一种快速遗传转化苜蓿的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种快速遗传转化苜蓿的方法，是一种利用农杆菌介导法直接转化苜 蓿萌发种子，而不需要组织培养过程的新方法。
【背景技术】
[0002] 紫花苜蓿（MedicagosativaL.)为多年生豆科牧草，在我国栽培历史悠久、分布 广泛。其蛋白质含量丰富，营养价值高，干草产量居多种豆科牧草之首，素有"牧草之王"的 美誉。此外，发达的根系和生物固氮的特性使其对土壤改良、防止水土流失、提高土壤养分 中也起到重要作用。
[0003] 逆境尤其是盐碱、干旱等是抑制植物生长和降低作物产量的重要的环境因子，紫 花苜蓿等优良栽培作物因长期生长在较优裕的条件下，其抗旱耐盐等遗传潜力非常有限。 长期以来，抗逆性品种的培育被认为进一步提高苜蓿抵御逆境的有效途径。随着生物技术 的发展，转基因育种已成为苜蓿新品种培育的重要手段，它大大缩短了育种周期，打破了种 间的界限，促进了不同物种间遗传物质的交换，弥补了常规育种技术的一些局限性。自1985 年Vasil在国际草原学大会上第一次提出了利用遗传转化技术将外源的特定基因导入牧 草的可行性，为基因工程改良牧草奠定了理论基础。近年来，苜蓿通过基因转化技术，在抗 寒性、抗旱性、耐盐性等研究方面取得了一系列的突破性成就，加速了苜蓿育种进程。
[0004] 农杆菌介导法（Agrobacterium-mediated)是利用农杆菌Ti质粒或Ri质粒可侵 入受体细胞并整合进染色体DNA上的特性，实现了外源基因向植物受体的转化。在众多基 因转化方法中，该方法以低成本、低拷贝、可转移大片段的DNA等优点，广泛应用于植物愈 伤组织、悬浮细胞、叶盘、茎段、子叶、下胚轴及薄层细胞等离体材料的转化。
[0005] 在农杆菌介导苜蓿遗传转化的研究中，除少数工作外，苜蓿转基因植株的获得均 依赖于器官、组织和细胞培养技术。基因型是组织培养与遗传转化能否成功的关键，而目前 只有少数苜蓿品种可通过组织和细胞培养再生大量植株。此外，依赖于组织和细胞培养技 术的转化周期长。以农杆菌介导的叶盘法转化苜蓿为例，叶片经农杆菌浸染、共培养后，细 胞经脱分化形成抗性愈伤组织，抗性愈伤组织再分化出抗性芽，最后形成完整的抗性植株， 这个过程的最短时间不少于90d。因此，建立不受基因型制约的简单、快速的苜蓿遗传转化 方法和技术体系具有重要意义。
[0006] 例如在中国发明专利CN103074363A中，周晓馥等公开了一种利用苜蓿种子进行 基因转化的方法。即以苜蓿种子作为转化受体，在萌发过程中与含目标基因的根癌农杆菌 菌液共培养，靠渗透作用使得质粒DNA进入植物细胞中。该苜蓿转化方法避开了经组织培 养获得再生植株的过程，缩短了转化周期。在农杆菌介导植物转化的过程中，植物伤口产生 的糖类和酚类等化学物质使得农杆菌产生趋向性，使其附着在伤口诱发肿瘤，从而实现浸 染伤口并将T-DNA插入到植物基因组中。因此，该专利中受体材料仅靠渗透作用实现外源 DNA的转化，存在转化效率较低等缺点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种直接以苜蓿萌发种子为转化受体，无需进行组织培养及 植株再生过程的农杆菌介导苜蓿的快速遗传转化苜蓿的方法。
[0008] -种快速遗传转化苜蓿的方法，其特别之处在于，包括如下步骤：采用苜蓿萌发种 子为转化受体，以携带外源基因的农杆菌介导实现，具体步骤包括：（1)无菌苜蓿成熟种子 萌发；（2)携带外源基因的农杆菌的培养及注射式转化；（3)共培养及脱菌；(4)抗性植株 的获得；（5)转基因植株的获得。
[0009] 进一步的，包括如下步骤：
[0010] (1)无菌苜蓿成熟种子萌发：
[0011] 取苜蓿饱满、成熟种子，经消毒灭菌后置于MS固体培养基中光照培养，光照时间 为光16h/暗8h，培养温度为24±2°C，培养时间为72-96h;待苜蓿种子萌发后，即可作为转 化受体材料待用；
