加入 0.2%BSA，0.1%DMS0,25mM 肥阳S，抑7.4)，37°C解育 18~2地。
[0114] 4作85(11111知1)洗细胞2次，加入培养基（0161加入0.2%854,0.1%0150,251111 肥阳S，抑7.4)，10μg/ml的apoA-I或50μg/ml的皿L，解育地。
[0115] 5川欠集培养基，10，000 X g离屯、5min，取上清待测。
[0116] 6)用O.IM NaOH 0.5ml室溫裂解细胞30min，收集裂解液待测。
[0117] 7)测定:将待测样品分别转移至3mm滤纸上，75°C烘干，将纸片放在液闪杯中，加入 10ml液闪液(质量浓度为0.5%PP0和0.05%P0P0P)与体积分数为55%二甲苯和45%乙二醇 二甲酸的溶剂混合配制，置于栋色容器内存放，过夜使用，液闪计数仪计数。整个实验细胞 分为对照组(不加胆固醇但是加 apoA-I /HDL、加胆固醇)和加样组（同时加入胆固醇、apoA- 1/皿L和一定浓度的待测样品）。
[011引胆固醇流出率（％ )=培养液cpm值/总cpm值X 100%
[0119] =培养液cpm值/(培养液cpm值+细胞cpm值）X 100%
[0120] 巨隧细胞中的胆固醇外排结果如图10所示，化合物（：〇在0.1、1、10μΜ作用下，可W 促进1，2-[3扣胆固醇的流出到胆固醇接受体，并且随着化合物浓度的增加，1，2-[3Η]胆固醇 流出水平也增大，流出至apoA-I的倍数在1.2-1.7倍之间，流出至HDL的倍数比至apoA-I的 倍数高，大约在1.5-2.0倍之间。该结果符合本发明前部分所述的，化合物(I)通过上调巨隧 细胞内ABCA1和ABCG1蛋白表达，进而促进细胞内胆固醇的外排，符合LXR激动剂的生理学活 性，且对于皿L作为胆固醇接受体的影响更显著，而ABCG1主要负责将多余的胆固醇转运至 皿L，运与之前所探讨的化合物可W显著上调ABCG1的蛋白和mRNA表达的发明结果一致。
[0121] 实施例11.化合物(I)抑制巨隧细胞泡沫化作用的实验
[0122] 小鼠的单核巨隧细胞RAW264.7用含10 % FBS的DMEM-高糖培养液于透明96孔细胞 培养板上培养。贴壁后，换为无血清DMEM-高糖培养基（100μΙ/孔）。将细胞分为空白对照组、 泡沫细胞组和加药组，加入终浓度为80μg/ml的化-LDL到泡沫细胞组和加药组，24h后，加药 组加入一定浓度的化合物（1)。37°(：，5%〇)2条件下培养2地后，进行油红0染色。将96孔板从 0)2解箱中取出，细胞用4 %多聚甲醒固定（1扣1 /孔）lOmin，弃溶液，双蒸水洗两次，再加入 60%异丙醇（150μ1/孔），放置5min，弃去溶液。将油红0使用液(现用现配，过滤）加入各孔 中，150μ1/孔，染色化。弃去溶液，用60%异丙醇（150μ1/孔)洗孔，然后用双蒸水（150μ1/孔） 洗两次，最后每孔加15化1双蒸水置于显微镜下观察、拍照，结果见图11。
[0123] 将只加入化-U)L作为泡沫化细胞组，通过油红0染色，在显微镜下观察细胞的着色 程度。从图11中可W看出，（a)空白组没有红色脂滴形成，（b)化-LDL溶剂对照组形成明显的 红色脂滴存在，（C)化合物（I)处理组，细胞内出现红色油状颗粒与对照组相比明显减少，说 明化合物（I)能够减少脂质在巨隧细胞中蓄积，有效抑制巨隧细胞泡沫化，（d)加入ΙΟμΜ 9CRA( LXRs激动剂)细胞中脂质积累也明显减少。
[0124] 实施例12.化合物(I)降低胞内总胆固醇
[0125] 利用BioVision公司胆固醇定量试剂盒推荐方法测定胞内总胆固醇，测定方法如 下：
[0126] 1)配制胆固醇标准品浓度梯度:0、1、2、3、4、5yg/we 11。
[0127] 2川欠集细胞，加入200μ1 邸3(：1:1口4:肥-40(7:11:01)，12,000邑室溫离屯、5111111。
[0128] 3)将上清转移到新的ΕΡ管中，置于5(TC烘箱将液体烘干。
[01 巧]4)加入100μΙ cholesterol assay buffer溶解混合。
[0130] 5)方口入2μ1 esterase、2yl substrate mix、2yl cholesterol enzyme 44ul样品或标准品，37°C避光解育30minD450nm波长下读取光吸收值并计算。
[0131] 胞内总胆固醇主要包括游离胆固醇和胆固醇醋，总胆固醇的量也是细胞泡沫化的 一个主要特征。由图12看出，化合物（I)在UiM和ΙΟμΜ时降低胞内总胆固醇含量显著。说明加 入的化合物能够抑制巨隧细胞泡沫化，减少脂质在巨隧细胞中蓄积。
[0132] 实施例13.化合物(I)对ΤΗΡ-1细胞中炎症关键蛋白ρ65表达的影响
