专利名称：：毛白杨的遗传转化方法
技术领域：
：本发明属于基因工程
技术领域：
，具体地说是涉及毛白杨的遗传转化方法。
背景技术：
：杨树是世界上广泛栽培的重要造林树种之一。杨树具有速生优质，轮伐期短，适应性强，繁殖容易，用途广泛等特点。杨树是世界上许多国家和我国重要的造林绿化树种，也是生态防护林的主要树种。它还是制浆造纸、胶合板、包装材料等的重要工业原料(张绮纹等1999)。与其它林木相比，杨树生长快。易于无性繁殖，遗传转化容易，已构建较饱和的各种连锁图，获得大量与目标性状相关的分子标记。最近，由美国橡树岭国家实验室和能源部联合基因组研究所完成了毛果杨全基因组测序草图，发现在19条染色体上有4万5千个基因(Tuskan等2006)。杨树的这些特点，使其成为研究多年生植物重要的模式植物(Brunner等2004)。毛白杨是我国特有的乡土树种，遍布于我国黄淮海流域100多万平方公里的10多个省、市、自治区。毛白杨生长迅速，适应性强，纤维较长，材质优良、树干高大通直，树形美观，是民用、建筑、家具用材和纤维工业的重要原料，也是杨属中最适于作为纸浆材原料的优良树种之一(李科友，樊军锋，赵忠，李玲.中国农学通报，2007,23:171-175)。但是由于生长周期长、树体高大，异花授粉和杂交不亲和性等原因，极大地限制了杨树传统育种工作的开展。植物基因工程的兴起，为毛白杨遗传改良提供了新的途径。通过植物遗传转化将外源基因引入到植物细胞并使其稳定地遗传和表达，从而获得新的生物学性状，开辟了毛白杨育种的新途径(何承忠，张志毅，安新民，李善文.西南林学院学报，2006，28:86-89)。毛白杨遗传转化的研究是基因工程育种的基础，前人己经进行了一些研究，建立了毛白杨遗传转化体系(王善平，许智宏，卫志明.植物学报，1990，32(3):172-177;卜学贤，林忠平，陈维伦.植物学报，1991，33:206-213;郑均宝，张玉满，杨文芝.河北农业大学学报，1999，3:20-25;郝贵霞，朱祯，朱之悌.植物学报，1999，41:936-940;YangCL,ZuGC,ZhaoSM.DevBiol,2001,10:61-68;李科友，樊军锋，赵忠，李玲2007，中国农学通报,7:171~175)。但是上述的研究成果只能将单一的转化子(既包含外源基因的植物表达载体)导入到毛白杨中。由于植物的多数性状如产量、品质等是由多基因控制，仅靠改变其中的某一基因很难达到改良性状的目的，所以多基因转化策略是植物遗传改良研究的主要方向(李宝健和朱华晨，2005，中山大学学报，4:79~83)。二次转化(retransformation)可以实现两个或多个外源基因导入受体植物中，是进行遗传改良和功能基因研究的有效手段(Halpin,2005，PlantBiotechnolJ，3:141-155)。目前已经在烟草、马铃薯、拟南芥、连翘等植物的遗传改良中得到应用(Halpin,2005，PlantBiotechnolJ,3:141-155)。Qi等(2004)采用二次转化手段将负责合成长链不饱和脂肪酸的三个基因转化到拟南芥中，获得了富含0mega-3和0mega-6的转基因植物。采用二次转化方法将两个乙二醛酶基因导入到烟草中，获得了比转化单个乙二醛酶基因具有更高抗盐特性的转基因植物(Singla-pareek等2003)。但是由于所采用的质粒不同，抗生素的筛选等各种因素都不一样，无法将这种二次转化方法直接应用到毛白杨中；现有的毛白杨一次转化方法也无法直接推导得到毛白杨的二次遗传转化方法。
发明内容本发明的目的是提供一种农杆菌介导的毛白杨的遗传转化方法，以实现多基因导入毛白杨，为林木遗传改良提供一个新的途径。本发明的目的是这样实现的一种毛白杨的遗传转化方法，其特征在于采用农杆菌介导的方法对毛白杨进行两次遗传转化，导入两个外源基因；其中一次转化采用包含有新霉素磷酸转移酶基因NptII(即卡拉霉素抗性基因)和e-葡糖醛酸糖酶基因(即可以进行GUS组织染色)的植物双元表达载体，并且以卡拉霉素作为抗生素；二次转化采用包含有潮霉素磷酸转移酶基因(即潮霉素抗性基因)的植物双元表达载体，并且以潮霉素作为抗生素；上述的植物双元表达载体均可按常规分子克隆方法获得。其中上述一次转化所用的植物双元表达载体优选为p5-GhGA20oxl质粒、pCAMBIA质粒或pZIP质粒；所述二次转化所用的植物双元表达载体优选为p5-GhDET2-Hpt质粒或pCAMBIA1301质粒。上述一次转化所用的植物双元表达载体进一步优选为p5-GhGA20oxl质粒；上述二次转化所用的植物双元表达载体进一步优选为p5-GhDET2-Hpt质粒。