专利名称：：靶向血小板的水蛭素聚离子胶束组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于注射的靶向血小板的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚乙二醇-壳聚糖(RGD-PEG-CS)包载水蛭素的聚离子胶束组合物及其制备方法。
背景技术：
：心脑血管疾病是三大致死性疾病之一，其中血栓栓塞是多种心脑血管疾病发病的原因。由于动脉硬化、血管内皮损伤、内外凝血系统异常或血流动力学异常等原因的诱发，血液流动过程中的成分，在血管或心脏内膜表面形成半凝块状物质，该物质即为血栓。针对血栓形成的多种机制，多种抗血栓药物相继问世，其中既有抑制血栓形成(抗凝防栓)和血小板聚集(抗血小板)的药物，又有溶栓的药物。抗凝防栓及抗血小板药物在血栓形成的初始阶段，以及溶栓治疗后的二次血栓预防过程中使用。针对血栓形成前和溶栓后，临床主要使用肝素、华发林等抗凝剂联合阿司匹林等抗血小板药物。但上述药物多具有诱发出血等副作用，临床安全性受到质疑。水蛭素是由65个氨基酸构成的分子量为6950Da的单链多肽，具酸性氨基酸，等电点为3.8。上世纪中期由markwardt从水蛭的唾液腺中提取出来，是迄今为止最强的凝血酶抑制剂，具有直接抗凝、间接抗血小板和间接促纤溶的作用。并以其高效性、专一性、无抗原性、低毒性、出血副作用小等赢得广泛关注。1986年，基因发酵工程所得重组水蛭素的成功问世，以其相对较低的成本和相对较高的产率，标志着水蛭素进入临床应用的可能。该药物可用于急性冠脉综合征、链激酶溶栓的辅助治疗、深静脉血栓血管形成术、肝素诱发的血小板减少、血液透析、弥散性血管内凝血等。但水蛭素的血浆半衰期短，缺乏组织特异性，不能选择性地作用于病变部位，因此，临床上需要大剂量连续用药，易出现出血等严重并发症，从而限制了其临床应用。增强溶栓剂的特异靶向性，是减少药物用量、延长药物在体内作用时间和避免血栓再形成等的关键措施。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)短肽是细胞膜整合素受体与活化的血小板上Ilb/IIIa球蛋白(GPIlb/IIIa)或其他细胞外配体相结合的识别位点。静息血小板上，GPIlb/IIIa处于无活性状态，并不能与黏附蛋白的R⑶片段结合。然而一旦内皮受损，血小板黏附其上时，诱导剂(如凝血酶，胶原，凝血酶敏感蛋白，ADP，血栓素A2等)与其相应受体结合后，通过不同的细胞内信号传导机制调节GPIIb/IIIa的立体构型活化状态使之激活，提高GPIlb/IIIa与纤维蛋白原的粘附能力，加速血小板的黏附与聚集。RGD三肽作为导向激活血小板的靶分子，将抗凝防栓药物带到血栓附近，并竞争性结合激活血小板上的GPIIb/IIIa，拮抗血小板与纤维蛋白的结合，降低血小板的黏附与聚集。因此，R⑶肽可作为血栓靶向制剂的导向弹头。CN101176785公开了一种重组双功能水蛭素口服制剂及其制备方法，该专利对水蛭素进行了结构改造，将RGD基因重组到水蛭素的基因上，通过发酵得到的抗凝、抗血小板双功能重组水蛭素。但上述方法生产成本极高，并且改变了药物原有的化学组成。因此，仍需要研制一种不改变原药的化学组成、制备工艺简单、体内循环时间长且靶向作用于血小板的水蛭素组合物。聚乙二醇接枝壳聚糖是壳聚糖的改良产物，在壳聚糖的氨基上引入亲水性长链聚乙二醇，有效地提高了壳聚糖的水溶性和生物相容性，在聚离子引发剂的作用下可在水溶液中自组装形成聚离子胶束。聚乙二醇接枝壳聚糖聚离子胶束作为一种新型的药物载体，除具有传统聚合物胶束的特点结构稳定、粒径小且分布均勻；安全性好；制备工艺简单；易于贮存外，还具有自身的独特优势壳聚糖上大量的游离氨基在酸性环境下质子化，依靠静电作用与负电性药物结合，形成胶束的疏水端，其上接枝的聚乙二醇在疏水内芯外形成致密的水化外壳，可避免胶束被免疫系统摄取，延长药物在体内的循环时间，达到长循环的目的。除此之外，聚离子胶束载药系统还具有包封率高、载药范围广泛，载药过程基本在水溶液中进行，避免有机溶剂的使用，可消除溶剂残留引发的毒副作用等优点。如果将RGD通过聚乙二醇与壳聚糖连接，可同时起到长循环和靶向血小板两方面的作用。
