专利名称：猪颗粒型冻精的制备及解冻方法
技术领域：
本发明涉及一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法。
技术背景精液的冷冻保存在现代畜牧业中起着十分重要的作用。使用冷冻精液可 以不受时间、地域和公畜寿命的限制，减少公畜饲养数量，减低生产成本， 提高优良种畜的利用率，为畜牧业生产带来巨大的经济效益。同时，精液的 冷冻保存在品种改良、血缘更新、疾病控制和濒危动物品种保护上也具有极 其重要的意义。猪精液冷冻技术，从20世纪50年代开始以来，进展緩慢，在发达国家 猪冻精技术已基本可以应用于养猪业生产，但从世界范围内看，猪冻精技术 的应用还不够理想。该技术在我国猪的研究起步较晚，于1974年由广西壮族 自治区畜牧研究所首先研究成功。我国大规模开展猪冻精技术研究始于七十 年代，但由于效果不稳定、平均妊娠率较低(45%~50%)，始终未能在生产上 推广应用。主要问题是冷冻液、解冻液的组成不一致，输精量大，受精率 和产仔数比鲜精低，操作程序复杂，难以在生产中推广应用。同时，由于猪 精液冷冻具有潜在的巨大商业价值和重要的现实意义，因此，目前猪精液冷 冻仍是动物繁殖领域内研究的热点。 发明的内容本发明的目的是提供一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法。 为了实现本发明的目的，本发明的猪颗粒型冻精的制备及解冻方法包括 以下步骤1、猪精液的采集和常规检查采精前，先用0.1%高锰酸钾溶液纟寮拭公猪腹部，手握法采集猪富含精 子段精液于盖有四层消毒纱布的集精杯中。将采得猪精液于30分钟内带回实 验室，观察精液为乳白色，呈云雾状，嗅之略带腥味，镜检活率为0.7以上 者，可用于冷冻保存。2、 稀释液的配制由葡萄糖2. 0g、乳糖l.Og、甘氨酸O. 8g、柠檬酸钠0. 3g、蔗糖O. 5~ 4.0g、 SDSO. 1~0. 5g、咖啡因0. 0097 - 0. 1554g、青霉素和链霉素各100000IU 及蒸馏水lOOml配制成基础液，取80ml所述基础液加入20ml卵黄构成稀释 液I液，在lOOmlI液中加入3 ml的甘油为稀释液II液，所有液体配好后保存 在0 4。C备用；3、 精液的稀释与平衡将经检查合格的精液分装于10ml试管中，在35DC水浴中预孵育30~60 分钟后，以1000转/分离心IO分钟，弃上清液，按l: 1体积比加入稀释液I 液，混匀，使重悬浮的精子密度达(4~7) xlO'个/ml;用8层纱布将稀释精 液包裹好并放入4。C冰箱平衡2h;平衡结束后，再以1: 1加入稀释液II液(基 础液+20°/。卵黄+3°/。甘油)，充分混匀，再于4。C水箱继续平衡2h;4、 精液的冷冻和保存平衡时间结束后，将液氮倒入泡沫盒中，把带有凹窝的氟板放入盒内， 距液氮面2-3cm，调节氟板温度为-130°C ~-120°C，每个凹窝滴入O. lml精 液，迅速滴冻，氟板上的冻精颗粒在液氮蒸汽中熏蒸5~8min后，将氟板连 同冻精颗粒一起放入液氮内，并取出穿有长绳的消毒布袋放入液氮内预冷， 然后，用镊子将冻精颗粒从氟板上取下，装入布袋中，冻精颗粒的收集过程必 须在液氮中进行；冻精颗粒装好后，应在长绳的末端栓上标签，记录好精液 的相关信息，然后移入液氮罐长期保存；5、 冷冻精液的解冻1) 、解冻液的配置葡萄糖5. Og、柠檬酸钠O. 5g、安钠咖(10。/。)5ml、青 霉素80000IU、链霉素100000IU及蒸馏水100ml;2) 、解冻方法将装在布袋中的冻精颗粒从液氮中取出，在空气中停留 20s后迅速放入42。C水浴预热的解冻液中，摇晃试管8s促进精液和解冻液的 充分混合。解冻液的添加量为lml解冻液/每粒冻精，置于室温下备用。6、冷冻精液的品质评定方法和判定指标精液解冻后，对其进行活力、顶体完整率、弯尾率、畸形率、复苏率及 存活时间的检测，综合评价其质量。