一次转化所用的农杆菌菌液的配制方法为将含所述一次转化所用的植物双元表达载体的农杆菌菌株LBA4404接种到含有卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上；28'C条件下培养4050小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含有卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜，获得菌液浓度OD600值达到0.41的农杆菌菌液；二次转化所用的农杆菌菌液配制方法为将含有所述二次转化所用的植物双元表达载体的农杆菌菌株LBA4404接种到含有潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上，28'C条件下培养4050小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含有潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜，获得菌液浓度OD600值达到0.41的农杆菌菌液。为了增加上述的一次转化和二次转化所用的农杆菌菌液的活性，提高农杆菌的侵染能力，提高转化效率，在挑取农杆菌单菌落，接种于YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜之后，再取培养过夜的农杆菌菌液按1:25100的比例转接到添加500pg/L终浓度的乙酰丁香酮液体YEB培养基中，进行二次活化培养35小时，获得菌液浓度OD6oo值达到0.41的农杆菌菌液。上述一次转化具体步骤为取毛白杨叶片在二氯化汞中灭菌后，用无菌水冲洗并制成毛白杨叶盘；用上述农杆菌菌液浸泡毛白杨叶盘后，依次进行共培养、愈伤诱导培养、分化培养，具体操作为将共培养后的叶盘组织转移到愈伤诱导培养基上黑暗条件下使用卡那霉素(Km)进行筛选培养，等到叶片周围生长出白色愈伤，将白色愈伤切下，继代到分化培养基上在光下诱导出抗性芽；然后对抗性芽进行GUS基因组织染色(GUS基因组织染色结果见图l)，确定转基因抗性芽；等转基因抗性芽形成时，沿基部切下，进行生根培养得到一次转化抗性苗。上述GUS基因组织染色按照Jefferson等(1987)方法进行检测。上述二次转化具体步骤为将一次转化得到的抗性苗叶片在二氯化汞中灭菌后，用无菌水冲洗，并制成叶盘；用上述农杆菌菌液浸泡上述叶盘后，依次进行共培养、愈伤诱导培养、分化培养，具体操作为将共培养后的叶盘组织转移到愈伤诱导培养基上黑暗条件下使用潮霉素(Hyg)进行筛选培养，等到叶片周围生长出白色愈伤，将白色愈伤切下，继代到分化培养基上在光下诱导出抗性芽；等抗性芽形成时，沿基部切下，进行生根培养得到含两个外源基因的毛白杨植株。发明人经过大量的研究试验得出，采用如下培养基能够得到更好地效果上述的一次转化中共培养培养基由WPM基本培养基、萘乙酸(NAA)0.51.5mg/L和玉米素(ZT)1.52.5mg/L组成；上述愈伤诱导培养基由WPM基本培养基、萘乙酸(NAA)0,51.5mg/L、玉米素(ZT)1.52.5mg/L、卡那霉素(Km)2030mg/L和特美汀(英文名称timentin)(Tm)150400mg/L组成；上述分化培养基由WPM基本培养基、玉米素(ZT)1.52.5mg/L、卡那霉素(Km)2030mg/L和特美汀(Tm)150400mg/L组成；上述生根培养基由WPM基本培养基、萘乙酸(NAA)0.51.5mg/L、卡那霉素(Km)2030mg/L和特美汀(Tm)150400mg/L组成；其中WPM为木本植物的基本培养基;上述二次转化中共培养培养基由WPM基本培养基和萘乙酸(NAA)0.51.5mg/L、玉米素(ZT)1.52.5mg/L组成；上述愈伤诱导培养基由WPM基本培养基和萘乙酸(NAA)0.51.5mg/L、玉米素(ZT)1.52.5mg/L、潮霉素(Hyg)23mg/L、特美汀(Tm)150400mg/L组成；上述分化培养基由WPM基本培养基和玉米素(ZT)1.52.5mg/L、潮霉素(Hyg)23mg/L、特美汀(Tm)150400mg/L组成；上述生根培养基由WPM基本培养基和萘乙酸(NAA)0.51.5mg/L、潮霉素(Hyg)23mg/L、特美汀(Tm)150400mg/L组成。一次转化和二次转化中，所述的二氯化汞为0.050.15g/L，灭菌时间优选为815分钟，毛白杨叶盘为14平方厘米；上述农杆菌菌液浸泡叶盘的时间为520分钟；上述抗性芽形成是指抗性芽生长到23厘米；上述共培养条件优选为黑暗条件下共培养13天；上述生根培养过程优选在2426'C，16小时光照/8小时黑暗光周期，15002000Lx光照强度的培养室中进行。