专利名称：一种携载基因涂层医疗装置的灭菌处理方法
技术领域：
本发明涉及医疗器械领域，具体涉及一种适用于携载基因涂层的 医疗装置的灭菌方法。
背景技术：
理想的可植入的医疗装置不但应具有良好的生物相容性，而且能 促进受伤组织愈合，防止细胞过度增生，加速管腔组织内皮化，防止 血栓形成和再狭窄。随着分子生物学的发展，许多疾病的发病机理在 基因水平上得以阐明，这使得从基因水平诊断和根治疾病成为可能。 在医治心脏病、肿瘤、糖尿病等方面的基因转移和调位的治疗方法正 在成为研究热点。例如促进内皮修复和抑制内膜增殖的基因导入心血 管内，使之在血管内表达，从而达到抑制血管再狹窄的目的。目前能 够促进内皮修复和抑制内膜增殖的不同阶段信号因子及其相关基因
正成为研究的热点之一，包括能产生血管内皮细胞生长因子(VEGF) 的基因、 一氧化氮合酶(eNOS、 nNOS、 iNOS)的一氧化氮合酶基 因、雌激素、17P雌二醇等。这些支架在动物实验阶段大部分都表现 了较好的抑制再狹窄和促进内皮修复的结果。.
但由于这类生物医疗装置含有生物活性成分，其灭菌方式必须克 服高温、强自由基、射线等破坏生物活性结构的问题。目前可植入医 疗装置的消毒灭菌方法一般为化学消毒方法，如釆用蒸汽或环氧乙烷 灭菌，过程较为复杂，化学残留不易除去。
目前一次性医疗用品和医用包装材料多釆用Co60-Y射线辐照消 毒灭菌，利用放射性同位素钴-60与铯-137的Y射线，以及电子加速 器产生的高能电子与X射线的化学生物效应，破坏微生物的细胞核质
结构，以达到杀灭病源微生物的目的。较之常规的蒸汽或环氧乙烷灭菌，Co60-Y射线辐照消毒灭菌有如下优点
1、 辐照消毒灭菌彻底，无污染、无残留，大量釆用经辐射灭菌 后一次性使用的医疗用品，可避免交叉感染，降低发病率。
2、 辐照消毒灭菌不需加热，是一种"冷消毒"法，适用于热敏
感的塑料制品、生物体等。而环氧乙烷具有强的致癌效应，其灭菌需 要一定的温度，灭菌时间也较长，而且由于其很强的氧化性很易破坏 基因的结构。
3、 操作简单快捷，可连续作业；
4、 消毒灭菌后的产品可长期保存。
因此Co60-Y射线辐照消毒灭菌已逐步取代了常规的化学消毒方 法，但Co60-Y射线辐照消毒灭菌也有缺点，其照射过程中电离产生 的氧自由基对生物活性成分如基因或寡核苷酸有较大破坏作用，因此 难于应用于携载基因涂层的医疗器械上。
本发明克服上述杀菌方式的缺点，将0)60- y射线辐照消毒灭菌 方式应用到携载基因涂层的医疗器械上。
发明内容
本发明的目的是提供一种携载基因涂层医疗装置的灭菌处理方法。
本发明所述的携载基因涂层的医疗装置的灭菌处理方法，包括l ) 在医疗器械的基因涂层表面涂敷生物活性保护涂层，保护基因的生物 活性不受射线照射的影响；2 )应用Co60-Y射线辐照灭菌携载基因涂 层的医疗器械。
本发明所述的方法，在步骤l)之后，步骤2)之前，还包括i) 冷冻干燥具有生物活性保护涂层的基因涂层医疗器械。
本发明所述的方法，在步骤l)之后，步骤2)之前，还包括ii) 包装冷冻干燥处理后的基因涂层医疗器械。
其中，所述生物活性保护涂层是由抗坏血酸及其衍生物、右旋糖
5酐20及其衍生物、右旋糖酐40及其衍生物、右旋糖酐70及其衍生物、 右旋糖酐100及其衍生物、羧甲基壳聚糖及其衍生物、N-乙酰胺葡萄 糖及其衍生物、淀粉及其衍生物、几丁质及其衍生物、粘多糖及其衍 生物、透明质酸及其衍生物、肝素及其衍生物、琼脂糖及其衍生物、 明胶及其衍生物等能够用于临床的药物或辅料中的一种或多种物质 组成。
而且由于抗坏血酸及其衍生物具有广泛的生理活性，能促进胶原 蛋白的形成，促进造血和解毒，维持组织的完整性，防止坏血病，并 且能促进医疗器械产品植入后伤口的快速愈合，从而减少体内炎症和 再狭窄率；还具有很强的消除氧自由基的能力，消除射线照射过程中 产生的氧自由基，从而减少其对生物活性成分的破坏；右旋糖酐40 (蔗糖经肠膜状明串珠菌发酵后生成的高分子葡萄糖聚合物)能提高 失血患者血浆胶体渗透压、扩充血容量，维持血压、血流量、尿流量 和组织灌注，具有代血浆的作用；右旋糖酐40在抗血小板黏附、保护
