专利名称：从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及分离所得神经元的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及了一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及其 用该方法得到的多巴胺能神经元来治疗帕金森综合症的用途。
背景技术：
帕金森综合症是一种自发的、缓慢发展的、中枢神经系统退化性的疾病，它的发病 特征为运动缓慢、肌肉僵硬、静止震颤和姿势不稳。现已发现它是由黑色、蓝斑以及其它脑 干多巴胺能细胞中着色的神经元持续恶化后所产生的症状，导致神经递质多巴胺的缺失。 在中年以上的人群中，帕金森综合症是危害人们身体健康的第四种常见的神经退化疾病， 它影响了 0. 4%的年过40岁的人和的年过65岁的人。不管患者年龄的大小，对于那些 受到该疾病折磨的患者来说，常常造成毁灭性的结果。造成这种结果的原因是对多巴胺能 神经元的破坏是不可逆的。对于这种疾病的治疗主要希望是发展神经网络的细胞群体，并 使神经系统的功能恢复协调。有些证据已经显示胎儿多巴胺能神经元可恢复帕金森综合症 的化学异常。但是至今没有找到适当的组织。
发明内容
本申请的发明目的在于发现从健康产妇分娩后废弃物人胎盘上的人羊膜组织组 织内的人羊膜上皮细胞中存在许多用于治疗帕金森综合症的多巴胺能神经元，而提供一种 从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法及其用该方法得到的多巴胺能神 经元来治疗帕金森综合症的用途。本发明的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法通过以下方式 进行实施本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包 括以下步骤(1)取新鲜人胎盘组织，将人羊膜组织剥离，用生理盐水反复冲洗除去血凝块，然 后用无菌D-hank’ s液浸泡1. 2-2个小时后，再用生理盐水漂洗2_5次；(2)将漂洗过的人羊膜置于0. 25%的胰蛋白酶溶液中，在36. 5°C -37. 5°C的温度 下消化10-20分钟；(3)用含有10%胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜组织在胰蛋白酶溶液中的 消化，然后用180-220目细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；(4)分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10%无胎牛血清的培养基对分离出来的上 述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养；(5)选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细胞分
化培养基继续培养；(6)将上述人羊膜上皮细胞在神经干细胞分化培养基中培养7-14天后，对收获部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析，得到了含有多巴胺 能神经元样细胞的细胞；(7)收获所有上述细胞。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中所 述的步骤(1)中的无菌D-hank，S液含有1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素、100U/ml庆 大霉素和2. 5ng/ml两性霉素。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中在 所述的步骤(1)中，人羊膜组织用无菌D-hank’ S液浸泡1. 5个小时后，再用浓度为0. 9% 的生理盐水漂洗3次。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中在 所述的步骤(2)中，人羊膜在37. °C的温度下消化15分钟。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中在 所述的步骤(3)中，用200目细胞筛对上述溶液进行过滤。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中 所述的步骤(5)中的神经干细胞基础培养基每毫升含有15%的血清、200ng的Sonic hedgehogSHH、IOOng的成纤维细胞生长因子8、IOng的碱性成纤维细胞生长因子8、200 μ M 的维生素C和20ng的脑源性神经营养因子。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中所 述的步骤(6)中的定量分析是利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后在倒置生物 显微镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中所 述的步骤(4)中的体外传代培养是在温度为37°C、湿度为95%和5%的二氧化碳的孵化箱 内进行的，步骤(5)中人羊膜上皮细胞的一代的繁殖时间为10-12天。本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其中所 述的无菌D-hank’ s、DMEM/F12和无胎牛血清的培养基为市售产品。本发明的用途为用所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方 法中得到的多巴胺能神经元来治疗帕金森综合症。