为了获得更好的效果，上述方案的参数进一步优选为一次转化和二次转化中，二氯化汞为0.1g/L，灭菌时间为10分钟；农杆菌菌液浸泡叶盘时间为10分钟；农杆菌菌液配制方法中将农杆菌菌株LBA4404接种到YEB固体培养基平板上培养48小时；农杆菌二次活化培养中农杆菌菌液按l:50的比例转接到所述的YEB培养基中；一次转化中所述共培养培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L;所述愈伤诱导培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L，卡那霉素浓度为25mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述分化培养基中玉米素浓度为2mg/L，卡那霉素浓度为25mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述生根培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，卡那霉素浓度为25mg/L，特美汀浓度为200mg/L;二次转化中所述共培养培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L;所述愈伤诱导培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L，潮霉素浓度为2.5mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述分化培养基中玉米素浓度为2mg/L，潮霉素浓度为2.5mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述生根培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，潮霉素浓度为2.5mg/L，特美汀浓度为200mg/L。上述p5-GhGA20oxl质粒构建方式参见JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology2006,32(5):563569。上述p5-GhDET2-Hpt载体是基于p5-GhDET2载体上构建的，p5-GhDET2载体已经在ThePlanUournal，2007，51(3):419430引用。p5-GhDET2-Hpt构建方法是首先扩增出35S-HptlI-nos片段，以质粒pCAMBIA1305为模版，根据35S-HptlI-nos片段上35S上游序列和nos下游序列设计上下游引物Hl和P2，分另lj是Hl:5'-CAAGCTTGAAAATGGCCTCCGATCAGAC-3'，P2:5'-CAAGCTTGACCATGTCATTAACGCCCAC-3'。下划线是Mmim酶切位点。采用25pl的扩增体系，添加10倍PCR反应缓冲液2.5pL，MgCl2(25mmol/L)1.5|aL，dNTP(2.5mmol/L)2.0pL，引物Hl(5)Limol4iL)lpL，引物H2(5pmol/nL)lpL，pCAMBIA1305质粒模板10ng，TaqDNA聚合酶1U，加蒸馏水补充至25^1。PCR扩增程序为在94'C变性5分钟，一个循环；94'C变性1分钟，6(TC退火45秒，72'C延伸2分钟，进行35循环；最后72'C延伸10分钟。将PCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，获得35S-HptlI-nos片段，用ffiwdm内切酶酶切，连接到己经用///"dill内切酶酶切过的pSH-GhDET2载体上。这样就构建好了pSH-GhDET2-Hpt。为了验证p5-GhGA20oxl质粒中的外源基因GA20-氧化酶基因和p5-GhDET2-Hpt质粒中的外源基因油菜素内酯合成酶基因DET2已经转化到毛白杨基因组上，以抗潮霉素的植株基因组DNA为模板，PCR扩增GA20-氧化酶基因和油菜素油菜素内酯合成酶基因DET2。首先取毛白杨抗性苗幼叶0.51克，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL65t:预热的CTAB(溴代十六垸基三甲胺)提取液，快速振荡混匀。65。C水浴30分钟，用等体积的氯仿和异戊醇配制液抽提1次，取上清，加入2/3倍体积的预冷异丙醇，混匀，静置约30分钟，用玻棒挑出絮状沉淀，用75%的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于500iaLTE中。