本发明公开了一种瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽的方法，属于组培快繁及栽培技术领域。
背景技术：
景天科拟石莲属(Echeveria)为多年生肉质观赏草本植物，原产于巴基斯坦，现世界多地可栽培，其外形优美，色彩丰富，近2年来规模化种植迅速发展，全国种植区域和数量快速增加，商品盆栽供销两旺。特别自2015年以来，对特色(Echeveria‘Colorate Special’)、红缘东云(Echeveria‘Agavoides Red’)和优雅(Echeveria‘Elegance’)等进口高端品种的商品盆栽需求量迅猛增加，价格居高走上，市场前景及经济价值广阔。目前，商品盆栽的培育主要采用叶片扦插等传统方法育苗，常规叶片扦插繁殖为掰取植株基部下叶片，于遮光率为85％的温室中晾2～4天，伤口愈合后平放于苗床上常规管理形成完整单株苗，后每株完整单株苗移栽入穴盘或育苗杯或花盆，养护管理3～4月后获得可销售产品，但该传统方法从扦插育苗到商品盆栽需8～9月，周期长，速度慢，且此法培育的商品盆栽形态单一欠丰满，整齐度和标准化程度不高，商品性状不佳，商品化效率低下，特别对于难扦插高端品种采用该常规方法时，其掰取的叶片20天左右伤口才能愈合，且耗时长，扦插期间叶片易干缩或黄化甚至腐烂死亡，扦插成功率不到10％，种苗繁殖困难、有效成苗率低，还存在植株退化快等问题。因此，本发明通过组培快繁技术结合再生芽丛早期商品化塑型以及塑型生根丛苗标准化快速培育两大步骤，建立起瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽的方法。
技术实现要素：
为解决上述拟石莲属名贵品种的种苗繁育困难，有效成苗率低，育苗周期长，以及常规繁育种苗出圃后还需进行重组或整形、出圃种苗及盆栽质量参差不齐，生产成本高等缺陷，本发明提供一种瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽方法。本发明的技术方案如下：
1.瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽方法，包括以下步骤：
(1)优质塑型生根丛苗的诱导和培育
①外植体的选择与消毒
选择无病虫害、无损伤拟石莲属植物离体叶片为外植体，于室温阴凉干燥处晾过夜，第二天用浓度为1％v/v洗洁精水溶液洗1次后，置于自来水下冲洗0.5～1.0h，沥干表面水分，置于超净工作台，先用75％v/v酒精浸泡10s～15s，再用添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液浸泡5～6min，无菌水洗2～3min，最后用添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液浸泡3～5min，无菌水洗3次～5次，每次洗2～3min，获得无菌离体叶片，于无菌条件下，切除叶片中上部组织，保留从叶片基部至上、长度为1.5cm～2.5cm、含叶基部腋芽分生组织的叶片组织为无菌诱导外植体，备用；所述添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液为在100～120毫升的0.05％w/w氯化汞溶液添加2～3滴Tween-20，所述添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液为在100～120毫升的2.5％w/w次氯酸钠溶液中添加2～3滴Tween-20；
②再生芽苗诱导
将无菌诱导外植体斜插于盛有诱导培养基的组培瓶内，于23℃～25℃、空气相对湿度30％～50％的条件下暗培养10d～15d，后转为光培养，光培养条件为：温度23℃～25℃，空气相对湿度30％～50％，光照强度1000～1200lx，光照时间12～16h/d，培养10d～25d，所述诱导培养基为MS+ZT 1.0～2.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+硫酸腺嘌呤30～50mg/L+蔗糖25～30g/L+琼脂6.0～7.0g/L,pH值为5.5～6.0；
③再生芽苗塑型增殖培育