发明内容一方面，本发明提供一种靶向血小板的聚乙二醇接枝壳聚糖包载水蛭素的聚离子胶束组合物。另一方面，本发明提供靶向血小板的聚乙二醇接枝壳聚糖包载水蛭素的聚离子胶束组合物用于注射给药的用途。根据本发明的一个方面，其提供一种用于注射给药的靶向血小板的RGD-PEG-CS包载水蛭素的聚离子胶束组合物，其含有水蛭素，及RGD-PEG-CS、聚离子引发剂等药用辅料。本发明还涉及制备靶向血小板的聚离子胶束组合物的方法。包括用醋酸-醋酸钠缓冲液配制RGD-PEG-CS溶液，电磁搅拌下加入水蛭素溶液，搅拌反应后滴加聚离子引发剂水溶液，密封搅拌并用滤器过滤，即得包载水蛭素的RGD-PEG-CS聚离子胶束。其中的醋酸-醋酸钠缓冲液的PH范围为4.0-5.4，优选4.6-5.2，更优选4.8-5.0。RGD-PEG-CS与水蛭素重量比为52-202，优选102-162。RGD-PEG-CS与TPP的重量比为101-0.51，优选41-31。其中胶束的平均粒径在200nm以下，包封率高于80%。本发明的组合物可根据任何常规方法配制成注射制剂，例如注射液、冻干粉针等。本发明组合物可用于制备治疗急性冠脉综合征、链激酶溶栓的辅助治疗、深静脉血栓血管形成术、肝素诱发的血小板减少、血液透析、弥散性血管内凝血等相关疾病的药物。本发明组合物用于治疗上述疾病的药物可通过注射途径给药。本发明的组合物含有作为活性成分的水蛭素，还包括由RGD-PEG-CS、TPP构成的聚离子胶束。本发明的组合物经注射给药后，水蛭素的抗凝防栓活性增强，有效地抑制血小板聚集，同时显著提高血浆的部分凝血活酶时间。本发明组合物中的水蛭素的代表性例子是天然水蛭素、基因工程发酵所得的重组水蛭素，及其变异体。本发明组合物中的水蛭素至少是其中的一种，组合物中水蛭素的含量为0.1-50%，优选0.3-40%，更优选0.5-20%，以组合物的总重量计。RGD-PEG-CS是构成本发明组合物中胶束的主要成分，是精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸-聚乙二醇与壳聚糖的接枝产物，其中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)为具有RGD-Y结构的短肽，Y可以不为任何氨基酸，也可为缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)等氨基酸。所述聚乙二醇具有400-20000Da的分子量，优选2000Da-6000Da。所述的壳聚糖为壳聚糖或其衍生物，具有5-2000kDa的分子量，优选IO-IOOOkDa,更优选10_600kDa。所述的壳聚糖或其衍生物具有70%-95%的脱乙酰度，优选75%-90%。所述的RGD-PEG与壳聚糖上氨基的摩尔比例为14-130，优选110-120。聚离子引发剂也是本发明组合物的成分，优选三聚磷酸钠。另外，本发明的组合物还包括任选的药学上可接受的添加剂。为了达到本发明的目的，本发明进行了本发明组合物的部分凝血活酶时间和血小板聚集率的测定，以评价本发明组合物的靶向性。参考附图1、2和表1，通过本发明的以下描述，本发明的上述及其它目的和特征将是显而易见的。附图1显示了本发明实施例1的粒径分布。附图2显示了本发明的实施例1和市售水蛭素注射剂的部分凝血活酶时间(APTT)。如上所述，本发明的组合物可有效地抑制血小板聚集，同时显著提高血浆的APTT，增强水蛭素的抗凝防栓活性。以下实施例用于进一步详细说明本发明，但绝对不是对本发明范围的限制。具体实施方案实施例1注射液的制备将16mgRGD-PEG-CS溶于IOmlpH4.9的醋酸-醋酸钠缓冲液，电磁搅拌下加入IOml浓度为0.2mg/mL水蛭素溶液，搅拌反应30min后滴加5ml浓度为1.lmg/mL三聚磷酸钠水溶液，密封搅拌30min。用0.45μm的滤器过滤，即得靶向血小板的水蛭素的聚乙二醇接枝壳聚糖聚离子胶束组合物。向所得组合物中加入适量的抑菌剂苯甲醇水溶液，混合均勻，过滤，灌封，辐射灭菌即得。实施例2冻干粉针的制备将32mgRGD-聚乙二醇接枝壳聚糖溶于IOmlpH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，电磁搅拌下加入IOml浓度为0.5mg水蛭素溶液，搅拌反应45min后滴加4mL浓度为1.5mg/mL三聚磷酸钠水溶液，密封搅拌40min。用0.45μm的滤器过滤，即得靶向血小板的水蛭素的聚乙二醇接枝壳聚糖聚离子胶束组合物。在所得的胶束组合物中加入适量的葡萄糖和甘露醇，混合均勻，冻干，密封，辐射灭菌即得。试验例1聚离子胶束的APTT测定将15只SD大鼠随机分为三组，分别为水蛭素溶液组、水蛭素普通胶束组(PEG-CS)、水蛭素靶向胶束组(RGD-PEG-CS)(实施例1)。