加入1nLRNA酶(10mg'ml/1)，37。C处理1小时。再用等体积酚、氯仿、异戊醇配制液和等体积氯仿、异戊醇配制液各抽提l次，取上清，无水乙醇沉淀。沉淀用75%的乙醇漂洗，风干，溶于200pLTE中，-20°。保存备用。按照p5-GhDET2-Hpt载体上油菜素内酯合成酶基因DET2序列设计上下游引物Pl和P2，引物序列分别是Pl5'-CTCTATTTCTTTGCCCTCGG-3';P25'-AAAGCCTGAACTCACCGCGA-3'。根据p5-GhGA20oxl载体上的GA20-氧化酶基因序列设计上下游引物P3和P4，其引物序列分别是P35'-GGCATTCAGTCTGGATCGCGAA-3';P45'-CCGAAATTGGAGAGAAATCCG-3'。以抗Hyp的植株基因组DNA为模板，Pl、P2和P3、P4为引物扩增油菜素内酯合成酶基因片段和GA20-氧化酶基因片段。反应条件为在94'C下5分钟扩增1个循环；在94'C下30秒，在60"C下45秒，72'C下1分钟，进行40个循环；最后72'C下进行10分钟。PCR反应结束后在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。图2结果显示20-氧化酶基因预期扩增出1000bp片段，油菜素内酯合成酶基因DET2预期扩增出750bp片段。电泳结果表明抗Hyp的44株植株中有34株既扩增出了油菜素油菜素内酯合成酶基因DET2，同时也扩增出了GA20-氧化酶基因，表明使用23mgL"Hyp可以有效的进行二次转化，转化率达60.7%。图l第一次转化毛白杨株系GUS基因组织染色，结果发现GUS基因在转基因植株根、茎和叶都强烈表达，表明质粒p5-GhGA20oxl已经转化到毛白杨中。a:茎的GUS基因染色；b:根的GUS基因染色；C:叶的GUS基因染色。图2二次转化毛白杨植株GA20-氧化酶基因和油菜素内酯合成酶基因DET2的基因组PCR检测。其中M:DNA标准分子量；Pl:p5-GhGA20oxl和p5-GhDET2-Hpt的混合质粒，作为阳性对照；Cl:第一次转化的毛白杨24号株系；144:二次转化株系。图3毛白杨叶片对卡那霉素(Km)的敏感性。图4毛白杨叶片对潮霉素(Hyg)的敏感性。有益效果1、由于植物的多数性状如产量、品质等是由多基因控制，仅靠改变其中的某一基因很难达到改良性状的目的，发明人经过大量的研究试验，筛选出了适合毛白杨二次遗传转化的两种抗生素有效筛选浓度，建立了毛白杨高效二次遗传转化体系，可以有效的将两个外源基因导入到毛白杨中，可以达到更好地改良植物性状的目的。2、发明人通过实验发现，农杆菌菌液配制过程中，没有添加乙酰丁香酮(AS)时转化频率较低，加入500吗U1的AS时，转化频率显著提高；本发明通过添加乙酰丁香酮，使得农杆菌介导频率显著提高。3、发明人通过大量的试验筛选出优化的培养基和培养条件，其中每次转化单独与现有的一次转化方法相比，比现有的农杆菌介导毛白杨基因转化方法的转化效率高出很多；本发明方法是一种高效率的转化方法。具体实施方式从以下说明性实施例将进一步理解本发明。实施例1一种毛白杨的遗传转化方法，其具体实施步骤如下-a、取毛白杨的健康叶片，在浓度为0.1g/l的二氯化汞中灭菌10分钟，然后用无菌水冲洗4次，再将无菌叶片切成面积为1平方厘米的毛白杨叶盘；b、将含p5-GhGA20oxl质粒的农杆菌菌株LBA4404接种到附加卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上；28。C条件下培养48小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28°〇振荡培养过夜，获得菌液浓度OD600值达到0.6的农杆菌菌液；c、将a步骤所得的毛白杨叶盘浸入到b步骤所得的菌液中，浸泡10分钟后，将所述叶盘转移到共培养培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L组成)上；-黑暗条件下共培养2天；然后把所述叶盘组织转移到愈伤诱导培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L、卡那霉素25mg/L、特美汀200mg/L组成)上黑暗条件下使用卡那霉素进行筛选培养，等到叶片周围生长出白色愈伤，将白色愈伤切下，继代到分化培养基(WPM基本培养基和玉米素2mg/L、卡那霉素25mg/L、特美汀200mg/L组成)上在光下诱导出抗性芽；d、对抗性芽进行GUS基因组织染色，确定转基因抗性芽；等到抗性芽生长到2厘米时