将通过步骤(1)②诱导出的丛生不定芽从叶基部以2～4个芽为一个芽丛切下，且留0.3～0.5cm的叶原基，进行第一次塑型，第一次塑型后的每一个芽丛转接于一个盛有增殖培养基的组培瓶内，在培养条件为：温度23～25℃，空气相对湿度30％～50％，光照强度1500～2000lx，光照时间12～16h/d的条件下培养20～30天；所述第一次塑型为：根据目的商品性状，在每一个分切好的芽丛基部四周用灭菌接种刀尖等距或非等距纵向轻划3～5刀微伤口，微伤口大小长为0.1～0.2cm、深为0.02～0.05cm，促进优质苗团增殖再生和造型丰满；所述增殖培养基为：MS+ZT 0.2～0.3mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+硫酸腺嘌呤30～50mg/L+蔗糖25～30g/L+活性碳300～500mg/L+琼脂6.0～7.0g/L,pH值为5.5～6.0；
④壮苗生根和第二次塑型
无菌条件下，取步骤(1)③所培养的苗团，根据目的商品性状要求，以3～5个单株苗为一丛切分为一个苗丛，具体用无菌接种刀插入苗团的缝隙竖直向下切分为第二次塑型；后再将切分好的苗丛放入盛有壮苗生根培养基的组培瓶内，在与步骤(1)③相同的培养条件下培养25d～30d，所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖25～30g/L+活性碳300～500mg/L+琼脂6.0～7.0g/L，pH值为5.5～6.0；
(2)塑型生根丛苗移栽入盆驯化和后期标准化培育商品小盆栽
①塑型生根丛苗移栽
将步骤(1)④培养获得的生根瓶苗置于过渡温室内，在自然温度和自然光照条件下放置5～7d后，取出植株，洗除培养基，放于阴凉处晾去表面水分，移栽到装有无土栽培基质的花盆，浇透水；所述无土栽培基质用草炭土∶珍珠岩∶鹿沼土按2:1:1体积比的比例混合而成；移栽后放入温室，花盆上方搭建遮光率为70％的遮阳网，此后每天早晚各喷雾1次水，保持温室内温度为18～25℃，温室内空气相对湿度为85％以上；
②标准化培育商品小盆栽
步骤(2)①移栽成活后，撤去遮阳网，保持温室内温度为18～28℃，空气相对湿度保持为60～65％，每3～4天浇一次透水，每15天浇施一次2000倍液复合肥，所述复合肥中N﹕P2O5﹕K2O的质量比为17﹕17﹕17；每周喷施一次70％甲基托布津可湿性粉剂1500倍液；发现蚜虫时，喷施10％吡虫啉可湿性粉剂1000倍液。
2.根据技术方案1所述的瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽方法，步骤(2)①移栽所用的花盆为高15cm、盆底内径8cm、盆口内径10cm。
3.根据技术方案1所述的瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽方法，步骤(1)②所述的将无菌诱导外植体斜插于盛有诱导培养基的组培瓶内，所述斜插的斜度为30°～45°。
4.根据技术方案1或2或3所述的瓶内塑型快速培育难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽方法，还包括如果还需增殖苗，则每20～30d重复步骤(1)③。
本发明的创新点及有益效果：
本发明利用组织培养技术和标准化栽培技术，在诱导拟石莲属植物离体腋芽植株再生和快速增殖的同时，有目的地进行商品化塑型，并通过后期标准化驯化和栽培管理，快速培育出优质的拟石莲属商品小盆栽，为拟石莲属难扦插繁殖的名贵品种的种苗工厂化和小盆栽快速商品化提供了技术支持。
本发明一是解决了难扦插繁殖的拟石莲属植物田间叶片扦插繁殖系数低，繁殖困难、有效进种率低、单芽上盆后还需重组或整形、投产周期长的技术问题。二是通过离体腋芽的消毒和接种方式优化、基本培养基和植物激素浓度的筛选试验，实现了对难扦插繁殖的拟石莲属丛生芽的大量诱导和增殖，并结合早期瓶内商品化塑型，获得形态优美、苗龄整齐的批量优质生根丛苗；三是在早期瓶内塑型和繁殖壮苗阶段，加入适宜剂量的活性碳，有效抑制了小苗玻璃化和气生根萌发，使苗团塑型更为理想，提高了质量；四是用此方法能快速生产优质整齐的拟石莲属名贵品种商品盆栽，比常规培育方法缩短90～100天，80～90天即获得整齐优质的商品小盆栽上市销售，且出圃小盆栽整齐、商品性状优异、形态较丰满，标准化和商品化程度高。
解决了难叶插繁殖的拟石莲属小盆栽种苗繁殖困难、有效进种率低、单芽上盆后还需重组或整形、投产周期长等技术问题，
本发明组培有效进种率达89％以上，能诱导出大量丛生芽，每外植体平均诱导出芽4～8个，诱导率达89％以上，生根率达92％以上。所培育的生根苗健壮，移栽成活快、移栽成活率高，移栽后7～10天后即可成活，成活率为85％以上。