具体4喿作如下1)、活力^r测精液解冻后，置于室温下放置3~5分钟，取50ul精液滴于37。C预热的 载玻片上，迅速盖上盖玻片，在显微镜下观察呈直线运动的精子所占百分率。 解冻后的活率不低于0.52。 2)、顶体完整率精子解冻后的顶体完整率主要采用考马斯亮蓝染色法评定。经考马斯亮 蓝染色后的精子呈蓝色着染，顶体不完整或缺失的精子其顶体部不着色，如 图3,图4-1和4-2所示。在1000 x油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200个精子，计算精子顶体完整率-顶体完整的精子数/ 计数总精子数。 3)、 畸形率精子解冻后畸形率主要采用用凡那他氏镀银染色法进行评定。如图1 -1、 1-2、 1-3所示为正常精子；图2-l、 2-2、 2-3、 2-4所示为畸形 精子。将制作好的标本置1000 x油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区 域，计数至少200个精子，计算精子畸形率-畸形精子数/计数总精子数。 4)、弯尾率用低渗肿胀实验测定解冻精子的弯尾率，即可检测精子的质膜完整率。 将精液与低渗液以1: 30的比例稀释后，置37。C水浴中孵育30-60rain。取 50ul低渗精液滴于血细胞计数板上，计数5个中方格中的精子总数和弯尾精 子数，两个计数室的结果相加计算平均数。弯尾率=弯尾数子数/计数总精子 数。5)、存活时间将解冻后的精液放入37。C水浴锅中，每间隔一个小时观测一次活率，当 活率下降到一半时，每隔0. 5h检查一次，直至活率为零，存活时间不低于 420min。与已有的技术相比，本发明的优点在于1. 鲜精经水浴平衡后直接离心，不用加入其它稀释液，减少操作步 骤，降低成本；2. 冻精的颗粒剂型操作筒单，取用方便；3. 顶体完整与否是精子能否受精的关键因素，传统的顶体染色方法 杂质较多，样^^r查看得不太清楚，采用考马斯亮蓝染色能克服这一问题， 且操作简单方便。4. 解冻液配方简单，易得，能起到精液解冻和解冻后保存的作用， 精液解冻后的存活时间不低于420min。
图l-l、 1-2、 l-3解冻后在1000倍油镜下观察的正常精子；图2-1、 2-2、 2-3 、 2-4分别为解冻后在1000倍油镜下观察的畸形精子；图3为解冻后在IOOO倍油镜下观察的顶体完整精子；图4 - 1和4 - 2为解冻后在1000倍油镜下观察的顶体部分和全部脱落精子。
具体实施方式
实施例1颗粒型冻精的制备1、 猪精液的采集和常规检查采精前，先用0.1%高锰酸钾溶液擦拭公 猪腹部，手握法采集猪富含精子段精液于盖有四层消毒纱布的集精杯中。将 采得猪精液于30分钟内带回实验室，观察精液为乳白色，呈云雾状，嗅之略 带腥味，镜检活率为O. 7以上者，可用于冷冻保存。2、 稀释液的配制葡萄糖2. Og、乳糖l.Og、蔗糖l. 5g、甘氨酸O. 8g、 柠檬酸钠0. 3g、 SDS 0. 25g、咖啡因0. 0971g、溶于100ml蒸馏水中为基础 液，青霉素和链霉素各1000IU/ml。取80ml基础液并加入20ml卵黄为I液， 在lOOmlI液中加入3ml的甘油为II液。所有液体配好后保存在0 ~ 4。C备用。 3、精液的稀释与平衡经检查合格的精液分装于10ml试管中，在35flC水浴 中预孵育30~ 60min后，以1000转/分离心10min，弃上清液，按1: 1加入 稀释液I液(基础液+20%卵黄)，混匀，使重悬浮的精子密度达(4-7) xio9 个/ml。用8层纱布将稀释精液包裹好并放入4。C冰箱平衡2h;平衡结束后， 再以1: 1加入II液(基础液+20%卵黄+3%甘油)，充分混匀，再于4。C水箱继续平衡2h。精液最终稀释比例为i : 3。4、精液的冷冻和保存平衡时间结束后，将液氮倒入泡沫盒中，把带有 凹窝的氟板放入盒内，距液氮面2 3cm，调节氟板温度为-130 -120°C。