一种月季微繁体系的建立方法与流程

本发明涉及了一种月季微繁体系的建立方法，属于植物遗传转化领域，具体地说涉及了一种普通月季的微繁体系建立方法。

背景技术：

月季(Rosa hybrida)在我国已经有1000多年的历史，主要分为种丰花月季、壮花月季、藤蔓月季、香水月季、灌木月季和月季六大类。2005～2008年三年间，总共831个月季品种在国际上登录，这当中有丰花月季169个、杂种香水月季204个、小花月季89个、灌丛月季161个、月季106个。在国外，月季在17-18世纪传入英国和法国。在此之后，欧洲人民将其作为重要种质与蔷薇进行杂交，培育出众多优质的新品种。目前，全世界培育了20000多月季新品种。科学家们经过大量探索，成功培育出多种抗寒、抗旱、抗病的优良月季新品，并进行了改变花色的育种。时至今日，大多数月季种质资源还未曾用于人工育种，其优良性状还没有得到挖掘和开发，月季新品种培育因此拥有着巨大的潜力。

为了满足人们的需要，组织培养技术在上个世纪末应运而生，以此为基础的转基因手段为传统的月季育种提供了一条全新途径。这种手段可以高效将优良的外源基因转入到生物体当中并得以表达，同时保持生物体性状相对的稳定性。稳定的组培体系和基因转化体系对月季新品种的获得意义重大，并已获得重大成就。但目前现有的月季微繁技术并不完善，存在着成花率低，生根率低，成活率低的问题。因此，在微繁殖体系的建立过程中，保证再生植株的成花率，生根率，成活率是我们面临的重要问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于应用植物组织培养技术，在现有技术基础上，提供一种更加完善完整的月季微繁体系的建立方法，克服月季再生体系成花率低，生根率低，成活率低的问题。

为实现上述目的，本发明所述的月季微繁体系的建立方法中，通过将盆栽月季经过外植体消毒、芽诱导培养、芽增殖培养、花诱导培养、生根培养五个过程，成功的将盆栽月季再生至培养瓶中培养。

该方法具体包括以下步骤：

(1)月季外植体消毒

于花市购买普通月季植株，高20cm-40cm，花色不限；剪取月季当年生健壮枝条，以软毛刷清除其表面灰尘，置于盛有清水的烧杯中，加少量清洗剂浸泡10min，期间不断摇动烧杯，流水冲洗1h，Cl₂灭菌20min；在超净工作台中用无菌蒸馏水浸泡清洗3次，无菌滤纸吸干；

(2)芽诱导培养

取步骤(1)消毒后的月季枝条，剪取1.5cm-2cm单芽茎段，形态学下端接种于芽诱导培养基中，接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养30d，得无菌苗；其中，所述的芽诱导培养基为MS培养基+噻苯隆(TDZ)+萘乙酸(NAA)+琼脂+蔗糖，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述NAA的浓度为0.1mg/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述蔗糖的浓度为30g/L，pH值为5.83～5.85；

(3)芽增殖培养

取步骤(2)培养30d后的无菌苗，在超净工作台中将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于芽增殖培养基中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养45d；其中，所述的芽增殖培养基为MS培养基+TDZ+NAA+琼脂+蔗糖，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述NAA的浓度为0.05mg/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述蔗糖的浓度为30g/L，pH值为5.83～5.85；

(4)花诱导培养

(a)取步骤(3)培养45d后的无菌苗，在超净工作台中将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于花芽诱导培养基中，接种后标注日期，置于智能人工气候箱中培养40d，获得丛生芽；培养条件为：25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗；其中，所述花芽诱导培养基为MS培养基+TDZ+琼脂+蔗糖，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述琼脂的浓度为7.2g/L，所述蔗糖的浓度为40g/L，pH值为5.83～5.85；