血管内皮、使聚集的红细胞和血小板解聚等方面发挥明显的作用；右
旋糖酐40还通过与生物活性成分特定部位结合，达到保护生物活性成
分的目的，并且具有一定的消除氧自由基的能力，从而保护生物活性 成分的活性不被射线破坏，因此优选抗坏血酸及其衍生物和右旋糖酐
40中的一种或多种。
所述生物活性保护涂层的厚度为0.01-100nm。 所述涂覆生物活性保护涂层的方法，包括
1) 将生物活性保护涂层物质溶解到蒸馏水、生理盐水、pH值为 3.0-9.0的硼酸盐缓冲溶液、pH值为8.0-10.0碳酸盐缓冲溶液、pH值为 3.0-9.0醋酸盐缓冲溶液、浓度为l。/o-20。/o的乙醇溶液或pH值为3.0-9.0 磷酸盐缓冲溶液中的一种或多种，制得浓度为l-100mg/ml的溶液；
2) 将溶液均匀喷涂在基因涂层医疗装置的表面，涂层的厚度为 0.01-100 jam;所述基因涂层的涂敷方法可为蘸涂、浸涂、雾化喷涂、静电喷涂 或阳极极化法进行。
优选地，涂覆生物活性保护涂层的方法，包括如下步骤
1) 将抗坏血酸及其衍生物、右旋糖酐40中的一种或多种溶解到 蒸馏水中，制得浓度为20mg/ml的溶液；
2) 将上述溶液均匀喷涂在生物涂层医疗装置的表面，灭菌保护 涂层的厚度为l-10nm。
所述Co60-Y射线辐照灭菌是将具有生物保护涂层的携载基因医 疗装置，在温度5-5(TC，剂量5-40KGy，湿度10-100%的条件下进行。
所述冷冻干燥处理为先进行预冷冻，再放入真空冷冻干燥机中 干燥。其具体过程为先将涂覆了生物活性保护涂层的医疗装置在温 度-20 ~ (TC预冷冻2h后，再在真空度<10 pa、冷胼温度-55 。C的真空 冷冻干燥机中干燥，干燥时间l-24h，干燥完毕后放入-2(TC冰箱中保 存备用。
本发明提供的基因涂层医疗装置的灭菌处理方法中，所述医疗装 置为冠脉血管支架、颈动脉血管支架、外周血管支架、肾动脉血管支 架、颅内动脉血管支架、移植片固定膜、移植片固定膜移植物、合成 的人造血管、心脏瓣膜、导管、血管修补筛、起搏器、起搏器导子、 除纤颤器、PFO隔膜封闭装置、血管夹、动脉血管瘤闭锁器、血液透 析移植物、血液透析导管、房室吻合分流、大动脉血管瘤移植物装置、 静脉瓣、血管接合夹、留置式动脉导管、血管护鞘或药物输送口。
所述基因涂层由一氧化氮合成酶(eNOS、 nNOS、 iNOS)基因、 血管内皮生长因子(VEGF)基因、成纤维细胞生长因子(HGF)基 因、胰岛素样生长因子(IGF)基因、细胞分裂调控基因(c-myc)、 抗癌基因(p53)、肝细胞生长因子(HGF)基因、血小板衍生生长因 子(PDGF)基因、PTEN、 Keratin8基因、尿激酶前体(Pro-UK)基 因、EGF基因或其寡核苷酸或反义寡核苷酸中的一种或多种基因组
7成。
本发明所提供的生物涂层医疗装置的灭菌处理方法，其具有如下 有益效果
1、 优异的灭菌效果基因涂层医疗装置涂覆生物活性保护层后， 经过Co60-Y辐照灭菌，不但达到了很好的灭菌效果，并且基因活性 被完全保护，涂覆生物活性灭菌保护层后生物活性保护效果显著。
2、 使用安全，满足临床需要生物活性保护涂层釆用的抗坏血 酸盐或右旋糖酐40等均是可用于临床的药物或辅料，抗坏血酸盐能够 促进医疗器械产品置入后伤口的很快愈合，从而减少体内炎症的发 生，减少再狭窄率。右旋糖酐40通过与生物活性成分特定部位结合， 从而保护生物活性成分不被射线破坏。由于抗坏血酸盐或右旋糖酐40 极易溶于水，当医疗装置植入时抗坏血酸盐或右旋糖酐40能很快被血 液冲刷下来，不影响生物活性物质的药效；
3、 工业实用性Co60-Y辐照灭菌方式能够进行大规模的工业化 生产，抗坏血酸盐喷涂只需要使用现有的喷涂设备进行喷涂，且工艺 简单，成本较低。
