专利名称：应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。
背景技术：
酶是一类具有催化活性的蛋白质，能够在温和的反应条件下高效、高选择性的催化复杂的化学反应。但是天然酶稳定性差、易失活、以及难回收再利用的缺陷阻碍了酶催化的发展和应用，而且在反应体系中分离和提纯酶也增加了其作为催化剂的成本。如果能够实现酶的固定化，将水溶性酶蛋白变为不溶性固体催化剂，不仅可以在一定程度上提高酶的稳定性、活性和专一性等性能，更重要的是能够轻易实现酶的回收再利用以及产物的分离提纯，保证酶催化在工业应用中的经济可行。酶固定化方法一般可粗分为4大类吸附法、共价结合法、交联法和包埋法。包埋法固定化酶是在载体制备过程中将酶包埋在里面，适用于小分子量的酶的固定化，存在酶易泄漏，传质阻力等缺陷。共价结合法固定化酶使得酶与载体的结合很牢固，稳定性好，但是固定化成本高，操作过程繁琐复杂。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。本发明提供的制备固定化酶的方法，包括如下步骤将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45°C (如 4°C -25 °C >25 °C -30 °C >30 °C -45 °C )反应 0.5-Mh(如 0. ^i-2h、ai-6h、Mi-iai、iai-24h)，得到固定化酶；所述双亲性中空碳微球按照如下方法制备在恒温条件下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球；所述恒温的温度为 180-240°c之间的任一温度(如 180°C _200°C或 200°C -240°C )。所述恒温的时间可为8-14小时(8小时-10小时或10小时-14小时)。所述酵母可为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具体可为安琪酵母股份有限公司生产的耐高温高活性啤酒酵母。所述水溶液可为己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO3水溶液。所述酵母与所述水溶液的配比可为10-200g酵母IL水溶液，优选为200g酵母IL水溶液。所述己二醛水溶液具体可为0. 01mol/L己二醛水溶液。所述NaOH水溶液具体可为lg/lOOmLNaOH水溶液。 所述HNO3水溶液具体可为lg/100mL HNOyK溶液。所述待固定酶可为水解酶、氧化还原酶、脱氢酶或异构酶等；所述水解酶可为脂肪酶、β -葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等；所述氧化还原酶可为过氧化氢酶、葡萄糖氧化酶等；所述脱氢酶可为乙醇脱氢酶等。所述异构酶可为葡萄糖异构酶等。所述固定化酶具体可为固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游离脂肪酶和 0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成，脂肪酶浓度为％ig/mL ；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g 2mL;所述反应的参数为4-25°C，振荡 (IOOrpm)反应 12h。
所述固定化酶具体可为固定化过氧化氢酶；所述待固定酶的溶液由游离过氧化氢酶和0. 05mol/L pH7. 0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成，过氧化氢酶浓度为20-50mg/mL ；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g 4mL;所述反应的参数为 4-25°C，振荡(IOOrpm)反应 0. 5-24h0所述固定化酶具体可为固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游离葡萄糖氧化酶和0. 05mol/L pH5. 5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；葡萄糖氧化酶浓度为20mg/mL ； 所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g 2mL ；所述反应的参数为 30°C，振荡(IOOrpm)反应 6h。所述固定化酶具体可为固定化β-葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游离 β -葡萄糖苷酶和0. 05mol/L pH4. 8的HAc-NaAC缓冲液组成，β -葡萄糖苷酶浓度为Img/ mL ；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g ImL;所述反应的参数为45°C，振荡(IOOrpm)反应浊。