专利名称：脾靶向dna递送系统的制作方法
技术领域：
本发明属药物制剂领域，涉及纳米药物制剂领域，具体涉及一种含有DNA的脾靶向递送系统，即一种可静脉注射递送质粒DNA，在脾脏富集的纳米粒给药系统。
背景技术：
脾脏是全身最大的外周淋巴器官，是清除血源性病原体并诱导细胞及体液免疫的主要场所，有丰富的B、T细胞及巨噬细胞、树突状细胞、浆细胞等，将疫苗定向导入脾脏和脾细胞，将诱导较强的免疫反应，并产生大量的效应细胞如K、NK、CTL细胞等以及各种细胞因子和抗体。脾脏有可能成为免疫接种的主要效应器官之一。在免疫学基础研究中，有报道将裸核酸疫苗肌注、皮下注射和脾内直接注射等多种接种方式诱导特异性CTL应答，发现脾内直接注射可诱导出明显高于肌注和皮下接种时的CTL应答水平(Vaccine，1998，16(2～3)∶208～215)。据此认为将核酸疫苗靶向导入富含APC3和细胞因子的脾脏，可能更加有利于CTL应答的诱导。研究发现，脾内直接注射核酸疫苗具有创伤性，且注入的核酸疫苗很快被酶所降解。目前尚没有方便的将疫苗导入脾脏的方法，但脾靶向性药物递送系统可以将核酸疫苗定向输送至脾进行免疫，有利于诱导免疫应答，还可防止核酸疫苗在体内的降解，减少在其他组织的分布及毒副作用。
一般普通高分子材料如聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酸、白蛋白、壳聚糖等制备的纳米粒静脉注射后，首先被肝脏的枯否氏(Kupffer)细胞所截留摄取，而难以被转运至全身的其他部位。但具某种理化特征的“隐形”(stealth)纳米粒静脉注射后可以规避肝脏的摄取，在脾脏的聚集增多，具有较明显的脾靶向性，可以作为将生物活性分子输送至脾的载体(Pharm Res，1999，16(1)37～41)。其机理是网状内皮系统(reticulo-endothelial system，RES)如肝脾等的巨噬细胞吞噬纳米粒的机致与调理作用(opsonization)有关，血浆或血清中的调理素(opsonin)如IgG、C3b等可以附着于疏水纳米粒表面，巨噬细胞表面富有这些物质的受体，可以识别它们，进而将它们连同纳米粒一并吞噬。但隐形纳米粒表面吸附或共价结合一层或多层亲水性衣膜，如poloxamer、poloxamine、PEG等后，使该调理作用弱化，可以大大降低巨噬细胞的吞噬。肝脏Kupffer细胞对隐形纳米粒的摄取因此而大大降低，而脾脏的截留却没有降低，反而有大幅度的升高。这主要与脾脏独特的清除颗粒状异物机制有关。脾脏为解剖学上开放而生理学上闭合的微循环系统，隐形纳米粒可以通过网状内皮的筛网结构与细胞间隙机械地过滤至红髓，并在那里被去除亲水性外壳，然后被调理与吞噬(Adv Drug DelRev，1995(16)183～193)。脾脏对隐形纳米粒的摄取与纳米粒的大小、表面特性有密切关系。大鼠静注poloxamine-908包被的粒径为220nm聚苯乙烯纳米粒几小时后，大部分“隐形”纳米粒被脾脏载留(Biochem Biophys Res Comm，1991，177(2)861～866；Biochim Biophys Acta，1993，1157233～240)。Peracchia等(J ControlRel，1999，60(1)121～128)用PEG化的14C标记的聚氰基丙烯酸酯为材料制备了表面裸露PEG基团的“隐形”纳米粒，小鼠尾静脉注射6小时后脾组织的放射性浓度是肝脏的5倍多，具有明显的脾靶向性。
疫苗的发展经历了三个阶段第一代减毒、灭活疫苗具有潜在的致病性；第二代亚单位疫苗存在免疫反应不完全性；而被称为第三代疫苗的DNA疫苗兼具前两代的优点摒弃了其缺点，虽然只有短短的十年历史，却已在感染性疾病和肿瘤的防治中显示了巨大的应用潜力。但是裸DNA疫苗在体内降解速度极快，且不能定向转染抗原呈递细胞，极大地限制了其免疫效能的发挥，目前一般用基因枪介导的皮下和皮内导入以及肌肉注射DNA疫苗导入体细胞。一般认为静脉注射不适于作DNA疫苗接种，主要是因为血容量相对较大，DNA接触血液后将很快被稀释，转染率低；而且DNA将被血清中的DNA酶降解，生物利用度很低。然而结果表明静脉注射获得的免疫保护作用仅次于肌肉注射，原因是抗原提呈细胞对DNA的特异识别及高效提呈能够弥补转染效率低的不足，依然能够提供特异和高效的免疫保护。这表示静脉注射途径仍有潜力可挖。脾脏可能在这个过程中发挥了重要作用。如果能克服被稀释和降解两方面的缺点，通过静脉注射，将DNA疫苗靶向定位于脾脏，有可能诱导较强的免疫应答反应。目前尚没有方便的直接接种脾脏的方法。
发明内容
本发明的目的是克服已有技术的缺陷，提供一种将DNA递送至脾脏的给药系统，本系统为含DNA疫苗的“隐形”纳米粒，静注后使之于脾脏聚集，通过内吞将DNA导入脾脏内抗原呈递细胞。
本发明含有DNA的脾靶向递送系统，由DNA与一种或多种高分子材料组成纳米粒，表面附着亲水性高分子材料。