图l为医疗装置表面分布的基因及其保护涂层的示意图，其中， A为医疗装置表面分布的生物活性保护涂层；B为医疗装置表面分布 的基因成分；C为医疗装置本体表面分布的纳米孔洞；D为医疗装置 本体。
图2为生物基因支架的阳极极化涂覆过程示意图，其中，l为搡控 电脑；2为阳极极化仪；3为储液容器；4为电极。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的 修改或替换，均属于本发明的范围、如无特别指明，实施例中使用的
8基因来源于美国Invitrogen公司，阳极极化仪所用的阴极为Pt电极。
实施例l iNOS基因涂层支架的制备
选用316L不锈钢合金材质经抛光后，用激光雕刻成血管支架，支 架表面通过化学或物理方法，如腐蚀、阳极氧化、微弧氧化、微弧氮 化等方法或这些方法的结合在器械本体原材料的局部表面直接制备 形成孔洞，孔洞可以是载药槽或孔结构，孔洞的直径为200-300nm(孔 洞制备的具体方法参见专利200610168125.0 )。按照如下步骤制得 iNOS基因涂层生物支架
1、 支架本体表面的清洗
(1) 砂带打磨支架本体表面，机械去除表面的氧化物，调整表 面粗糙度；
(2) 利用超声波，依次用75%的医用乙醇溶液、99.5%的丙酮溶 液、去离子水清洗，超声波频率为100KHz，清洗时间为10min;
(3) 将支架本体放入30g/L、 8(TC的氢氧化钠溶液中浸泡10min，
去除油脂和氧化皮；
(4) 将清洗后的支架本体放置在真空干燥机中，温度设定在40 。C，干燥45min后取出。
2、 支架本体表面的防腐处理将支架本体浸入到重铬酸钾15g/L、 硝酸15g/L、氯化钠1.0g/L混合溶液中，在8(TC下氧化lmin，支架本 体表面即可生成氧化膜。
3、 支架本体表面基因涂层溶液的涂覆处理
(1) 支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为 lOOKHz，清洗时间为10min;使用去离子水清洗三次；
(2) iNOS基因涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6 的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，配制成浓度为0.1mg/ml iNOS基因溶液；
目的基因NOS从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中获得，并以质 粒载体pcDNA3.1构建N0S的载体治疗基因。转染进大肠杆菌DH5a ,-70°C保存。最后使用Qiagene公司的去内毒素质粒纯化试剂盒及方法
提纯质粒。
(3) 阳极极化涂覆如图2所示，将支架本j^串联到阳极极化仪的阳极4，将配制好的基因溶液注入阳极极化的基因储存容器3中，调节阳极电压为2.5v，进行极化，极化时间为600s，通电后抗体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使基因与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成一层均匀的基因涂层；
(4) 生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥4 h。
实施例2 iNOS基因涂层支架的灭菌处理
将抗坏血酸钠盐溶解到蒸馏水中，制得浓度为20mg/ml的抗坏血酸盐溶液；将抗坏血酸盐溶液均匀喷涂在实施例l的iNOS基因涂层支架的表面，灭菌保护涂层的厚度为5^im左右；将涂覆了iNOS基因保护涂层的支架在冰箱中预冷冻2小时后，在真空度〈10pa、冷肼温度-55。C的真空冷冻干燥机中，干燥时间4h，取出放入-20'C冰拒中保存。将包装后的医疗装置，在温度25。C，剂量15KGy，湿度35%的条件下进行Co60-Y射线辐照灭菌。