[0133] 1)化合物处理细胞:预先将接种于6孔细胞培养板中的ΤΗΡ-1在加入终浓度50ηΜ佛 波醋ΡΜΑ诱导2地后，向其中加入ΙΟμΜ的E1231，37°C解育化，再加入终浓度为lOng/ml的LPS 刺激细胞内细胞因子的产生，继续37 °C解育1她。
[0134] 2)Western blot方法测定p65蛋白表达水平，并用软件定量处理。结果见图13。
[0135] 热量限制后的另一显著特征是抑制炎症反应。化合物（I)作为SIRT1的激活剂，对 炎症因子的释放应该具有一定的抑制作用，对于预防动脉粥样硬化有积极的意义。由图13 可看出，化合物（I)在ΙμΜ和ΙΟμΜ时降低p65蛋白表达，最高可抑制35%。因而本发明阐述了 化合物(I)对巨隧细胞中炎症相关蛋白有明显的抑制作用。
[0136] 实施例14.化合物(I)在apoE-/-小鼠体内的药效学评价
[0137] A)apoE-/-小鼠动脉硬化模型的构建
[013引 l)apoE-/-小鼠，7周龄，普通饲料喂养一周；
[0139] 2)将apoE^/^小鼠称体重，随机分组，共分为3组（空白对照组、模型组、给药组），每 组6-8只；
[0140] 3)从8周龄开始，模型组和给药组喂养高脂饲料饮食，空白组继续喂养普通饲料；
[0141] 4)化合物（I)加样组（20mg/kg)，灌胃给药；空白对照组和模型组给簇甲基纤维素 钢溶液，灌胃给药;给药4周；
[0142] 5)将给药4周的apoE-/-小鼠禁食化;摘眼球取血，用肝素润洗过的EP管收集血，上 下颠倒，置于冰上，4000r/min，4°C离屯、3min，将上清液转移至新的EP管中（分两份），置于- 20°C保存。
[0143] 6)固定小鼠，剪开胸腔，剪去胸骨，暴露屯、脏，立即进行屯、脏灌流，先用4%的多聚 甲醒灌入大约1ml，然后换成PBS灌入大约4ml，待肝脏变白后停止；
[0144] 7)分离自主动脉至骼骨总分支的动脉全长，取出屯、脏和动脉。解剖后，将屯、脏和主 动脉放入4%的多聚甲醒中，37°C固定化，然后放入20%的薦糖溶液中，4°C过夜。
[0145] B)血脂水平的测定
[0146] 将离屯、后的血清，按照普利来生物技术有限公司试剂盒所述方法进行测定。
[0147] C)冰冻切片的制作方法
[0148] 1)将1.5ml EP管从中部切断，留下带盖的部分，将盖子盖上，做好标记；
[0149] 2)将0CT包埋剂加到EP管中，注意不要有气泡；
[0150] 3)将20%薦糖中浸泡的组织放入到0CT中，屯、脏包埋时，留大约1/3屯、脏，切平，将 屯、尖部分朝上，慢慢放入0CT中；
[0151 ] 4)将包有组织的EP管慢慢放入到液氮中；
[0152] 5)用锡纸立即包好冷冻好的EP管，-20°C避光保存，长期保存放在-80°C。
[0153] D)主动脉油红0染色
[0154] 1)将主动脉从20 %薦糖取出，PBS洗一次；
[0155] 2)在解剖显微镜下，将主动脉纵向剖开；
[0156] 3)将剪开的主动脉用蒸馈水洗3次；
[0157] 4)60 %异丙醇浸泡lOmin，进行同步化；
[0158] 5)将同步化好的放入新配好的油红工作液中（油红储存液配置，过滤1-化内用）， 30min；
[0159] 6)放入60%异丙醇分色Imin;
[0160] 7)双蒸水洗3次；
[0161] 8)将解剖开的主动脉平铺在黑蜡上，照相机立即照相。
[0162] E)冰冻切片油红0染色（屯、脏流出道）
[0163] 1)将切片在室溫下放置30min，吹干冰冻切片；
[0164] 2)将切片放入4%多聚甲醒中，固定lOmin;
[0165] 3)弃多聚甲醒溶液，加入双蒸水，洗3次，每次3min;
[0166] 4) 60 %异丙醇浸泡切片3min，进行同步化；
[0167] 5)然后将同步化好的切片放入新配好的油红工作液中（油红储存液配置，过滤1- 化内用），30min;
[0168] 6)将切片放入60%异丙醇分色，随时在显微镜下观察；
[0169] 7)双蒸水洗3次；
[0170] 8)苏木精染2-3min，复染细胞核；
[0171] 9)双蒸水洗3次后，将切片放在蒸馈水中；
[0172] 10)水性封片剂封片(9份医用甘油+1份双蒸水）；
[0173] 将封好的片子四周涂指甲油，阴凉处阴干，立即照相。
[0174] apoE-/-小鼠血脂水平的测定结果如表2。从表2可W看出高脂饮食喂养的apoE-/-小 鼠，经化合物（I)给药后，血脂中总胆固醇(TC)、甘油立醋巧6)、低密度脂蛋白胆固醇化0心 C)W及高密度脂蛋白胆固醇化DkC)的含量。给药组与模型组相比，都有一定降低TC、TG、 LDkC的效果，并升高皿kC的含量。说明化合物（I)能够调节血脂水平。