以上任一所述方法制备得到的固定化酶也属于本发明的保护范围。本发明利用由酵母碳化得到的中空碳微球为固定化载体，利用吸附法将不同大小和类型的酶封装包埋在中空碳微球的空腔里，实现酶的固定化。将中空碳微球作为固定化载体，具有如下优点原料来源广泛、成本低廉；表面具有大量的羟基、醛基和羧基等亲水官能团，同时也存在着呋喃环、芳香族和脂肪族碳链等疏水性基团，利用载体表面的基团与酶分子基团之间的键合实现酶的固定化。该中空碳微球具有高比表面积、大的内部空腔、丰富的表面官能团、以及良好的生物相容性和双亲性(能够均勻地分散在极性及非极性溶剂中)等优点，可以获得高载酶量、高酶活和高操作稳定性的固定化酶，并且可以适用于水相和有机相的酶催化体系，具有一定的普适性。与常规的固定化方法相比，本发明提供的制备固定化酶的方法具有以下优点① 酶的封装包埋和载体制备过程是分开进行的，避免了酶的失活；②酶与载体之间为非共价作用，无需对载体表面基团进行修饰，方法简单；③载体对酶蛋白起到保护作用，能有效防止强烈搅拌等外界因素对酶的损害，提高固定化酶的操作稳定性；④壳壁上的孔道可以轻易让底物和产物进出，传质阻力小；⑤中空碳微球的双亲性为其用于有机介质体系提供了可能；⑥大多数的酶都可以采用这种固定化方法，具有一定的普适性；⑦载酶量高，稳定性强。
图1为双亲性多孔中空碳微球的扫描电镜(SEM)形貌照片。图2为荧光脂肪酶示踪的激光聚焦照片。图3为固定化脂肪酶和等蛋白量游离脂肪酶催化转酯化曲线图4为固定化脂肪酶的重复操作稳定性。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。蛋白载量(mg/g)=(原溶液中的蛋白量-固定化后溶液中的蛋白量)/双亲性中空碳微球的质量；蛋白含量利用考马斯亮蓝法(Bradford法)测定，以mg计；双亲性中空碳微球的质量为加入的质量，以g计。实施例1应用双亲性中空碳微球固定脂肪酶(1)双亲性中空碳微球的制备称20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名称为耐高温高活性啤酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司，商品目录号80000012)，分散于IOOml的0. 01mol/L己二醛水溶液中，然后转移到反应釜置于恒温箱中在180°C下加热14h，反应结束后，收集沉淀，将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20°C下干燥Mh，即得到双亲性中空碳微球。双亲性中空碳微球的扫描电镜(SEM)形貌照片见图1，粒径为2-4微米，孔径> 50nm。(2)固定化脂肪酶的制备游离脂肪酶(蛋白)商品名称为Lipozyme TL，购自Sigma公司，型号为L0777。取50mg步骤⑴制备的双亲性中空碳微球，均勻分散到2mL脂肪酶溶液(由游离脂肪酶和0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成；脂肪酶浓度为％ig/mL)中，25°C、 IOOrpm振荡12h，离心分离，用IOmL 0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗负载有脂肪酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为8. 22mg/g的固定化脂肪酶。(3)催化性能将200mg硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)溶于8mL lg/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步骤(2)制备的固定化脂肪酶(或与固定化脂肪酶等蛋白量的游离脂肪酶)， 于40°C，150rpm水浴震荡反应，分别于反应后0. 5h、lh、1. 5h、2h、3h、5h、7h取样，通过气相色谱测定反应前后正丁醇浓度的变化，计算转酯化率。气相色谱相关参数气相色谱仪为GC-2000 ；色谱柱柱长1. 5m、内径2mm，不锈钢柱；填充物为5% SE-30 chromsorbm, AW. DMCS担体，60-80目；载气为高纯氮气，流速为 30mL/min ；柱箱温度90°C，进样器温度150°C，检测器温度150°C，进样量3 μ L。转酯化率=(反应前反应体系中正丁醇的含量-反应后反应体系中正丁醇的含量)/反应前反应体系中正丁醇的含量χιοο%。固定化脂肪酶和游离脂肪酶的转酯化率如图3所示。当反应0. 5h时，固定化脂肪酶的催化的转酯化率为27%，是等量游离酶的4. 3倍。反应后，固定化酶的转酯化率达到64. 4%，而游离酶的转酯化率在反应池后基本上趋于平衡，维持在41.3%。(4)操作稳定性操作稳定性用反应周期的次数对固定化脂肪酶催化性能的影响来表征。将IOOmg硝基苯棕榈酸酯(p_NPP)溶于8mL 0. 5g/100mL正丁醇的正庚烷溶液中， 然后加入50mg步骤( 制备的固定化脂肪酶，于40°C，150rpm水浴震荡反应lh，即为一个反应周期；每个反应周期结束后取样通过气相色谱测定反应前后正丁醇浓度的变化，计算转酯化率，并将固定化脂肪酶从反应液中离心分离，用正庚烷清洗两次，然后进行下一个反应周期的操作；共进行30个反应周期。将第一个周期固定化脂肪酶的转酯化率定义为100%，其余每个周期的转酯化率与第一个周期的转酯化率的比值作为活力保留率。结果见图4。固定化酶连续使用30次后，转酯化率未出现明显下降，具有良好的操作稳定性。