(b)将步骤(a)获得的丛生芽切取为单丛，接种于芽增殖培养基中，置于人工气候箱中培养10d，诱导月季开花；培养条件为：25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗；其中，所述芽增殖培养基为MS培养基+TDZ+NAA+活性炭+琼脂+蔗糖，所述TDZ的浓度为1.0mg/L，所述NAA的浓度为0.1mg/L，所述活性炭的浓度为0.6g/L，所述琼脂的浓度为7g/L，所述蔗糖的浓度为30g/L，pH值为5.83～5.85；

(5)生根培养

取步骤(4)培养的月季无菌苗，在超净工作台中将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种生根培养基中，每瓶均匀接种4个茎段，茎段接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗；其中，所述生根培养基为1/2MS培养基+活性炭1.0g/L+琼脂7g/L+蔗糖40g/L，所述活性炭的浓度为1.0g/L，所述琼脂的浓度为7g/L，所述蔗糖的浓度为40g/L，pH值为5.83～5.85。

本发明在微繁体系建立过程中所用到的培养基在配制好后均采用121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基冷凝至室温后方可使用。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、本发明的月季微繁体系建立中，通过对月季进行外植体消毒、芽诱导培养、芽增殖培养、花诱导培养、生根培养五大过程，成功的将普通盆栽月季再生至培养瓶中微繁培养，并且通过对上述各个过程所需的培养基的不断调配筛选，找到了各个过程中最适合的培养基，确保在培养瓶中微繁培养的月季成活率高，成花率高，生根率高。

2、本发明的方法较其它微繁体系建立方法相比，所培养的月季成花率与生根率较高，成活率高，为后续的分子生物学研究奠定了基础，具有巨大的经济价值。

附图说明

图1为花市购买的花色粉红的月季植株。

图2为芽诱导过程中月季的生长状态图。

图3为芽增殖过程中月季的生长状态图。

图4为花诱导过程中月季的生长状态图。

图5为生根培养过程中月季的生根情况图。

图6为微繁体系建立完成后月季生长状态图。

具体实施方式

为使本领域的技术人员清楚明白本发明的技术方案及其优点，下面结合实施案例对本发明作进一步说明：

实施例1

一、培养基的配置

芽诱导培养基(MS+TDZ 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85；

芽增殖培养基(MS+TDZ 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85；

花诱导过程中的花芽诱导培养基(MS+TDZ 1.0mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖40g/L)，pH5.83～5.85；芽增殖培养基其具体配方为(MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭0.6g/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L)，pH 5.83～5.85；

生根培养基(1/2MS+活性炭1.0g/L+琼脂7g/L+蔗糖40g/L)，pH 5.83～5.85。

本发明所述的1/2MS培养基是指将正常MS培养基中的大量元素和微量元素均减少到原来的1/2，具体组成同中国专利CN 104115743B中记载的1/2MS培养基组成一致。

所述MS培养基的配制参照中国专利CN 104115743B中记载的MS培养基的配制方法进行配制。

以上培养基配制好后均采用121℃高压蒸汽灭菌20min，待培养基冷凝至室温后，分别用于月季微繁体系建立过程。

二、月季微繁体系建立

(1)月季外植体消毒

于花市购买普通月季植株，高20cm-40cm，花色粉红；剪取月季当年生健壮枝条，以软毛刷清除其表面灰尘，置于盛有清水的烧杯中，加少量清洗剂(1滴蓝月亮牌洗洁精)浸泡10min，期间不断摇动烧杯，流水冲洗1h，Cl₂灭菌(1ml浓HCl与25ml NaClO反应生成，具体方法参照中国专利CN 104115743B记载的内容)20min；在超净工作台中用无菌蒸馏水浸泡清洗3次，无菌滤纸吸干。

(2)芽诱导培养

取步骤(1)消毒后的月季枝条，剪取1.5cm-2cm单芽茎段，形态学下端接种于芽诱导培养基中，接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养30d，得无菌苗。

(3)芽增殖培养

取步骤(2)培养30d后的无菌苗，在超净工作台中将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于芽增殖培养基中，每瓶均匀接种4个茎段，接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，培养45d。