本发明的脾靶向纳米给药系统，所含DNA为质粒DNA，尤其是DNA疫苗。
本发明的纳米给药系统所含DNA按质量比计算，占纳米粒总重的0.01％～10％，优选为0.1～1％。
本发明的纳米粒，脾靶向富集作用与粒径大小有关，该粒径可用通用的纳米粒径测定仪如激光粒度仪或扫描电镜法测定。所说的脾靶向DNA递送系统的粒径范围为50～500nm，优选为100～400nm。
本发明的纳米粒表面附着特异性的亲水性材料，可以规避肝脾等器官或组织中巨噬细胞的吞噬，通称为“隐形”纳米粒。纳米粒表面附着亲水性高分子材料可以选自聚乙二醇、聚氧乙烯、聚氧乙烯丙烯共聚物，亲水性部分分子量视链长而定，一般分子量越大，链长越长，脾靶向效果越佳。分子量可以是400～30000，优选为2000～10000。
本发明的脾靶向给药系统，表面附着亲水性高分子材料可通过在制备纳米粒时选用特定的起始材料制备。起始材料之一为聚乙二醇与脂溶性高分子的嵌段共聚物，尤其选自聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯。所述聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯采用文献方法制成，该方法通过氰基乙酸与甲氧基聚乙二醇反应生成聚乙二醇氰基乙酸酯，氰基乙酸与碳链为4～37(优选为12～22)的醇反应生成氰基乙酸烷基酯，二种中间体通过碳二亚胺聚合生成聚乙二醇氰基丙烯酸酯。聚乙二醇的链长通过选择不同分子量的甲氧基聚乙二醇起始原料进行调整，一般聚乙二醇的分子量为400～30000，优选为200～10000。聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚乙二醇与烷基的比例对维持“隐形”化与脂溶性十分重要，聚乙二醇比例太多时，高分子材料本身水溶性太强，难以制成纳米粒；烷基比例太高时，虽然能提高脂溶性，降低制备时的难度，但同时降低制成的纳米粒表面的聚乙二醇密度，使脾靶向性富集能力降低。聚乙二醇与烷基摩尔比常用为2∶1～1∶8，优选为1∶1～1∶5。
本发明的脾靶向给药系统，表面附着亲水性高分子材料的起始材料还可以是聚氧乙烯硬脂酸酯，通称为卖泽，聚氧乙烯部分的分子量为400～10000，优选为2000～10000。通过纳米粒制备时将该起始材料以一定比例混入其他高分子材料如聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯等中制备。
本发明的脾靶向给药系统，表面附着亲水性高分子材料的起始材料还可以是聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，通称为泊洛沙姆，聚氧乙烯聚氧丙烯部分的分子量为1000～10000，优选为2000～10000。通过纳米粒制备时将该起始材料以一定比例混入其他高分子材料如聚乳酸、聚氰基丙烯酸烷基酯等中制备。
本发明所说的质粒DNA，或DNA疫苗可按现有技术制备，如已知文献报道和专利所公开的技术方案Norman JA、Montgomery DL及Hartikka J(Norman JA，et al.Vaccine.1997，158801-803；Montgomery DL，et al.DNA and CellBiology.1993，129777-783；Hartikka J，et al.Human Gene Therapy.1996，71205-1217)，专利号PCT WO97/28259，专利号PCT WO98/52581，专利号PCT WO98/06863，或《核酸疫苗》(孙树汉著)等。
图1是聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯脾靶向隐形纳米粒体内组织分布图。
图2是静脉注射质粒DNA共聚集显微镜照片，其中，左图是2小时结果，右图是4小时结果。
具体实施例方式
实施例1聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯脾靶向DNA纳米粒精称甲氧基聚乙二醇2000 11g(5.5mmol)与氰基乙酸0.935g(11mmol)，置于容积为250ml的三颈瓶中，加入30ml二氯甲烷，超声使其溶解。然后在磁力搅拌的条件下，加入2.27g(11mmol)缩合剂碳二亚胺，通入氮气少许，室温下连续搅拌6小时。过滤，滤渣用15ml二氯甲烷洗三次，合并滤液，将滤液减压浓缩至粘稠状，室温下固化，即得聚乙二醇氰基乙酸酯。得浅黄色蜡状固体。
精称十六醇1.33g(5.5mol)或二十二醇1.85g(5.5mol)与氰基乙酸0.935g(11mmol)，置于容积为250ml的三颈瓶中，加入30ml二氯甲烷，超声使其溶解。然后在磁力搅拌的的条件下，加入2.27g(11mmol)缩合剂碳二亚胺，通入氮气少许，室温下连续搅拌6小时。加入25ml正己烷后，过滤，滤渣用15ml二氯甲烷洗三次，合并滤液，将滤液减压浓缩至粘稠状，室温下固化，即得十六烷基或二十二烷基氰基乙酸酯。得乳白色固体。