(5)储藏稳定性取步骤( 制备的固定化脂肪酶室温干燥储藏130天，分别于储藏前和储藏后检测的转酯化率，转酯化率的测定方法同步骤中的第一个反应周期。将储藏前固定化脂肪酶的转酯化率定义为100%，储藏后的转酯化率与储藏前的转酯化率的比值作为活力保留率。室温干燥储藏130d后，活力保留率为94%，结果表明，固定化脂肪酶具有良好的储藏稳定性。(6)脂肪酶在载体中的封装效果用荧光脂肪酶(异硫氰酸荧光素标记的Lipozyme TL)代替步骤(2)中的脂肪酶， 其它同步骤O)，得到荧光标记的固定化脂肪酶(装载了荧光脂肪酶的两亲性多孔中空碳微球)。使用激光共聚焦显微镜对固定化脂肪酶进行观察，荧光脂肪酶示踪的激光共聚焦照片见图2。通过照片可以直观地观察到脂肪酶富集在两亲性多孔中空碳微球的内部空腔，即实现了酶的封装固定化。实施例2应用双亲性中空碳微球固定脂肪酶(1)双亲性中空碳微球的制备同实施例1的步骤(1)。(2)固定化脂肪酶的制备游离脂肪酶(蛋白)购自Sigma公司，型号为L3126。取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均勻分散到2mL脂肪酶溶液(由游离脂肪酶和0. 02mol/L pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成；脂肪酶浓度为％ig/mL)中，4°C、 IOOrpm振荡12h，离心分离，用IOmL 0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液冲洗负载有脂肪酶的碳微球2-3次，即得蛋白载量为15. 89mg/g的固定化脂肪酶。(3)催化性能将200mg硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)溶于8mL lg/100mL正丁醇的正庚烷溶液中，然后加入50mg步骤(2)制备的固定化脂肪酶(或与固定化脂肪酶等蛋白量的游离脂肪酶)， 于40°C，150rpm水浴震荡反应，于反应0. 5h取样，通过气相色谱测定反应前后正丁醇浓度的变化，计算转酯化率。固定化酶的转酯化率为游离酶的3倍。实施例3、应用双亲性中空碳微球固定过氧化氢酶(1)双亲性中空碳微球的制备称20g啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(商品名称为耐高温高活性啤酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司，商品目录号80000012)，分散于IOOml的0. Olmol/L己二醛水溶液中，然后转移到反应釜置于恒温箱中在240°C下加热8h，反应结束后，收集沉淀， 将得到的沉淀用去离子水洗涤，然后在20°C下干燥Mh，即得到双亲性中空碳微球(粒径为 2-4微米，孔径> 50nm)。(2)固定化过氧化氢酶的制备游离过氧化氢酶(蛋白)固体粉末，购于美国Sigma公司，产品号为C9322。取50mg步骤(1)制备的双亲性中空碳微球，均勻分散到4mL过氧化氢酶溶液(由游离过氧化氢酶和0. 05mol/L pH7. 0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；过氧化氢酶浓度为 20mg/mL)中，4 °C、100rpm 振荡 0. 5h，离心分离，用 IOmL 0. 05mol/L pH7. 0 的
6NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液冲洗负载有过氧化氢酶的碳微球2_3次，即得蛋白载量为3. 23mg/g 的固定化过氧化氢酶。(3)催化性能将50mg固定化过氧化氢酶(或与固定化过氧化氢酶等蛋白量的游离过氧化氢酶)分散在 ImL 0. 05mol/L ρΗ7· 0 的 NaH2PO3-Na2HPO3 缓冲液中，25 °C 预热 5min,加入 5mL2. 87mol .Γ1过氧化氢水溶液(或0. 22mol .Γ1过氧化氢水溶液)，120rpm反应IOh,离心终止反应，过滤，在MOnm下测定上清液的吸光值，根据过氧化氢标准曲线求得上清液中的过氧化氢的浓度，同时与不加过氧化氢酶的空白样比较，计算过氧化氢的分解率。底物浓度对过氧化氢酶催化效率的影响见表1。表1底物浓度对过氧化氢酶催化效率的影响