综上所述，本发明方法显著提高了难扦插繁殖的拟石莲属商品小盆栽的标准化培育速度，解决了种苗的繁殖系数和繁殖速度低的问题，降低了生产成本，采用早期瓶内组培塑型、标准化培育出优质小盆栽，商品化和标准化程度高，并能周年生产，加速了商品化进程，较好的保持了品系优势，商品投入市场效率高。尤其解决了该属一些利用叶插等传统繁殖方式难以批量生产的高端名品产品的开发，对名优珍稀品种的规模化、标准化商品开发具有较高的经济效益和实际利用价值，技术效果显著。
具体实施方式
实施例所用生物材料[Colorate Special(音译中文名：特色；拉丁名：Echeveria‘Colorate Special’)，Agavoides Red(音译中文名：红缘东云；拉丁名：Echeveria‘Agavoides Red’)和Elegance(音译中文名：优雅；拉丁名：Echeveria‘Elegance’)]为荷兰商业品种，通过Greenwings-China(绿翼中国)公司从荷兰购入云南省农业科学院花卉研究所。Greenwings-China公司地址：北京市海淀区蓝靛厂南路25号牛顿办公区912室，邮编：100097。
以下无特殊说明的为常规方法。
实施例1
(1)优质塑型生根丛苗的诱导和培育
①外植体的选择与消毒
以进口拟石莲属高端名品“特色(Echeveria‘Colorate Special’)”为材料，选择无病虫害、无损伤的拟石莲属植物离体叶片为外植体，于室温阴凉干燥处晾过夜，第二天用浓度为1％v/v洗洁精水溶液洗1次后，置于自来水下冲洗0.5h，沥干表面水分，置于超净工作台，先用75％v/v酒精浸泡12s，再用添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液浸泡5min，无菌水洗3min，最后用添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水洗4次，每次洗3min，获得无菌离体叶片，于无菌条件下，切除叶片中上部组织，保留从叶片基部至上、长度为1.9cm～2.5cm、含叶基部腋芽分生组织的叶片为无菌诱导外植体，备用；所述添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液为在100毫升的0.05％w/w氯化汞溶液添加3滴Tween-20，所述添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液为在100毫升的2.5％w/w次氯酸钠溶液中添加3滴Tween-20；所述浓度为1％v/v洗洁精水溶液是用市售洗洁精与水混合配成1％v/v洗洁精水溶液。
②再生芽苗诱导
将步骤(1)①无菌诱导外植体斜插于盛有诱导培养基的组培瓶内，斜插的斜度即无菌诱导外植体叶面与诱导培养基的夹角为30°～45°，斜插深度以无菌诱导外植体斜插不倒为准，斜插后，将组培瓶置于23℃～25℃、空气相对湿度30％～50％的条件下暗培养12d，后转为光培养，光培养条件为：23℃～25℃，空气相对湿度30％～50％，光照强度1200lx，光照时间12h/d，培养9d开始诱导出芽，培养20d获得大量丛生芽，每外植体平均诱导出芽4～8个，诱导率达90％。丛生芽翠绿密集壮实。接种于诱导培养基上，一周后外植体污染率为8％。所述诱导培养基为：MS+ZT 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+硫酸腺嘌呤30mg/L+蔗糖25g/L+琼脂6.5g/L,调pH值为5.8。
③再生芽苗塑型增殖培育
将步骤(1)②诱导出的丛生不定芽从叶基部以3个或4个芽为一个芽丛切下，且留0.3～0.5cm的叶原基，进行第一次塑型，第一次塑型后的每一个芽丛转接于一个盛有增殖培养基的组培瓶内，在培养条件为：温度23～25℃，空气相对湿度30％～50％，光照强度1800lx，光照时间16h/d的条件下进行增殖培养，光培养25天后丛生芽增殖率平均达447％，增殖快速，繁殖芽团整体翠绿、壮实丰满，植株品种特性明显，2％的繁殖芽团出现气生根，无玻璃化现象发生。
所述第一次塑型为：在每一个切分好的芽丛基部四周用灭菌接种刀尖等距纵向轻划4刀微伤口，微伤口大小约为长0.1cm、深0.02～0.05cm，可促进苗团增殖再生并造型丰满。还可根据需求，如商品的外形为近圆型或方形等目的商品形状要求，确定划出伤口的多少和伤口间的距离。本实施例是等距离划4个伤口，诱导苗丛的外形是近圆型。
所述增殖培养基为：MS+ZT 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+硫酸腺嘌呤30mg/L+蔗糖30g/L+活性碳500mg/L+琼脂6.5g/L,调节pH值为5.8。