眼眶静脉丛取血1.6mL(柠檬酸钠抗凝，全血抗凝剂=8.751.25)，吸取300μ1抗凝后的全血，加入30μ1不同浓度各溶液，蜗旋振荡Imin混勻，4000rpm离心lOmin，吸取上清100μ1，_20°C冷冻待测。在37°C水浴上测定APTT。以浓度为横坐标，测定的时间与空白样品血浆APTT的比值为纵坐标得到量效关系图。结果如图2。图2的结果表明，与市售水蛭素注射剂相比，实施例1可显著提高血浆的APTT。和普通PEG-CS胶束相比，实施例1延长APTT的作用更强，说明R⑶起到了靶向作用，将胶束导向至由外源性凝血激活并聚集的血小板上，并与其结合，同时达到抗血小板和增强水蛭素的抗凝防栓活性的作用。试验例2聚离子胶束血小板聚集率的测定新西兰大耳兔耳缘静脉取血，柠檬酸钠19抗凝，分别向血液中加入等浓度的水蛭素溶液、水蛭素普通胶束(PEG-CS)、水蛭素靶向胶束(RGD-PEG-CS)(实施例1)，混合5min后比浊法测定最大血小板聚集率。结果见表1。表1的结果表明，实施例1的最大血小板聚集率低于同浓度的普通胶束和市售注射剂，说明实施例1可有效地抑制血小板聚集，增强水蛭素的抗凝防栓活性。表1最大血小板聚集率的测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>虽然已利用上述具体的实施方案对本发明进行了描述，但应认识到，本领域的技术人员还可进行各种的改进和改变，而且它们也应在如权利要求书限定的本发明的范围之内。权利要求一种组合物，其含有水蛭素，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚乙二醇接枝壳聚糖(RGD-PEG-CS)和聚离子引发剂。2.如权利要求1所述的组合物，其中RGD-PEG-CS与水蛭素的重量比为52-202，优选102-162。3.如权利要求1所述的组合物，其中的水蛭素选自天然水蛭素、基因工程发酵所得的重组水蛭素，及其变异体。4.如权利要求1所述的组合物，其中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)为具有RGD-Y结构的短肽，Y可以不为任何氨基酸，也可为缬氨酸(V)、丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)。5.如权利要求1所述的组合物，其中的聚乙二醇的分子量为400-20000Da，优选2000-6000Da。6.如权利要求1所述的组合物，其中的壳聚糖为壳聚糖或其衍生物，具有70%-95%的脱乙酰度，优选75%-90%。7.如权利要求1所述的组合物，其中的壳聚糖为壳聚糖或其衍生物，分子量为5-2000kDa，优选IO-IOOOkDa08.如权利要求1所述的组合物，聚乙二醇与壳聚糖上氨基的摩尔比例为14-130，优选110-120。9.如权利要求1-8任一项所述的组合物，其中聚离子引发剂为三聚磷酸钠。10.如权利要求1-9任一项所述的组合物的制备方法，包括用醋酸-醋酸钠缓冲液配制RGD-PEG-CS溶液，搅拌下滴入水蛭素溶液，搅拌反应后滴加聚离子引发剂水溶液，搅拌并过滤ο11.如权利要求10所述的方法，其中的醋酸_醋酸钠缓冲液的pH范围为4.0-5.4，优选4.6-5.2，更优选4.8-5.0。12.如权利要求10所述的方法，其中RGD-PEG-CS与TPP的重量比为101-0.51，优选41-31。13.一种药物组合物，其包含权利要求1-9任一项的组合物和药用的辅料。14.如权利要求1-9任一项的组合物用于制备治疗急性冠脉综合征、链激酶溶栓的辅助治疗、深静脉血栓血管形成术、肝素诱发的血小板减少、血液透析、弥散性血管内凝血等相关疾病的药物的用途。15.如权利要求14所述的用途，其特征在于所述药物通过注射途径给药。全文摘要本发明涉及靶向血小板的水蛭素聚离子胶束组合物。该组合物含有水蛭素，及精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚乙二醇接枝壳聚糖和聚离子引发剂。该聚离子胶束组合物的制备方法简单，具有血小板靶向性，增强水蛭素抗凝防栓活性，有效地抑制血小板聚集，同时显著提高血浆的部分凝血活酶时间。文档编号A61K47/36GK101810559SQ200910078179公开日2010年8月25日申请日期2009年2月20日优先权日2009年2月20日发明者刘艳,周艳霞,李馨儒,王菲申请人:北京大学