本发明利用健康产妇分娩后医疗废弃物人羊膜组织来源人羊膜上皮细胞，体外培 养诱导分化酪氨酸阳性多巴胺能神经元，用于帕金森病的治疗。人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells, hAECs)源于胚胎早期，保持类似胚胎干细胞的多分化潜能， 可分化为内胚层(胰、肝)、中胚层(心肌细胞)和外胚层(神经细胞)。其中具有神经干 细胞(神经细胞)特性的人羊膜上皮细胞是细胞替代治疗神经系统疾病的良好细胞来源。人羊膜上皮细胞经10% FCS(FCS胎牛血清)培养基体外培养，可以获得纯度在 85%酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元样细胞，帕金森病动物模型脑内纹状体移植，不仅 可以改善帕金森病动物模型的行为障碍，脑内组织形态学异常也得到改善，我们的研究证 实移植动物脑内黑质多巴胺能神经元明显优于正常对照。
图IA-图IC为用本发明的方法培养出的细胞在显微镜下的显示，证明用本发明的方法可以培养出多巴胺能神经元样细胞；图2A-图2D为多巴胺能表型分化和神经发生相关基因；图3A-图3C为将本发明培养的细胞移植到小鼠的脑内后，对小鼠进行切片分析， 得到的酪氨酸羟化酶阳性细胞、人羊膜上皮细胞和外源性酪氨酸羟化酶阳性细胞在小鼠脑 内的表达；图4A-图4C为将本发明培养的细胞移植到小鼠的脑内后，对小鼠进行切片分析， 得到的酪氨酸羟化酶阳性细胞、抗人核抗原和外源性酪氨酸羟化酶阳性细胞在小鼠脑内的 表达。
具体实施例方式本发明的一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包 括以下步骤(1)取新鲜人胎盘组织，将人羊膜组织剥离，用生理盐水反复冲洗除去血凝块，然 后用市售的无菌D-hank’ s液浸泡1.5个小时后，再用0. 9%的生理盐水漂洗3次，无菌 D-hank，s液含有1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素、100U/ml庆大霉素和2. 5ng/ml两性
霄素；(2)将漂洗过的人羊膜置于0. 25%的胰蛋白酶溶液中，在37°C的温度下消化15分 钟；(3)用含有10%胎牛血清的DMEM/F12(市售的)终止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液 中的消化，然后用200目细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；(4)分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10%市售的无胎牛血清的培养基对分离出 来的上述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养，该体外传代培养的环境是在温度为37°C、湿 度为95%和5%的二氧化碳的孵化箱内进行的；(5)选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，人羊膜上皮细胞的一 代的繁殖时间为10-12天，然后用神经干细胞分化培养基继续培养，神经干细胞分化培养 基每毫升含有15%的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、IOOng的成纤维细胞生长因子 SUOng的碱性成纤维细胞生长因子8、200 μ M的维生素C和20ng的脑源性神经营养因子；(6)将上述人羊膜上皮细胞在神经干细胞分化培养基中培养7-14天后，对收获部 分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，由于多巴胺能神经元样细胞带有酪 氨酸羟化酶，所以通过确认酪氨酸羟化酶的存在，就可以确认多巴胺能神经元样细胞的存 在。并利用免疫荧光细胞化学双标记法进行定量标记分析，然后在倒置生物显微镜下选择 至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍，得到了含有多巴胺能神经元 样细胞的细胞；(7)收获上述所有细胞。用从上述方法中得到的多巴胺能神经元样细胞来治疗帕金森综合症，即用上述方 法得到的多巴胺能神经元细胞向患有金森综合的病人的脑内进行移植。对本发明的所得到的部分细胞利用免疫荧光细胞化学双标记法进行定量标记和 分析，可以在显微镜下看到如图IA所示的用红色荧光标记的(由光点表示出)的酪氨酸羟 化酶、如图IB所示的用蓝色荧光标记的(由亮点表示的)所有细胞核和如图IC所示的用上述两种荧光共同标记的(由亮点表示的)多巴胺能神经元样细胞。通过上述三个图向人 们显示出用本发明的方法所得到的细胞存在一定数量的多巴胺样神经细胞，可以作为用 于治疗帕金森病的细胞来源。用本发明的方法所得到的部分细胞进行相应的基因检测，得到图2所示的多巴 胺能表型分化和神经发生相关基因；图2A-图2B分别表示多巴胺能表型分化相关基因 MathUNGN2 ；图2C-图2D分别表示神经发生相关基因Mashl、N0thl ；可以证明用本发明的 方法所得到的细胞含有生成多巴胺能神经元样细胞的基础。将本发明所得到的细胞移植到小鼠脑内，在显微镜下对小鼠的脑进行切片分析， 图3A显示出在小鼠脑内有用FITC(绿色荧光)标记的酪氨酸羟化酶。用本发明的方法所 得到的人羊膜上细胞在体外经红色荧光素PKH26标记后移植到小鼠脑内，图3B中的亮点显 示小鼠脑内纹状体分布有用PKH26标记阳性人羊膜上皮细胞的表达，图3C显示出小鼠脑 内有用FITC(标记绿色荧光)与PKH26双标记细胞，证实小鼠脑内存在来自外源性移植细 胞的人羊膜上皮细胞，并且这种人羊膜上皮细胞含有多巴胺能神经元细胞。向小鼠脑内移植本申请的从人羊膜上皮细胞中分离出来的细胞，图4A显示出在 小鼠脑内有用FITC(绿色荧光)标记的酪氨酸羟化酶；抗人核抗原为人源细胞的特异性 标记物，图4B显示出存在于小鼠脑内的用红色荧光标记的抗人核抗原免疫荧光染色的人 羊膜上皮细胞；图4C显示出其中部分酪氨酸羟化酶(FITC标记绿色荧光)与抗人核抗原 (Teasered标记红色荧光)双标记细胞(黄色)，说明小鼠脑内存在来自外源性移植细胞的 人羊膜上皮细胞，并且这种人羊膜上皮细胞含有多巴胺能神经元细胞。从以上的试验中可以得出将从人羊膜上皮细胞中诱导分化出来的细胞移植到小 鼠脑后，在小鼠脑内发现了来自外源性移植细胞的人羊膜上皮细胞，并且这种人羊膜上皮 细胞中有多巴胺能神经元细胞。以上方法只是对本发明的解释，不是对发明的限定，本发明所限定的范围参见权 利要求，在不违背本发明的精神的情况下，本发明可以作任何形式的修改。