权利要求
1.一种制备固定化酶的方法，包括如下步骤将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45°C反应0. 514h，得到固定化酶；所述双亲性中空碳微球按照如下方法制备在恒温条件下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球；所述恒温的温度为 180-240°C之间的任一温度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述恒温的时间为8-14小时。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述酵母为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；所述水溶液为己二醛水溶液、NaOH水溶液或HNO3水溶液；所述酵母与所述水溶液的配比为10-200g酵母IL水溶液，优选为200g酵母IL水溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述己二醛水溶液为0.01mol/L己二醛水溶液；所述NaOH水溶液为lg/100mL NaOH水溶液；所述HNO3水溶液为lg/100mL HNO3水溶液。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述待固定酶为水解酶、氧化还原酶、脱氢酶或异构酶；所述水解酶为脂肪酶、葡萄糖苷酶、蛋白酶、淀粉酶或纤维素酶；所述氧化还原酶为过氧化氢酶或葡萄糖氧化酶；所述脱氢酶为乙醇脱氢酶；所述异构酶为葡萄糖异构酶。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶为固定化脂肪酶；所述待固定酶的溶液由游离脂肪酶和0. 02mol/L pH6. 0的醋酸-醋酸钠缓冲液组成，脂肪酶浓度为 %ig/mL;所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g 2mL;所述反应的参数为4-25°C，振荡反应12h。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶为固定化过氧化氢酶；所述待固定酶的溶液由游离过氧化氢酶和0. 05mol/L pH7. 0的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成， 过氧化氢酶浓度为20-50mg/mL ；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为 0. 05g 4mL;所述反应的参数为4-25°C，振荡反应0.5-Mh。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶为固定化葡萄糖氧化酶；所述待固定酶的溶液由游离葡萄糖氧化酶和0. 05mol/L pH5. 5的NaH2PO3-Na2HPO3缓冲液组成；葡萄糖氧化酶浓度为20mg/mL ；所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为0.05g 2mL;所述反应的参数为30°C，振荡反应他。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述固定化酶为固定化葡萄糖苷酶；所述待固定酶的溶液由游离β -葡萄糖苷酶和0. 05mol/L pH4. 8的HAc-NaAC缓冲液组成， β-葡萄糖苷酶浓度为lmg/mL;所述双亲性中空碳微球与所述待固定酶的溶液的配比为 0. 05g ImL;所述反应的参数为45°C，振荡反应池。
10.权利要求1至9中任一所述方法制备得到的固定化酶。
全文摘要
本发明公开了一种应用双亲性多孔中空碳微球制备固定化酶的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤将双亲性中空碳微球和待固定酶的溶液混合，4-45℃反应0.5-24h，得到固定化酶；双亲性中空碳微球按照如下方法制备180-240℃下，将酵母在水溶液或水中进行碳化，得到双亲性中空碳微球。本发明的方法具有以下优点①酶的封装包埋和载体制备分开进行，避免酶的失活；②酶与载体之间为非共价作用，无需对载体表面基团进行修饰，方法简单；③能有效防止强烈搅拌等外界因素对酶的损害，提高固定化酶的操作稳定性；④传质阻力小；⑤中空碳微球的双亲性为其用于有机介质体系提供了可能；⑥具有普适性；⑦载酶量高，稳定性强。
文档编号C12N11/14GK102443579SQ20101051234
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月12日 优先权日2010年10月12日
发明者倪德志, 关政荣, 孙运辉, 杨森 申请人:中国农业大学