实施例3 iNOS基因涂层支架的灭菌处理
将右旋糖酐40溶解到蒸馏水中，制得浓度为40mg/ml的右旋糖酐40溶液；将右旋糖酐40溶液均匀喷涂在实施例1的生物抗体涂层医疗装置的表面，灭菌保护涂层的厚度为10iam左右；将涂覆了iNOS基因保护涂层的支架在冰箱中预冷冻2小时后，在真空度<10 pa、冷肼温度-55 。C的真空冷冻干燥机中，干燥时间IO h，取出放入-20 "C冰柜中保存。将包装后的医疗装置，在温度10'C，剂量5KGy，湿度10%的条件下进行Co60-Y射线辐照灭菌。实施例4 VEGF基因涂层支架的制备
目的基因VEGF采用逆转录法从人白血病细胞HL-60中获得，并以质粒载体pcDNA3.1构建VEGF的载体治疗基因。转染进大肠杆菌DH5a, -70匸保存。最后使用Qiagene公司的去内毒素质粒纯化试剂盒及方法提纯质粒。
选用钴络合金材质，经清洗和抛光后，用激光雕刻成血管支架，然后进行实施例1所述的清洗和防腐处理，再按照如下步骤制得VEGF基因涂层生物支架
(1) 支架本体的预处理用四氢呋喃超声清洗，超声波频率为100KHz,清洗时间为10min;使用去离子水清洗三次；
(2) 抗体涂覆液的配制以浓度为0.05mo1/1、 pH值为9.6的碳酸盐缓冲溶液为溶剂，配制成浓度为0. lmg/ml抗体溶液；
(3) 阳极极化涂覆如图2所示，将支架本体串联到阳极极化仪的阳极4上，将配制好的抗体溶液注入阳极极化的基因储存容器3中，调节阳极电压为2.5v,进行极化，极化时间为600s,通电后抗体离子向阳极支架处移动，在阴阳相吸作用下，克服支架表面的液面张力，使基因与支架表面牢固均匀的结合。并在支架表面形成一层均匀的基因涂层；
(4) 生物支架干燥将支架自然稍晾干后，冰箱中预冷冻后放入真空冷冻干燥机中干燥4h。
将抗坏血酸钠盐和右旋糖酐40溶解到pH值为6.0的醋酸盐缓冲溶液中，制得浓度分别为60mg/ml的溶液；将溶液均匀喷涂在基因涂层支架的表面，灭菌保护涂层的厚度为20pm;将涂覆了iNOS基因保护涂层的支架在冰箱中预冷冻2小时后，在真空度〈10pa、冷肼温度-55。C的真空冷冻干燥机中，干燥时间16h，取出放入-20'C冰柜中保存。将包装后的医疗装置，在温度4(TC,剂量30KGy，湿度50%的条件下进行Co60-Y射线辐照灭菌。
ii实施例5基因涂层支架的灭菌处理
选用巿售的纯钛支架，用0.1mg/ml的iNOS基因、0.1mg/ml的血管内皮生长因子(VEGF)基因的pH-9.2的碳酸盐缓冲溶液釆用阳极极化法将基因涂敷在支架表面，所用的阳极极化设备和极化条件与实施例4相同，真空冷冻干燥后备用。
将右旋糖酐70溶解到蒸馏水中，制得浓度为10mg/ml的右旋糖酐70溶液；将右旋糖酐70溶液均匀喷涂在基因涂层医疗装置的表面，灭菌保护涂层的厚度为2nim左右；将涂覆了基因保护涂层的支架在冰箱中预冷冻2小时后，在真空度〈10pa、冷肼温度-55 'C的真空冷冻干燥机中，干燥时间24h，取出放入-20 i:冰柜中保存。将包装后的医疗装置，在温度50。C，剂量40KGy，湿度70%的条件下进行0)60-y射线辐照灭菌。
实施例6基因涂层支架的灭菌处理
选用巿售的镍钛合金支架，用0.1mg/ml的iNOS基因、0.1mg/ml的血管内皮生长因子(VEGF)基因和0.1mg/ml i成纤维细胞生长因子(HGF)基因的碳酸钾混合溶液作为电解液，釆用阳极极化法将iNOS基因、血管内皮生长因子(VEGF)基因和成纤维细胞生长因子(HGF)基因涂敷在支架表面，所用的阳极极化设备和极化条件与实施例4相同，真空冷冻干燥后备用。