如若需要大量增殖苗，则每25d重复步骤(1)③，进行多次塑型和转接增殖即可实现。
④壮苗生根和第二次塑型
无菌条件下，取步骤(1)③所培养的苗团，目测最佳分切点，用无菌接种刀插入苗团的缝隙竖直向下切分为5个单株苗为一丛的苗丛完成为第二次塑型，获得整齐一致的近圆形的苗丛，再将分切好的苗丛放入盛有壮苗生根培养基的组培瓶内，在与步骤(1)③相同的培养条件下培养23d后诱导出形态优美、整齐一致，根长为2～3cm，根数≥4条的实生根，生根率达92％以上的优质塑型生根丛苗。3％的苗丛在培养基上出现气生根，无玻璃化现象发生。其余不合格材料放入增殖培养基在培养。
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3mg/L+蔗糖30g/L+活性碳300mg/L+琼脂6.5g/L，调节pH值为5.8。
(2)塑型生根丛苗移栽入盆驯化和后期标准化培育商品小盆栽
①塑型生根丛苗移栽
将步骤(1)④培养获得的生根瓶苗置于过渡温室内，在自然温度和自然光照条件下放置5d后，取出植株，用自来水洗除培养基，放于阴凉处晾去表面水分，移栽到装有无土栽培基质的小花盆，小花盆高15cm、盆底内径8cm，盆口内径10cm，浇透水；所述无土栽培基质用草炭∶珍珠岩∶鹿沼土按2:1:1体积比的比例混合而成；移栽后放入温室，花盆上方搭建遮光率为70％的遮阳网，此后每天早晚各喷雾1次水，保持温室内温度为18～25℃，温室内空气相对湿度为85％以上；8～12天后成活，成活率为90％。
②标准化培育商品小盆栽
步骤(2)①移栽成活后，撤去遮阳网，保持温室内温度为18～25℃，空气相对湿度保持为60～65％，每3～4天浇一次透水，每15天浇施一次2000倍液复合肥，所述复合肥中N﹕P2O5﹕K2O的质量比为17﹕17﹕17；每周喷施一次70％甲基托布津可湿性粉剂1500倍液预防病害；发现蚜虫时，喷施10％吡虫啉可湿性粉剂1000倍液。上述标准化培育68～90天即获得整齐优质的商品小盆栽即可上市销售。
实施例2
实施例2除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同。
(1)优质塑型生根丛苗的诱导和培育
①外植体的选择与消毒
以拟石莲属高端名品“红缘东云(Echeveria‘Agavoides Red’)”为材料，用75％v/v酒精浸泡时间为15s，用添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液浸泡6min，用添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液浸泡时间为4min，之后无菌水洗5次，每次洗3min，获得无菌离体叶片，于无菌条件下，切除叶片中上部组织，保留从叶片基部至上、长度为1.5cm～1.8cm、含叶基部腋芽分生组织的叶片为无菌诱导外植体，备用；所述添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液为在100毫升的0.05％w/w氯化汞溶液添加2滴Tween-20，所述添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液为在110毫升的2.5％w/w次氯酸钠溶液中添加3滴Tween-20。
②再生芽苗诱导
暗培养时间为15d后转为光培养，光培养条件为：23℃～25℃，光照强度1100lx，空气相对湿度30％～50％，光照时间为16h/d，培养14d开始诱导出芽，培养25d获得大量丛生芽，每外植体平均诱导出芽4～7个，诱导率达91％。接种于诱导培养基上，一周后外植体污染率为8％。所述诱导培养基为：MS+ZT 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+硫酸腺嘌呤30mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.5g/L,调pH值为5.8。
③再生芽苗塑型增殖培育
将步骤(1)②诱导出的丛生不定芽从叶基部以2个芽为一个芽丛切下，第一次塑型时在每一个芽丛基部四周用灭菌接种刀等距划出3刀微小伤口。培养条件的光照时间为12h/d，光培养15～20后丛生芽增殖率平均达489％，增殖快速，繁殖芽团整体翠绿、壮实丰满，植株品种特性明显，5％的繁殖芽团出现气生根，无玻璃化现象发生。