每 个凹窝滴入0. lml精液，迅速滴冻。氟板上的冻精颗粒在液氮蒸汽中熏蒸5 ~ 8min后，将氟板连同冻精颗粒一起放入液氮内，并取出穿有长绳的消毒布袋 放入液氮内预冷。然后，用镊子将冻精颗粒从氟板上取下，装入布袋中。冻精 颗粒的收集过程必须在液氮中进行。冻精颗粒装好后，应在长绳的末端栓上 标签，记录好精液的相关信息。制备完成，移入液氮罐长期保存。 实施例2冷冻精液的解冻1、 解冻液的配方葡萄糖5. Og、柠檬酸钠0. 5g、安钠咖(10W5ml、青 霉素和链霉素各100000IU、蒸馏水100ml。2、 解冻方法将装在布袋中的冻精颗粒从液氮中取出，在空气中停留20s 后迅速放入42。C水浴预热的解冻液中，摇晃试管8s促进精液和解冻液的充分 混合。解冻液的添加量为lml解冻液/每粒冻精，置于室温下备用。实施例3冷冻精液的品质评定方法和判定指标精液解冻后，对其进行活力、顶体完整率、弯尾率、畸形率、复苏率及 存活时间的检测，综合评价其质量。具体操作如下1、 活力检测精液解冻后，置于室温下放置3-5分钟，取50ul精液滴于42。C预热的 载玻片上，迅速盖上盖玻片，在显4敖镜下观察呈直线运动的精子所占百分率。 解冻后的活率不低于0.52。2、 顶体完整率精子解冻后的顶体完整率主要釆用考马斯亮蓝染色法评定。具体操作如下(1) 溶液的配制A. 称取50mg考马斯亮蓝R250溶于蒸馏水100 ml中，煮沸溶解，0. 45 jum滤膜过滤。B. 加入高氯酸3. 5ml(2) 染色步骤A. 染色前，先将染液置于37'C水浴锅中预热10 min;B. 取50ul解冻精液，滴于载玻片上，抹片、风干；C. 将精子涂片置于考马斯亮蓝-高氯酸染色液中浸染5 7min;染色后涂 片用自来水冲洗后吹干、封片，4竟检。(3)顶体完整率检查经考马斯亮蓝染色后的精子呈蓝色着染，顶体不完整或缺失的精子其顶 体部不着色。如图3 ，图4-l和4-2所示。在1000 x油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200个 精子，计算精子顶体完整率-顶体完整的精子数/计数总精子数。3、 畸形率精子解冻后畸形率主要采用用凡那他氏镀银染色法进行评定，如图1 -l、 1-2、 1-3所示为正常精子；图2-l、 2-2、 2 - 3 、 2 - 4所示为畸形精 子。具体操作如下(1) 染色液的配制A. 胡氏固定液福尔马林2 m 1 、醋酸lm 1 、蒸馏水1 0 0 m 1 ;B. 染色液单宁酸5 g、石炭酸l g、蒸馏水l 0 Om 1 ;C. 硝酸4艮溶液硝酸纟艮0. 25g 、蒸馏水1 0 0 m 1(2) 染色步骤A. 取50ul解冻精液，滴于载玻片上，抹片，风干后，将胡氏固定液滴 于玻片上，停lmin，自来水沖洗10s,滴干水分；B. 将染色液滴于玻片上，置酒精灯上加热至玻片上出现蒸汽为止，自来 水冲洗30s，滴干水分；C. 滴2 ~ 3滴硝酸银溶液于玻片上，同时滴加一滴氨水，左右摇晃玻片， 使硝酸银溶液与氨水充分混合，染液变为浑浊的黄褐色后，置酒精灯上慢慢 加热，经20~ 30s。D. 最后用自来水沖洗干净，风干，镜4佥。(3) 畸形率检查在1000 x油镜下检查，每张片选择左、中、右三个区域，计数至少200 个精子，计算精子畸形率-畸形精子数/计数总精子数。4、弯尾率用低渗肿胀实验测定解冻精子的弯尾率，即可检测精子的质膜完整率。(1) 低渗溶液的配制果糖O. 6756g、 二水柠檬酸钠0. 3676g,溶于50ml 双蒸水中。最终渗透压150mosm/kg(2) 操作步骤将精液低渗液为l:30的比例稀释后，置37。C水浴中孵 育30 — 60min。(3) 弯尾率检查取50ul精液滴于血细胞计数板上，计数5个中方格中的精子总数和弯 尾精子数，两个计数室的结果相加计算平均数。弯尾率=弯尾数子数/计数总 精子数5.