，沿基部切下，转移到生根培养基(生根培养基是由WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、卡那霉素25mg/L、特美汀200mg/L组成)上诱导生根；生根培养过程是在2426°C，16小时光照/8小时黑暗光周期，15002000Lx光照强度的培养室中进行；e、将含有p5-GhDET2-Hpt质粒的农杆菌菌株LBA4404接种到附加潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上，28'C条件下培养48小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜，获得菌液浓度OD600值达到0.8的农杆菌菌液；f、取步骤d获得的抗性苗叶片，切成l平方厘米的叶盘。浸入到步骤e所得的菌液中，浸泡10分钟后，将所述叶盘转移到共培养培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L组成)上，黑暗条件下共培养2天；然后把所述叶盘组织转移到愈伤诱导培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L、潮霉素2.5mg/L、特美汀200mg/L组成)上黑暗条件下使用潮霉素进行筛选培养，等到叶片周围生长出白色愈伤，将白色愈伤切下，继代到分化培养基(WPM基本培养基和玉米素2mg/L、潮霉素2.5mg/L、特美汀200mg/L组成)上在光下诱导出抗性芽；g、等到抗性芽生长到3厘米时，沿基部切下，转移到生根培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、潮霉素2.5mg/L、特美汀200mg/L组成)上诱导生根；生根培养过程是在2426。C，16小时光照/8小时黑暗光周期，15002000Lx光照强度的培养室中进行。实施例24一种毛白杨的遗传转化方法，其实施步骤同实施例l，所不同的是，实施例2中一次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA，二次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA1301;实施例3中一次转化所用的植物双元表达载体为pZIP，二次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA1301;实施例4中一次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhGA20oxl，二次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA1301;具体参数见表1。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5一种毛白杨的遗传转化方法，其具体实施歩骤如下a、取毛白杨的健康叶片，在浓度为0.1g/L的二氯化汞中灭菌10分钟，然后用无菌水冲洗4次，再将无菌叶片切成面积为1平方厘米的毛白杨叶盘；b、将含p5-GhGA20oxl质粒的农杆菌菌株LBA4404接种到附加卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上；28'C条件下培养48小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜；取培养过夜的农杆菌菌液按1:50的比例转接到添加500^g/L终浓度的乙酰丁香酮液体YEB培养基中，二次活化培养3~5小时，获得菌液浓度OD600值达到0.6的农杆菌菌液；c、将a步骤所得的毛白杨叶盘浸入到b步骤所得的菌液中，浸泡10分钟后，将所述叶盘转移到共培养培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L组成)上；黑暗条件下共培养2天；然后把所述叶盘组织转移到愈伤诱导培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L、卡那霉素25mg/L、特美汀200mg/L组成)上黑暗条件下使用卡那霉素进行筛选培养，等到叶片周围生长出白色愈伤，将白色愈伤切下，继代到分化培养基(WPM基本培养基和玉米素2mg/L、卡那霉素25mg/L、特美汀200mg/L组成)上在光下诱导出抗性芽；d、对抗性芽进行GUS基因组织染色，确定转基因抗性芽；等到抗性芽生长到2厘米时，沿基部切下，转移到生根培