[01巧]apoE-/-小鼠主动脉全长进行油红染色，结果如图14。从图14b可W看出，高脂饮食 模型组的整个主动脉出现明显的动脉硬化斑块，说明动脉硬化模型构建成功。与高脂饮食 模型组相比，给药组（图14c)小鼠主动脉斑块明显较少、减小，说明化合物（I)能对动脉硬化 的治疗起到积极作用。
[0176] 将apoE-/-小鼠屯、脏冰冻切片结果如图15。从图15中可W看出，高脂饮食模型组（图 15b)屯、脏流出道的整个主动脉出现大面积的动脉硬化斑块，脂滴大而且密实。空白对照组 (图15a)可W看到较小的动脉斑块，可能由于apoE^/^小鼠自发产生。与高脂饮食组相比，化 合物（I)组（图15c)动脉斑块面积明显减少。
[0177] 综合图14-15结果，化合物（I)能显著减少apoE^/^小鼠主动脉全长和屯、脏流的斑块 面积和数量。apoE-/-小鼠体内的结果均表明化合物(I)具有良好的抗动脉粥样硬化效果。
[0178] 实施例15.小鼠主动脉中衰老相关标记分子mRNA水平检测
[0179] A)小鼠饲养:C57MV6小鼠，7周龄，饲养于SPF级动物房，清洁饮水，自由取食。阴性 对照组喂养簇甲基纤维素钢，给药组喂养E1231，20mg/kg，灌胃。喂养16周。
[0180] B)RT-PCR法检测化合物（I)对主动脉中p66shc、PAI-l、p21的mRNA水平
[0181] 1)RNA 的提取：
[0182] 将组织样品的离屯、管从液氮罐中取出放入液氮预冷的研鉢中，加入一定量的 Trizol，用研磨棒反复研磨至均匀。按照说明书进行细胞总RNA的提取，并测定0〇26日和OD280 的比值，用W评价所提取RNA的质量(OD260/OD280介于1.8-2.0即可），定量后用06?(：水将各组 RNA调整为同样的浓度。
[0183] 2)逆转录-cDNA的合成
[0184] 采用Reve;rtAid? First Shand cDNA Synthesis Kit试剂盒化e;rmen1:as)进行。 将步骤1)所得的RNA反转录成cDNA(200ngAU)，于-20°C保存或继续进行W下的PCR反应。
[0185] 3)RT-PCR 反应
[0186] 将稀释步骤2)中反转录得到的cDNA模板（50ngAU)W及所有cDNA样品分别配置 RT-PCR反应体系。采用Roche的hstStart Universal SYBR Green Master(R0X)试剂盒配 审化CR反应体系，然后将其置于RT-PCR(Biorad)仪上进行PCR反应。各组引物（Invitrogen公 司合成）分别进行溶解曲线实验。各样品的目的基因（p66shc、PAI-l、p21)和管家基因（β- actin)分别进行RT-PCR反应。根据每个样品的目的基因的Ct值和其管家基因的Ct值来计算 调节倍数。上调倍数二2_[(祐。贿目值-祐。脚够ct值)-(结目值-结峻ct值)]
[0187] 鼠 p66shc引物序列：
[0188] F3:5，-AAGTACAACCCACTTCGGAATGA-3 '
[01 例 R3:5 '-GGGTCCCAGGGATGAAG-3 '
[0190] 鼠 PAI-1引物序列：
[0191] F1:5 '-CTCCGAGAATCCCACACAG-3 '
[0192] R1:5 '-ACTTTGAATCCCATAGCATC-3 '
[0193] 鼠 p21引物序列：
[0194] F2:5 '-TCTCAGGGCCGAAAACGGAG-3 '
[01 巧]R2:5 '-ACACAGAGTGAGGGCTAAGG-3 '
[0196] 鼠 β-actin引物序列：
[0197] F4:5 '-CCTTCCTTCTTGGGTATGGAATC-3 '
[0198] R4:5 '-AGCACTGTGTTGGCATAGAGGT-3 '
[0199] 由图16与簇甲基纤维素钢对照小鼠相比，化合物（I)喂养的小鼠，主动脉中 p66化C、PAI-1、p2 ImRNA水平明显下降。说明了化合物（I)在体内具有延缓血管老化、抗衰老 的作用。
[0200] 表1不同取代基的化合物及活性
[0201]

[0205] (#表示模型组与空白组相比胖<0.05，*表示给药组与模型组相比冲<0.05)。
【主权项】
1.取代的哌嗪-I，4-二酰胺类化合物在制备治疗和/或预防衰老的药中的应用。
【文档编号】A61K31/495GK105878247SQ201610251822
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年5月26日
【发明人】司书毅, 冯婷婷, 许艳妮
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所