一种羊膜上皮细胞在制备治疗不孕不育症药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，特别涉及一种羊膜上皮细胞在制备治疗不孕不育症药 物中的用途。
【背景技术】
[0002] 不孕不育从功能上讲，指的是人体不能生育。癌症治疗，诸如外科手术，化疗疗法 或者放射治疗，会显著减少原始卵泡的数量，影响荷尔蒙的平衡可能影响自然受孕或干扰 卵巢，输卵管，子宫和子宫颈的机能造成不能成功受孕，造成需要生殖科技辅助或者使用妊 娠代孕的问题。然而不幸的是，化疗或放射治疗后的癌症存活者，几乎没有保持生育能力的 方法，提高患者生活质量需要日益关注，尤其是关于恢复性腺功能和恢复生育能力。干细胞 是唯一既有自我更新又能分化特殊后代的细胞，有证据显明，从骨髓中移植干细胞可以恢 复因对毒害生殖腺侵扰造成的卵巢功能受损，近来，在用来研宄原发性卵巢衰竭的促卵泡 素受体基因缺失小鼠模型中骨髓干细胞移植可以恢复卵泡成熟和类固醇激素的生产，尽管 目前对于干细胞存有争议，但普遍赞同干细胞的效用疗法效用，如骨髓干细胞可改善卵巢 功能。
[0003] 人体羊膜上皮细胞来自胎盘，是在解剖学和组织学上长期专用的胎儿上皮细胞， 具有早期外胚层细胞的多能性。已证明人体羊膜上皮细胞可在体外分化成3个胚层，人羊 膜上皮细胞在产后被丢弃后可在培养中能够不断扩展生成，因此成为再生医学和细胞理疗 的替代资源。在原肠胚形成进程中，在胚胎的外胚层形成的生殖细胞会使原始生殖细胞和 躯体系统分离，将原始生殖细胞移动到生殖嵴，因为人体羊膜上皮细胞是先于原肠胚形成 产生，所以人体羊膜上皮细胞有可能分化成生殖细胞。近来，有报道在媒介中生成的人体羊 膜上皮细胞能够分化成类似卵泡的细胞有表现生殖细胞的特异标志物
【发明内容】
[0004] 因此，本发明要解决的技术问题就是针对目前临床上缺乏治疗由卵巢功能减退所 引发的不孕不育症药物的问题，提供了一种羊膜上皮细胞在制备治疗不孕不育症药物中的 用途以及羊膜上皮细胞的制备方法。
[0005] 因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一为：一种羊膜上皮细胞在 制备治疗不孕不育症药物中的用途。
[0006] 本发明所述羊膜上皮细胞为本领域常规的羊膜上皮细胞，其来源为本领域常规来 源，较佳地为来源于人类的羊膜上皮细胞。本发明所述羊膜，也可称作胎膜，是母体与胎儿 间进行物质交换的重要组织。羊膜主要分为上皮层、基底层、致密层、纤维母细胞层和海绵 层五部分。人羊膜细胞主要由上皮层的羊膜上皮细胞和基底层的间质细胞构成，是发育中 的胎儿的联系紧密的胚胎发育早期产物。羊膜上皮细胞可表达早期干细胞的一些不同标 记，如神经细胞特意的胶质纤维相关蛋白，神经元特异性标记，神经干细胞特异性标记，肝 薄壁组织细胞蛋白，甲胎蛋白等等。本发明所述羊膜上皮细胞的来源非常广泛，不会产生伦 理或者道德问题。
[0007] 本发明所述不孕不育症是本领域常规的不孕不育症，从功能上是指人体不能生 育。其中所述不孕不育症的致病原因为本领域常规致病原因，较佳地是指由于卵巢功能减 退引起的不孕不育症，更佳地是由放射治疗，化疗或者外科手术所引起的不孕不育症。
[0008] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二为：一种羊膜上皮细胞的培养 方法，所述培养方法包括以下步骤：从胎盘分离羊膜绒膜，将所得羊膜绒膜分割成切片，将 该切片溶于乙二胺四乙酸形成羊膜细胞悬液，将所得羊膜细胞悬液接种在细胞培养基中 35°C -37°C培养即得。
[0009] 本发明所述分离为本领域常规分离技术，是指从组织样品中移出细胞且与另外的 非组织干细胞分开。使用任何常规技术或方法将完整的组织分离为单细胞。这些技术或方 法包括机械力，如切碎力或剪切力，或者用一种或多种蛋白酶例如胶原酶，胰蛋白酶，脂肪 酶或者胃蛋白酶进行酶消化，或者机械力与酶消化组合的技术或者方法。其中所述切片的 面积为本领域常规面积，所述切片的面积较佳地为0. 5-1. Om2。
[0010] 本发明所述细胞培养基没有限制，只要可用于羊膜上皮细胞培养的培养基即可， 所述细胞培养基较佳地为1640培养基，更佳地，所述1640培养基中包含10 %葡萄糖，IOOU/ mL链霉素，lOOU/mL青霉素以及0.3mg/mL谷氨酸盐，所述百分比为质量百分比。本发明所 述细胞培养条件没有限制，只要可用于羊膜上皮细胞的培养即可，所述培养条件较佳地为 培养温度37°C，培养时CO 2含量5%，所述百分比为体积百分比。其中所述细胞培养基中还 可以添加人全血清、脐带血清或者人工脑脊液等。