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、卡那霉素25mg/L、特美汀200mg/L组成)上诱导生根；生根培养过程是在2426°C，16小时光照/8小时黑暗光周期，15002000Lx光照强度的培养室中进行；e、将含有p5-GhDET2-Hpt质粒的农杆菌菌株LBA4404接种到附加潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上，28"C条件下培养48小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜;取培养过夜的农杆菌菌液按1:50的比例转接到添加终浓度为500pg/L的乙酰丁香酮液体YEB培养基中，二次活化培养35小时，获得菌液浓度OD600值达到0.8的农杆菌菌液；f、取步骤d获得的抗性苗叶片，切成l平方厘米的叶盘。浸入到步骤e所得的菌液中，浸泡10分钟后，将所述叶盘转移到共培养培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L组成)上，黑暗条件下共培养2天；然后把所述叶盘组织转移到愈伤诱导培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、玉米素2mg/L、潮霉素2.5mg/L、特美汀200mg/L组成)上黑暗条件下使用潮霉素进行筛选培养，等到叶片周围生长出白色愈伤，将白色愈伤切下，继代到分化培养基(WPM基本培养基和玉米素2mg/L、潮霉素2.5mg/L、特美汀200mg/L组成)上在光下诱导出抗性芽；.g、等到抗性芽生长到3厘米时，沿基部切下，转移到生根培养基(WPM基本培养基和萘乙酸lmg/L、潮霉素2.5mg/L、特美汀200mg/L组成)上诱导生根；生根培养过程是在2426。C，16小时光照/8小时黑暗光周期，15002000Lx光照强度的培养室中进行。实施例68一种毛白杨的遗传转化方法，其实施步骤同实施例l，所不同的是，实施例6中一次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA，二次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA1301;实施例7中一次转化所用的植物双元表达载体为pZIP，二次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhDET2-Hpt;实施例8中一次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhGA20oxl，二次转化所用的植物双元表达载体为pCAMBIA1301;具体参数见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例9通过毛白杨再生培养筛选最优培养基在进行毛白杨转化之前，我们首先做了激素基本培养基配比对毛白杨再生的影响，通过筛选最佳的培养基配比，获得最大的再生频率，为提高毛白杨转化频率奠定基础。在实验中，我们选择了六种培养基配比见表3表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注释NAA为萘乙酸；ZT为玉米素；6-BA为6-苄氨基嘌呤；2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸；IBA为吲哚丁酸；IAA为吲哚乙酸。通过比较六种培养基对毛白杨再生频率的影响，我们选择了WPM1培养基作为后续的转化研究培养基。实施例10卡那霉素(Km)抗生素选择压的确定。将毛白杨的叶片置于附加不同浓度Km的WPM1培养基内，检测叶片对Km的敏感性。如图3所示，毛白杨对Km较为敏感，在添加25mgL"Km的培养基上，叶片不形成愈伤并逐渐褐化，经过40d的筛选，叶片的成活率只有2%。而在超过50mgL"Km的培养基上，40d筛选后叶片全部褐化死亡。根据结果采用25mgL"的Km作为第一次转化的筛选浓度。实施例11潮霉素(Hyg)抗生素选择压的确定。为了进行二次转化，将GUS染色呈阳性的转基因毛白杨叶片置于附加不同浓度Hyp的WPM1培养基内，检测叶片对Hyp的敏感性。如图4所示，毛白杨对Hyp更为敏感，在添加2.5mgL"Hyp的培养基上，叶片不生长出愈伤，并逐渐褐化死亡，经过40d的筛选，叶片的成活率只有4%。而在超过3mgL"Hyp的培养基上，40d的筛选后叶片全部褐化死亡。所以在二次转化时，采用2.5mgL"Hyp作为筛选浓度。实施例12乙酰丁香酮(AS)对转化频率的影响转化频率是指GUS阳性不定芽数量占全部外植体数的百分比。