存活时间将解冻后的精液放入42。C水浴锅中，每间隔一个小时观测一次活率，当 活率下降的一半时，每隔0. 5h检查一次，直至活率为零，存活时间不低于 420min。实施例4实施例1中稀释液的配制不同之处在于稀释液的配方为葡萄糖2. 0g 、乳糖1.0g、甘氨酸0. 8g、柠檬酸钠0. 3g、 蔗糖3. Qg、 SDS 0. 2g、咖啡因0. 0388g 、青霉素和链霉素各100000IU及蒸 馏水1G0ml。实施例5实施例1中稀释液的配制不同之处在于稀释液的配方为葡萄糖2. 0g、乳糖1. 0g、甘氨酸0. 8g、柠檬酸钠0. 3g、 蔗糖1.5g、 SDS 0. 25g、咖啡因0. 0188g、青霉素和链霉素各100000IU及蒸 馏水100ml。
权利要求
1、一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法，方法包括一下步骤1)、猪精液的采集和常规检查将采得猪精液于30分钟内带回实验室，镜检活率为0.7以上者，可用于冷冻保存；2)、稀释液的配制由葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、甘氨酸0.8g、柠檬酸钠0.3g、蔗糖0.5～4.0g、SDS0.1～0.5g、咖啡因0.0097～0.1554g、青霉素和链霉素各100000IU及蒸馏水100ml配制成基础液，取80ml所述基础液加入20ml卵黄构成稀释液I液，在100mlI液中加入3ml的甘油为稀释液II液，所有液体配好后保存在0～4℃备用；3)、精液的稀释与平衡将经检查合格的精液分装于10ml试管中，在35℃水浴中预孵育30～60分钟后，以1000转/分离心10分钟，弃上清液，按1∶1体积比加入稀释液I液，混匀，使重悬浮的精子密度达(4～7)×109个/ml；用8层纱布将稀释精液包裹好并放入4℃冰箱平衡2h；平衡结束后，再以1∶1加入稀释液II液(基础液+20％卵黄+3％甘油)，充分混匀，再于4℃冰箱继续平衡2h；4)、精液的冷冻和保存平衡时间结束后，将液氮倒入泡沫盒中，把带有凹窝的氟板放入盒内，距液氮面2～3cm，调节氟板温度为-130℃～-120℃，每个凹窝滴入0.1ml精液，迅速滴冻，氟板上的冻精颗粒在液氮蒸汽中熏蒸5～8min后，将氟板连同冻精颗粒一起放入液氮内，并取出穿有长绳的消毒布袋放入液氮内预冷，然后，用镊子将冻精颗粒从氟板上取下，装入布袋中，冻精颗粒的收集过程必须在液氮中进行；冻精颗粒装好后，应在长绳的末端栓上标签，记录好精液的相关信息，然后移入液氮罐长期保存；5)、冷冻精液的解冻A、解冻液的配置葡萄糖5.0g、柠檬酸钠0.5g、安钠咖(10％)5ml、青霉素80000IU、链霉素100000IU及蒸馏水100ml；B、解冻方法将装在布袋中的冻精颗粒从液氮中取出，在空气中停留20s后迅速放入42℃水浴预热的解冻液中，摇晃试管8s促进精液和解冻液的充分混合。解冻液的添加量为1ml解冻液/每粒冻精，置于室温下备用。
全文摘要
一种猪颗粒型冻精的制备及解冻方法，方法的步骤为猪精液的采集和常规检查、稀释液的配制、精液的稀释与平衡、精液的冷冻和保存、冷冻精液的解冻。本发明还涉及所述稀释液及解冻液的配制。与已有的技术相比，本发明的优点在于鲜精经水浴平衡后直接离心，不用加入其它稀释液，减少操作步骤，降低成本；冻精的颗粒剂型操作简单，取用方便；解冻液配方简单，易得，能起到精液解冻和解冻后保存的作用，精液解冻后的存活时间不低于420min。
文档编号A61D19/00GK101219074SQ20081006929
公开日2008年7月16日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者文 刘, 张凤鸣, 琴 李, 潘红梅, 王可甜, 王金勇, 白小青, 元 蔡, 谷山林, 陈四清, 麻常胜 申请人:重庆市畜牧科学院