[0011] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0012] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0013] 本发明的积极进步效果在于：本发明所述羊膜上皮细胞能够有效治疗或者改善由 于卵巢功能衰退所导致的不孕不育症，显著提高了功能衰退导致的不孕不育症患者体内卵 泡的生成，而且羊膜上皮细胞的增殖是可控的，利用羊膜上皮细胞进行移植治疗是安全的， 此外羊膜上皮细胞的来源非常广泛，不会产生伦理或者道德问题，因此本发明为今后临床 治疗或者改善不孕不育症提供了新的有效选择。
【附图说明】
[0014] 图1为人体羊膜上皮细胞移植14天的小鼠的卵巢产生的基本卵泡组织学检测结 果。
[0015] 图2为人体羊膜上皮细胞移植20天的小鼠的卵巢产生的基本卵泡组织学检测结 果。
[0016] 图3为人体羊膜上皮细胞移植两个月的小鼠的卵巢产生的基本卵泡组织学检测 结果。
[0017] 图4为利用人体抗原使用免疫化学方法检测移植细胞人体卵泡刺激素受体表达 的结果。
[0018] 图5为利用人体抗原使用免疫化学方法检测在卵子周围的颗粒细胞中人体卵泡 刺激素受体表达的结果。
[0019] 图6为人体羊膜上皮细胞移植28天后使用绿色荧光蛋白和抗人核抗体染色的卵 巢切片显示移植的人体羊膜上皮细胞的检测结果。
[0020] 图7为绿色荧光人体羊膜上皮细胞移植受体小鼠两个月后，在受体卵巢的窦状卵 泡中，绿色荧光蛋白染色与人体核抗体共同定位检测结果。
【具体实施方式】
[0021] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0022] 实施例1人体羊膜上皮细胞的准备和培养
[0023] 本发明人胎盘均在足月妊娠获得，获得未携带艾滋病和肝炎病毒B和C的妇女同 意后，可在剖腹产过程中取走胎盘，剖腹产中一般是臀位先露，如遇胎儿窘迫以及双胞胎症 状，需再次操作。本发明中使用的人体羊膜已获伦理委员会同意。从胎盘手动剥离羊膜绒膜 放置于250毫升含有1640细胞培养基的烧瓶内，再用剃刀将它分割成0. 5平方米和I. 0平 方米的切片，在37°C将这些切片在45分钟内溶于乙二胺四乙酸。由此产生的细胞悬液接种 在加入1640细胞培养基的6孔板中，并已补充添加10%葡萄糖（PAA Laboratories GmbH， Colbe，Germany)，链霉素（100U/mL，Gibco, Grand Island，NY，USA)，和青霉素（100U/M1 ; Gibco，Grand Island，NY)以及谷氨酸盐（0.3mg/Ml ;Gibco)，在37°C下二氧化碳含量在5% 的湿润空气中培养。当人体羊膜上皮细胞覆盖量达到80%到90%，其细胞就可以用来做实 验。
[0024] 实施例2人体羊膜上皮细胞的转染和移植以及实验结果
[0025] 实验动物的准备：选C57BL/6野生雌性小鼠作为接受者，6周龄（18. 15±0. 16g按 照重量），腹内注射白消安（Sigma-Aldrich，30mg/kg ;二甲基亚研；中重悬（DMSO))和环磷酰 胺（Sigma-Aldirich，120mg/kg ;DMS0)，对照组的小鼠模型只注射二甲基亚研^，本申请所有 实验操作均获得上海药物研宄所实验动物管理与使用委员会的批准，执行国家研宄理事会 对实验动物护理和使用指南。
[0026] 将实施例1所得人羊膜上皮细胞培养到密度达到80% -90 %时，加入慢性病毒增 强绿色荧光蛋白（该质粒的构建方法请参考文献：Liu T，Wu J，Huang Q，Hou Y，Jiang Z， Zang S?Guo L：Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock 2008, 29 :603-611.)，在细胞里培养，经过24小时的孵化，根据公式：1 X IO5癌细胞X % EGFP阳性细胞X 1，000/ μ 1毫升病毒，在癌细胞上不断稀释矢量，再使用集中浮层滴定。慢 性病毒矢量是IX IO8-IX IO9TUAil。再经过2天的分化，通过