(4)花诱导培养

(a)取步骤(3)培养45d后的无菌苗，在超净工作台中将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于花芽诱导培养基中，接种后标注日期，置于智能人工气候箱中培养40d，获得月季的丛生芽；培养条件为：25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗；

(b)将步骤(a)获得的月季丛生芽切取为单丛，接种于芽增殖培养基中，瓶均匀接种4丛，接种100瓶，置于人工气候箱中培养，培养条件为：25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗。10d后进行统计，其中87瓶有花形成，13瓶未见成花，成花率可达87％。

(5)生根培养

取步骤(4)培养的月季无菌苗，在超净工作台中将无菌苗切取为1.5cm-2cm带节间茎段，形态学下端接种于生根培养基中，每瓶均匀接种4个茎段，接种100瓶，茎段接种后培养条件为25℃，光强2000lx，光周期为16小时光照，8小时黑暗，40d后统计无菌苗生根情况，其中，97瓶生根状况良好，根系发达，3瓶生根不明显。最终统计生根生根率可达97％。

对比例1

区别在于步骤(2)芽诱导培养过程中所用的芽诱导培养基为MS+TDZ 0.2mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例2

区别在于步骤(2)芽诱导培养过程中所用的芽诱导培养基为MS+TDZ 0.4mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例3

区别在于步骤(2)芽诱导培养过程中所用的芽诱导培养基为MS+TDZ 0.6mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例4

区别在于步骤(2)芽诱导培养过程中所用的芽诱导培养基为MS+TDZ 0.8mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例5

区别在于步骤(2)芽诱导培养过程中所用的芽诱导培养基为MS+TDZ 2.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例6

区别在于步骤(3)芽增殖培养过程中所用的芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例7

区别在于步骤(3)芽增殖培养过程中所用的芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同。

对比例8

区别在于步骤(3)芽增殖培养过程中所用的芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同

对比例9

区别在于步骤(3)芽增殖培养过程中所用的芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.5mg/L+琼脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步骤与实施例1相同

结果：在步骤(2)芽诱导培养过程中，不同TDZ与NAA配比,对月季丛生芽的生长状况有很大的影响，NAA浓度不变的情况下，设置芽诱导培养基中TDZ浓度梯度分别为0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L，并对芽的高度和节间长度进行差异显著性分析，如表1所示，在TDZ浓度小于1.0mg/L时，丛生芽的高度均为2.0cm以上，节间长度差异不显著，当TDZ浓度为2.0mg/L时，丛生芽高度小于2.0cm节间长度较短，与其他浓度下生长状态差异显著，当TDZ浓度为1.0mg/L时，丛生芽的高度达3.373cm，节间长度达到了0.238cm，均达到了最大，因此本发明提供了芽诱导过程中TDZ与NAA的最佳浓度配比，并培育出生长状态良好的丛生芽，以保证最终微繁体系建立完成月季的生长开花状况最佳。

在步骤(3)芽增殖培养过程中，单芽茎段接种于不同TDZ与NAA配比的芽增殖培养基30d后，对月季组培苗高度进行测量，结果发现：当TDZ浓度不变时，随着NAA浓度的增加，组培苗高度先增高再降低，当NAA浓度为0.05mg/L时，株高达最大值5.02cm。对月季组培苗节间长度进行测量，结果发现：当TDZ浓度不变时，随着NAA浓度的增加，组培苗节间长度先增高再降低，当NAA浓度为0.05mg/L时，节间长度达最大值0.40cm。因此本发明提供了芽增殖过程中TDZ与NAA的最佳浓度配比，并培育出生长状态良好的月季植株，为最终微繁体系建立完成提供了保障。

同时，本发明在花诱导过程中选择的花芽诱导培养基以及芽增殖培养基均为目前现有的成花率较高的培养基，在生根培养基选择过程中，也针对最终生根率进行了培养基的选则和活性炭浓度的确定，以保障月季微型繁体系建立后无菌苗的成花率、生根率、成活率。

表1TDZ浓度对丛生芽的影响

表2NAA浓度对月季组培苗株高和节间长度的影响