精称上述合成的聚乙二醇氰基乙酸酯及十六烷基氰基乙酸酯，分别以1∶1；1∶2；1∶3；1∶4；1∶5不同的投料比投料，置于容积为250ml的三颈瓶中，加入乙醇与二氯甲烷(1∶1)的混合溶液，超声分散溶解。注入37％(w/v)甲醛溶液(7.5mmol)及33％(w/v)二甲胺溶液(7.5mmol)，在通氮气的条件下，室温下反应8小时。减压浓缩，浓缩液倾入水中洗涤，再用二氯甲烷进行萃取，分离出有机相，加入无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩至粘稠状，室温真空下放置固化，即得聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯。
取合成的聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯，溶于10ml四氢呋喃中，将绿色荧光蛋白质粒DNA浓溶液分散于上述四氢呋哺溶液中，在1000转/分钟机械搅拌的条件下，注入50ml超纯水中，室温下搅拌2h，即得纳米粒悬液，按纳米粒与冻干保护剂甘露醇1∶5的比例以现有通用技术冷冻干燥，得纳米粒冷冻干燥制剂。以市售PicoGreen试剂盒，测定所包载DNA的含量，载药量介于0.1～1％。
实施例2聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯脾靶向DNA纳米粒聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯的合成同实施例1中聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯。主要区别在于以二十二醇代替十六醇。
纳米粒的制备同实施例1中方法，以聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯代替聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯。
实施例3隐形固体脂质纳米粒脾靶向DNA递送系统高温蒸发-低温固化法取0.1g硬酯酸，超声微热溶于5mL丙酮，将绿色荧光蛋白质粒DNA浓溶液分散于该丙酮溶液中，构成有机相；另取0.1g麦泽59溶于30mL水中构成水相；有机相以6#针头注入1000r/min搅拌的(75±2)℃，搅拌3h，有机相完全蒸发，所得约20mL溶液迅速倒入另一1000rpm搅拌的30mL水相(冰水浴)中，搅拌1h，得硬脂酸纳米粒胶体混悬液。经通用方法冷冻干燥得隐形固体脂质纳米粒。
实施例4乙肝DNA疫苗脾靶向聚乙二醇十六烷基氰基丙烯酸酯纳米粒递送系统按实施例1的方法。以已知的乙肝DNA疫苗替代绿色荧光蛋白质粒DNA，以相同方法制成脾靶向乙肝DNA疫苗纳米粒递送系统。
实施例5乙肝DNA疫苗脾靶向聚乙二醇二十二烷基氰基丙烯酸酯纳米粒递送系统按实施例2的方法。以已知乙肝DNA疫苗替代绿色荧光蛋白质粒DNA，以相同方法制成脾靶向乙肝DNA疫苗纳米粒递送系统。
实施例6乙肝DNA疫苗脾靶向固体脂质纳米粒递送系统按实施例3的方法。以已知乙肝DNA疫苗替代绿色荧光蛋白质粒DNA，以相同方法制成脾靶向乙肝DNA疫苗纳米粒递送系统。
实施例7脾靶向隐形纳米粒脾脏富集测定为验证脾靶向隐形纳米粒在脾脏的富集作用，以3-14C标记的氰基乙酸为起始原料按实施例1中的操作步骤合成具有放射性的高分子材料，并制成放射标记的脾靶向纳米粒，小鼠尾静脉注射后，用液闪法测定心、肝、脾、肺、肾等组织中放射性，以判断脾靶向纳米粒的脾脏富集作用。结果表明，脾靶向纳米粒在脾脏的摄取显著高于在其它组织中。
实施例8脾靶向DNA隐形纳米粒在体内的表达将脾靶向绿色荧光蛋白质粒DNA纳米粒小鼠尾静脉注射，处死小鼠后即取脾脏乙醇固定，病理切片，于共聚焦显微镜下观察，结果表明，在注射2小时后，绿色荧光蛋白在脾脏中大量表达。
权利要求
1.一种脾靶向DNA递送系统，含有DNA，其特征在于所述的递送系统由DNA与一种或多种高分子材料组成纳米粒，其表面附着亲水性高分子材料。
2.按权利要求1所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的递送系统其中所含DNA为纳米粒总重的0.01％～10％。
3.按权利要求1或2所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的递送系统其中所含DNA为纳米粒总重的0.1～1％。