所述增殖培养基为：MS+ZT 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+硫酸腺嘌呤50mg/L+蔗糖25g/L+活性碳300mg/L+琼脂6.5g/L,调节pH值为5.8。
④壮苗生根和第二次塑型
用无菌接种刀插入苗团的缝隙竖直向下切分为3个单株苗为一丛的苗丛即为第二次塑型。培养30d后诱导出形态优美、整齐一致，根长大于2cm，根数≥4条的实生根，实生根生根率达94％的优质塑型生根丛苗。4％的生根苗团在培养基上出现气生根，无玻璃化现象发生。
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖25g/L+活性碳500mg/L+琼脂6.5g/L，调节pH值为5.8。
(2)塑型生根丛苗移栽入盆驯化和后期标准化培育商品小盆栽
①塑型生根丛苗移栽
将步骤(1)④培养获得的生根瓶苗置于过渡温室内，在自然温度和自然光照条件下放置7d后，取出植株，移栽入高为15cm、盆底内径8cm、盆口内径10cm的小花盆。9～12天后成活，成活率为89％。
②标准化培育商品小盆栽
标准化培育68～90天即获得整齐优质的商品小盆栽即可上市销售。
实施例3
实施例3除以下步骤不同外，其余步骤与实施例1相同。
(1)优质塑型生根丛苗的诱导和培育
①外植体的选择与消毒
以难扦插繁殖的拟石莲属高端名品“优雅(Echeveria‘Elegance’)”为材料，用浓度为1％v/v洗洁精水溶液洗1次后，置于自来水下冲洗1.0h，75％v/v酒精浸泡时间为12s，用添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液浸泡5min，无菌水洗2min，用添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液浸泡时间为5min，之后无菌水洗5次，每次洗2min，获得无菌离体叶片，于无菌条件下，切除叶片中上部组织，保留从叶片基部至上、长度为2.0cm～2.3cm、含叶基部腋芽分生组织的叶片为无菌诱导外植体，备用；所述添加有Tween-20的0.05％w/w氯化汞溶液为在100毫升的0.05％w/w氯化汞溶液添加3滴Tween-20，所述添加有Tween-20的2.5％w/w次氯酸钠溶液为在100毫升的2.5％w/w次氯酸钠溶液中添加3滴Tween-20。
②再生芽苗诱导
暗培养时间为12d后转为光培养，光培养条件为：23℃～25℃，光照强度1200lx，空气相对湿度30％～50％，光照时间为16h/d，培养12d开始诱导出芽，培养25d获得大量丛生芽，每外植体平均诱导出芽4～8个，诱导率达89％。接种于诱导培养基上，一周后外植体污染率为9％。所述诱导培养基为：MS+ZT 1.5mg/L+NAA 0.15mg/L+硫酸腺嘌呤35mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.4g/L,调pH值为5.8。
③再生芽苗塑型增殖培育
将步骤(1)②诱导出的丛生不定芽从叶基部以3个芽为一个芽丛切下，第一次塑型时在每一个芽丛基部四周用灭菌接种刀划出4刀微小伤口。培养条件的光照时间为16h/d，光培养30天后丛生芽增殖率平均达464％，增殖快速，繁殖芽团整体翠绿、壮实丰满，植株品种特性明显，4％的繁殖芽团出现气生根，无玻璃化现象发生。
所述增殖培养基为：MS+ZT 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+硫酸腺嘌呤40mg/L+蔗糖30g/L+活性碳400mg/L+琼脂6.4g/L,调节pH值为5.8。
④壮苗生根和第二次塑型
用无菌接种刀插入苗团的缝隙竖直向下切分为3个或4个单株苗为一丛的苗丛即为第二次塑型。培养27d后诱导出形态优美、整齐一致，根长大于2cm，根数≥3条的实生根，实生根生根率达91％的优质塑型生根丛苗。4％的生根苗团在培养基上出现气生根，无玻璃化现象发生。
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.4mg/L+蔗糖25g/L+活性碳400mg/L+琼脂6.4g/L，调节pH值为5.8。
(2)塑型生根丛苗移栽入盆驯化和后期标准化培育商品小盆栽
①塑型生根丛苗移栽
将步骤(1)④培养获得的生根瓶苗置于过渡温室内，在自然温度和自然光照条件下放置7d后，取出植株，移栽入高为15cm、盆底内径8cm、盆口内径10cm的小花盆。9～12天后成活，成活率为92％。
②标准化培育商品小盆栽
标准化培育68～90天即获得整齐优质的商品小盆栽即可上市销售。