乙酰丁香酮(AS)是植物遗传转化中被广泛使用的一种转化促进剂。为确定AS对毛白杨转化的影响，实验采用附加25mgL"Km的WPM1培养基，用0、100、500、800L—1四个浓度的AS活化农杆菌菌液，经过共培养，愈伤诱导和不定芽诱导培养，获得抗Km的不定芽。由于pIG121载体上含有GUS报告基因，可以方便的使用GUS组织染色来验证转基因植物。结果如表2，AS对转化频率有显著影响，100pgL"的AS可以使转化频率比对照提高15%，而500吗I/1的AS可使转化频率提高23%。但是更高的AS浓度并没有进一步提高转化频率。所以我们选择500ngL—1的AS作为后续的转化毛白杨的浓度。表4AS对转化频率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>权利要求1、一种毛白杨的遗传转化方法，其特征在于采用农杆菌介导的方法对毛白杨进行两次遗传转化导入两个外源基因；其中一次转化采用包含有新霉素磷酸转移酶基因NptII和β-葡糖醛酸糖酶基因的植物双元表达载体，并且以卡拉霉素作为抗生素；二次转化采用包含有潮霉素磷酸转移酶基因的植物双元表达载体，并且以潮霉素作为抗生素。2、根据权利要求l所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于所述一次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhGA20oxl质粒、pCAMBIA质粒或pZIP质粒；所述二次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhDET2-Hpt质粒或pCAMBIA1301质粒。3、根据权利要求2所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于所述一次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhGA20oxl质粒；所述二次转化所用的植物双元表达载体为p5-GhDET2-Hpt质粒。4、根据权利要求3所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于所述一次转化所用的农杆菌菌液的配制方法为将含所述一次转化所用的植物双元表达载体的农杆菌菌株LBA4404接种到含有卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上；28'C条件下培养4050小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含有卡那霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜，获得菌液浓度OD600值达到0.41的农杆菌菌液；所述二次转化所用的农杆菌菌液配制方法为将含有所述二次转化所用的植物双元表达载体的农杆菌菌株LBA4404接种到含有潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB固体培养基平板上，28。C条件下培一4050小时后；挑取农杆菌单菌落，接种于含有潮霉素50mg/L和链霉素125mg/L的YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜，获得菌液浓度OD600值达到0.41的农杆菌菌液。5、根据权利要求4所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于所述的一次介导和二次介导的农杆菌菌液配制方法中，在挑取农杆菌单菌落，接种于YEB液体培养基中，28'C振荡培养过夜之后，再取培养过夜的农杆菌菌液按1:25100的比例转接到添加500pg/L终浓度的乙酰丁香酮液体YEB培养基中，进行二次活化培养35小时，获得菌液浓度OD,值达到0.41的农杆菌菌液。6、根据权利要求4或5所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于所述一次转化步骤为取毛白杨叶片在二氯化汞中灭菌后，用无菌水冲洗并制成毛白杨叶盘；用所述农杆菌菌液浸泡所述叶盘后，依次进行共培养、愈伤诱导培养、分化培养得到抗性芽；对抗性芽进行GUS组织染色，确定转基因抗性芽；等转基因抗性芽形成时，沿基部切下，进行生根培养得到一次转化抗性苗；所述二次转化步骤为将一次转化得到的抗性苗叶片在二氯化汞中灭菌后，用无菌水冲洗并制成叶盘；用所述农杆菌菌液浸泡所述叶盘后，依次进行共培养、愈伤诱导培养、分化培养得到抗性芽；等抗性芽形成时，沿基部切下，进行生根培养得到含两个外源基因的毛白杨植株。