[0012] (2)携带外源基因的农杆菌培养及注射式转化：
[0013] 挑取含有质粒的农杆菌单菌落接种于含50mg?L^an和20mg?LiRif的LB液体 培养基中，置入摇床，28°C，220rpm振荡暗培养至菌液浓度达到0D600为0. 8-1. 0, 3000rpm 离心lOmin，收集菌体；加入50mlMS液体培养基重悬浮，用于转化；将步骤（1)获得的转化 受体材料转至铺设无菌滤纸的无菌玻璃培养皿中，利用无菌微型注射器吸取携带外源基因 的农杆菌菌液向子叶基部刺入并推进菌液即完成浸染；
[0014] (3)共培养及脱菌：
[0015] 取步骤（2)得到的注射携带外源基因农杆菌的苜蓿萌发种子，置于铺设无菌滤纸 的MS培养基中，暗培养2d，温度为24±2°C;共培养结束后，将转化后的萌发种子转至无菌 三角瓶中，用无菌水清洗后，再用无菌滤纸吸干子叶及胚轴、胚根上的水分；
[0016] (4)抗性植株的获得：
[0017] 将得到的苜蓿萌发种子置于筛选培养基中培养20-30d，获得抗性植株；其中筛选 培养基为含有〇? 〇5mg?LiNAAJOmg?LiKaruSOOmg?Ltef的1/2MS固体培养基；光照条 件为光照16h/黑暗8h，培养温度为24±2°C;
[0018] (5)转基因植株的获得：
[0019] 当步骤⑷得到的抗性植株叶片长至7-8片，根长为5-8cm时，剪切枝条扦插至步 骤（4)中的筛选培养基中，待植株生根，剪切叶片经PCR和RT-PCR检测，携带选择标记基因 及外源基因的整合和表达为转基因植株。
[0020] 步骤（1)中苜蓿种子萌发程度为：种子萌发至胚已突破种皮，出现肉眼可见的胚 根与子叶，子叶颜色为黄色至黄绿色，子叶基部至胚根顶端长度为〇. 6-1.Ocm。
[0021] 步骤（2)中农杆菌为含有选择标记基因NPTII以及目的基因的根癌农杆菌菌株。
[0022] 步骤（2)中农杆菌菌液浓度为0D_0. 8-1. 0,注射部位为沿子叶基部至胚根方向 约1-2_处；所使用的无菌微型注射器规格为lml，针头规格为4. 5号。
[0023] 步骤（3)中用无菌水清洗具体是指使用含500mg?Ltef的无菌水对转化受体清 洗2_3次。
[0024]本发明方法的操作相对简单、无需昂贵的仪器及工具；利用萌发种子作为受体，不 受基因型的限制，取材方便，避开了严格的组织培养过程；此外本发明的转化方法浸染时间 短、转化周期也大大缩短，与其他的农杆菌介导苜蓿转化方法相比，具有显著的优势，可在 苜蓿基因工程育种中推广与应用。
【附图说明】
[0025] 附图1为质粒pCambia2300-HaBADH的物理图谱；
[0026] 附图2为转化受体的苜蓿种子萌发中后期形态图；
[0027] 附图3为转化受体浸染后共培养图；
[0028] 附图4为筛选培养图（筛选培养5d，图中绿色植株为经选择压力筛选后的抗性植 株）；
[0029] 附图5为筛选培养图（筛选培养后10d，图中绿色植株为经选择压力筛选后的抗性 植株）；
[0030] 附图6为苜蓿转基因植株标记基因NPTII的PCR检测图，其中，M为2000bpDNA ladderMaker; 1-20为部分转基因植株；P为阳性质粒pCambia2300-HaBADH;N为未转化植 株；
[0031] 附图7为苜蓿转基因植株目的基因HaBADH的PCR检测图，其中，M为2000bpDNA ladderMaker;P为阳性质粒pCambia2300_HaBADH;N为未转化植株；1_15为部分阳性株 系；
[0032] 附图8为苜蓿转基因植株内参基因六(^111的1^0?检测图，其中^为200(^口0嫩 ladderMaker; 1-4为部分阳性植株；N为阴性对照；
[0033] 附图9为转基因植株目的基因HaBADH的RT-PCR检测图，其中，M为2000bpDNA ladderMaker;P为阳性质粒pCambia2300-HaBADH(显示为1500bp条带）；N为未转