将抗坏血酸钠和N-乙酰胺葡萄糖溶解到20%的乙醇溶液中，制得浓度分别为15mg/ml的溶液；将该溶液均匀喷涂在基因涂层支架的表面，灭菌保护涂层的厚度为80nm左右；将涂覆了基因保护涂层的支架在冰箱中预冷冻2小时后，在真空度〈10pa、冷肼温度-55 。C的真空冷冻干燥机中，干燥时间2h，取出放入-20 。C冰柜中保存，然后包装。将包装后的医疗装置，在温度5。C，剂量15KGy，湿度35%的条件下进行Co60-Y射线辐照灭菌。
权利要求
1、一种携载基因涂层的医疗装置的灭菌处理方法，包括1)在医疗器械的基因涂层表面涂敷生物活性保护涂层；2)应用Co60-γ射线辐照灭菌携载基因涂层的医疗器械。
2、 如权利要求1所述的灭菌处理方法，其特征在于，在所述步 骤l)之后，步骤2)之前，还包括i)冷冻干燥具有生物活性保护涂 层的基因涂层医疗器械，或进一步包括ii)包装冷冻干燥处理后的基 因涂层医疗器械。
3、 如权利要求1所述的灭菌处理方法，其特征在于，所述生物 活性保护涂层是由抗坏血酸及其衍生物、右旋糖酐20及其衍生物、 右旋糖酐40及其衍生物、右旋糖酐70及其衍生物、右旋糖酐100及 其衍生物、羧甲基壳聚糖及其衍生物、N-乙酰胺葡萄糖及其衍生物、 淀粉及其衍生物、几丁质及其衍生物、粘多糖及其衍生物、透明质酸 及其衍生物、肝素及其衍生物、琼脂糖及其衍生物、明胶及其衍生 物等能够用于临床的药物或辅料中的一种或多种物质组成。
4、 如权利要求1或3所述的灭菌处理方法，其特征在于，所述 生物活性保护涂层是抗坏血酸及其衍生物、右旋糖酐40的一种或多 种。
5、 如权利要求1所述的灭菌处理方法，其特征在于，所述生物 活性保护涂层的厚度为0.01-100 um。
6、 如权利要求l所述的灭菌处理方法，其特征在于，所述Co60-Y射线辐照灭菌是在温度5-5(TC，剂量5-40KGy，湿度10-100%的条件下进行。
7、 如权利要求l所述的灭菌处理方法，其特征在于，所述涂覆生 物活性保护涂层的方法可釆用喷涂法，所述喷涂法为1)将生物活性保护涂层物质溶解到蒸馏水、生理盐水、pH值为 3.0-9.0的硼酸盐缓冲溶液、pH值为8.0-10.0碳酸盐缓冲溶液、pH值为,3.0-9.0醋酸盐缓冲溶液、浓度为l。/。-20。/o的乙醇溶液或pH值为3,0-9.0 磷酸盐缓冲溶液中的一种或多种，制得浓度为l-100mg/ml的溶液;'2)将溶液均匀喷涂在基因涂层医疗装置的表面，涂层的厚度为 O.Ol隱lOOiam。
8、 如权利要求7所述的灭菌处理方法，包括1) 将抗坏血酸及其衍生物、右旋糖酐40的一种或多种溶解到蒸 馏水中，制得浓度为20mg/ml的溶液；2) 将上述溶液均匀喷涂在生物涂层医疗装置的表面，灭菌保护 涂层的厚度为l-10"m。
9、 如权利要求2所述的灭菌处理方法，其特征在于，所述冷冻 干燥处理为先进行预冷冻，再放入真空冷冻干燥机中干燥。
10、 如权利要求9所述的灭菌处理方法，其特征在于所述冷冻干 燥处理为先将涂覆了生物活性保护涂层的医疗装置在温度-20 ~ (TC 预冷冻2h后，再在真空度〈10pa、冷肼温度-55 。C的真空冷冻干燥机 中干燥，干燥时间l-24h，干燥完毕后放入-2(TC冰箱中保存备用。
全文摘要
本发明涉及一种携载基因涂层医疗装置的灭菌处理方法。本发明通过在医疗装置表面的基因涂层外再涂覆一层生物活性保护涂层，经冷冻干燥处理后，采用Co60-γ射线辐照灭菌。本发明所提供的灭菌处理方法，采用生物活性保护涂层，在保证灭菌效果的同时，避免了Co60-γ射线照射对基因活性的破坏，制得的携载基因涂层医疗装置具有很高的基因转染效率，从而在特定生理环境下更加有效地发挥促进内皮修复和抑制平滑肌增殖的优势。
文档编号A61L2/08GK101485892SQ20091007853
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月25日 优先权日2009年2月25日
发明者蒲忠杰, 陈永强 申请人:乐普(北京)医疗器械股份有限公司