7、根据权利要求6所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于所述的一次转化中共培养培养基由WPM基本培养基、萘乙酸0.51.5mg/L和玉米素1.52.5mg/L组成；愈伤诱导培养基由WPM基本培养基、萘乙酸0.51.5mg/L、玉米素1.52.5mg/L、卡那霉素2030mg/L和特美汀150400mg/L组成；分化培养基由WPM基本培养基、玉米素1.52.5mg/L、卡那霉素2030mg/L和特美汀150400mg/L组成；生根培养基由WPM基本培养基、萘乙酸0.51.5mg/L、卡那霉素2030mg/L和特美汀150400mg/L组成；所述二次转化中共培养培养基由WPM基本培养基、萘乙酸0.51.5mg/L和玉米素1.52.5mg/L组成；愈伤诱导培养基由WPM基本培养基、萘乙酸0.51.5mg/L、玉米素1.52.5mg/L、潮霉素23mg/L和特美汀150400mg/L组成；分化培养基由WPM基本培养基、玉米素1.52.5mg/L、潮霉素23mg/L和特美汀150400mg/L组成；生根培养基由WPM基本培养基、萘乙酸0.51.5mg/L、潮霉素23mg/L和特美汀150400mg/L组成。8、根据权利要求7所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于一次转化和二次转化中，所述的二氯化汞为0.050.15g/L，灭菌时间为815分钟，毛白杨叶盘为14平方厘米；所述农杆菌菌液浸泡叶盘时间为520分钟；所述抗性芽形成是指抗性芽生长到23厘米；所述共培养为黑暗条件下共培养13天；所述生根培养过程是在2426°C，16小时光照/8小时黑暗光周期，15002000Lx光照强度的培养室中进行。9、根据权利要求8所述的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于一次转化和二次转化中，所述二氯化汞为0.1g/L，灭菌时间为10分钟；所述农杆菌菌液浸泡叶盘时间为10分钟；所述农杆菌菌液配制方法中将农杆菌菌株LBA4404接种到YEB固体培养基平板上培养48小时；所述农杆菌二次活化培养中农杆菌菌液按1:50的比例转接到所述的YEB培养基中；一次转化中所述共培养培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L;所述愈伤诱导培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L，卡那霉素浓度为25mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述分化培养基中玉米素浓度为2mg/L，卡那霉素浓度为25mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述生根培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，卡那霉素浓度为25mg/L，特美汀浓度为200mg/L;二次转化中所述共培养培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L;所述愈伤诱导培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，玉米素浓度为2mg/L，潮霉素浓度为2.5mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述分化培养基中玉米素浓度为2mg/L，潮霉素浓度为2.5mg/L，特美汀浓度为200mg/L;所述生根培养基中萘乙酸浓度为lmg/L，潮霉素浓度为2.5mg/L，特美汀浓度为200fng/L。全文摘要本发明提供一种农杆菌介导的毛白杨的遗传转化方法，其特征在于采用农杆菌介导的方法对毛白杨进行两次遗传转化导入两个外源基因；其中一次转化采用包含有新霉素磷酸转移酶基因NptII和β-葡糖醛酸糖酶基因的植物双元表达载体，并且以卡拉霉素作为抗生素；二次转化采用包含有潮霉素磷酸转移酶基因的植物双元表达载体，并且以潮霉素作为抗生素。本发明方法可以有效的将两个外源基因导入到毛白杨中，以达到更好地改良植物性状的目的。文档编号A01H5/00GK101307323SQ200810069948公开日2008年11月19日申请日期2008年7月9日优先权日2008年7月9日发明者吕立堂,义李,李正国,杨迎武,伟邓申请人:重庆大学