4.按权利要求1所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的纳米粒粒径为50～500nm。
5.按权利要求1或4所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的纳米粒粒径为100～400nm。
6.按权利要求1所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的纳米粒表面附着亲水性高分子材料选自聚乙二醇、聚氧乙烯或聚氧乙烯丙烯共聚物，分子量为400～30000。
7.按权利要求6所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的纳米粒表面附着亲水性高分子材料分子量为2000～10000。
8.按权利要求1所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的DNA为质粒DNA。
9.按权利要求1所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的脾靶向给药系统其表面附着亲水性高分子材料的起始材料为聚乙二醇与脂溶性高分子的嵌段共聚物。
10.按权利要求9所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的脾靶向给药系统其表面附着亲水性高分子材料的起始材料为聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯。
11.按权利要求10所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯其中聚乙二醇的分子量为400～30000。
12.按权利要求10所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯其中聚乙二醇的分子量为200～10000。
13.按权利要求10所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚氰基丙烯酸烷基酸中烷基碳链为4～37。
14.按权利要求10所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚氰基丙烯酸烷基酸中烷基碳链为12～22。
15.按权利要求10所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚乙二醇与烷基摩尔比为2∶1～1∶8。
16.按权利要求10所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的聚乙二醇聚氰基丙烯酸烷基酯中聚乙二醇与烷基摩尔比为1∶1～1∶5。
17.按权利要求9所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的表面附着亲水性高分子材料的起始材料还可以是聚氧乙烯硬脂酸酯，其中聚氧乙烯部分的分子量为400～10000。
18.按权利要求9所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的表面附着亲水性高分子材料的起始材料聚氧乙烯硬脂酸酯，其中聚氧乙烯部分的分子量为2000～10000。
19.按权利要求9所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的表面附着亲水性高分子材料的起始材料还可以是聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，其中亲水部分分子量为1000～10000。
20.按权利要求9所述的脾靶向DNA递送系统，其特征在于所述的表面附着亲水性高分子材料的起始材料聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，其中亲水部分分子量为2000～10000。
全文摘要
本发明涉及纳米药物制剂领域，具体提供一种脾靶向DNA递送系统，为一种可静脉注射递送质粒DNA，在脾脏富集的纳米粒给药系统。本递送系统由DNA与一种或多种高分子材料组成的纳米粒，纳米粒表面附着特异性的亲水性材料，可以规避肝脾等器官或组织中巨噬细胞的吞噬，其中含DNA为纳米粒总重的0.01％～10％，纳米粒粒径为50～500nm，可通过静脉注射，将DNA疫苗靶向定位于脾脏，可诱导较强的免疫应答反应。动物实验表明，脾靶向纳米粒在脾脏的摄取显著高于在其它组织中，脾靶向DNA隐形纳米粒在脾脏中大量表达。
文档编号A61K48/00GK1679965SQ20051002313
公开日2005年10月12日 申请日期2005年1月5日 优先权日2005年1月5日
发明者吴伟, 黄敏, 魏秀莉, 汪杨 申请人:复旦大学