权利要求
一种从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤(1)取新鲜人胎盘组织，将人羊膜组织剥离，用生理盐水反复冲洗除去血凝块，然后用无菌D-hank’s液浸泡1.2-2个小时后，再用生理盐水漂洗2-5次；(2)将漂洗过的人羊膜组织置于0.25％的胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃的温度下消化10-20分钟；(3)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用180-220目细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；(4)分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10％无胎牛血清的培养基对分离出来的上述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养；(5)选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细胞分化培养基继续培养；(6)将上述人羊膜上皮细胞在神经干细胞分化培养基中培养7-14天后，对收获的部分细胞进行鉴定，确认酪氨酸羟化酶阳性细胞的存在，并进行定量分析，得到了包括多巴胺能神经元样细胞的细胞；(7)收获上述所有细胞。
2.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于所述的步骤(1)中的无菌D-hank，s液含有1000U/ml青霉素、1000U/ml链霉素、 100U/ml庆大霉素和2. 5ng/ml两性霉素。
3.如权利要求2所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于在所述的步骤(1)中，人羊膜组织用无菌D-hank’ s液浸泡1.5个小时后，再用浓 度为0. 9%的生理盐水漂洗3次。
4.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于在所述的步骤(2)中，人羊膜在37. °C的温度下消化15分钟。
5.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于在所述的步骤(3)中，用200目细胞筛对上述溶液进行过滤。
6.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于所述的步骤(5)中神经干细胞分化培养基每毫升含有15%的血清、200ng的Sonic hedgehog SHH、IOOng的成纤维细胞生长因子8、IOng的碱性成纤维细胞生长因子8、200 μ M 的维生素C和20ng的脑源性神经营养因子。
7.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于所述的步骤(6)中的定量分析是利用免疫荧光细胞化学双标记法进行标记，然后 在倒置生物显微镜下选择至少三个低倍视野进行计数分析，该低倍视野的倍数为10倍。
8.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于所述的步骤(4)中的体外传代培养的环境是在温度为37°C、湿度为95%和5%的 二氧化碳的孵化箱内进行的，步骤(5)中人羊膜上皮细胞的一代的繁殖时间为10-12天。
9.如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，其特 征在于所述的无菌D-hank’ s、DMEM/F12和无胎牛血清的培养基为市售产品。
10.用如权利要求1所述的从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法得到的多巴胺能神经元来治疗帕金森综合症的用途.
全文摘要
本发明涉及从人羊膜上皮细胞中诱导分化出多巴胺能神经元的方法，该方法包括以下步骤取新鲜人胎盘，将人羊膜剥离，用生理盐水反复冲洗除后，用无菌D-hank’s液浸泡，再用生理盐水漂洗；将人羊膜置于0.25％胰蛋白酶溶液中，在36.5℃-37.5℃温度下消化；用含有10％胎牛血清的DMEM/F12终止上述人羊膜在胰蛋白酶溶液中的消化，然后用细胞筛对上述溶液进行过滤，收集得到的细胞为人羊膜上皮细胞；分离所获得的人羊膜上皮细胞，用10％无胎牛血清的培养基对分离出来的上述人羊膜上皮细胞进行体外传代培养；选择生长状态良好的3或4或5或6代人羊膜上皮细胞，然后用神经干细胞分化培养基继续培养；收获上述多巴胺能神经元样细胞。
文档编号A61K35/30GK101824399SQ200910079088
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月5日 优先权日2009年3月5日
发明者蔡哲 申请人:中日友好医院