脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及间充质干细胞的用途，具体是脐带间充质干细胞的培养上清在肺间质 纤维化治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 肺间质纤维化（Pulmonary Fibrosis，PF)是弥漫性肺间质纤维化的简称，是由 于多种原因引起肺泡壁炎症，继之肺间质形成大量纤维结缔组织和肺结构紊乱的一组异 型疾病。患者病情重，病死率高，严重危害人类健康。迄今为止，其病因、发病机制尚不明 确，临床尚缺乏任何有效的治疗手段。激素虽然对以炎症为主的非特异性间质性肺炎有一 定效果，但不能减缓肺纤维化和肺功能下降的进程，因而对特发性肺纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)的治疗效果差。肺移植是其中一项可选择的治疗策略，但受限 于供体的来源及巨额的医疗费用，对于许多患者，通常仅仅接受一些经验型的治疗和对症 支持治疗。因此，开发新的有效治疗策略显得尤为迫切。
[0003] 近年，以干细胞为基础的细胞治疗引起了人们的极大兴趣。其中，间充质干细胞 (MSCs)作为一群能够分化成许多不同的细胞系和发挥抗增殖、免疫调节、抗炎作用的多能 干细胞，由于其多能性、迁移能力、低免疫原性等特点引起了人们对其治疗潜能的极大关 注。研究发现，间充质干细胞可到达损伤局部，抑制炎症反应，并有助于上皮组织的修复，已 被建议作为IPF治疗的一个潜在方法。事实上，骨髓间充质干细胞有望应用于多种疾病的 治疗，包括严重的移植物抗宿主病，糖尿病胰岛和肾小球修复，脓毒症，急性肝功能衰竭，缺 血性急性肾功能衰竭,急性肺损伤,改善缺血损伤后心功能。同时，间充质干细胞可分化为 许多类型的细胞，因此可用于脊髓损伤，中风后和结缔组织损伤等的组织再生。研究表明， 间充质干细胞可促进弹性蛋白酶诱导肺气肿的组织再生，定位到石棉引起的肺损伤部位， 帮助肺动脉高压大鼠模型的组织重构，减轻卵清蛋白介导的小鼠哮喘模型气道慢性炎症， 恢复内毒素诱导的急性肺损伤后肺泡和肺液的平衡，调节放射性肺损伤相关的纤维化反 应。
[0004] 一些临床前数据表明，间充质干细胞减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。Lee等 发现静脉给予MSCs能够降低博莱霉素诱导的肺水肿，中性粒细胞浸润，胶原沉积和总死亡 率。同样，Ortiz等报告，在小鼠博莱霉素处理后，MSCs募集到肺损伤的部位，导致减少炎 症，降低纤维化和细胞外基质的胶原沉积，促进组织的修复。透明质酸酶的鼻腔给药则通过 招募间充质干细胞到损伤肺从而减轻博莱霉素的损伤效果。同样，胎盘来源的干细胞，也可 定位于肺组织，降低博莱霉素导致的相关组织损伤。脐带干细胞也可聚集到博莱霉素所致 的肺损伤部位，抑制促炎性细胞因子的产生，并减少肺损伤和胶原沉积。虽然确切的作用机 制尚未完全阐明，但用博莱霉素（BLM)模型的观察表明，肺损伤通过可溶性因子如G-CSF和 GM-CSF的产生而募集骨髓间充质干细胞，并通过SDF-1/CXCR4轴介导其增殖和迁移。同样， IPF患者MSC高表达CXCR4, IPF患者肺组织中CXCR4和SDF-I也比对照组患者的肺组织更 高。尽管如此，也有一些采用博莱霉素肺损伤模型的研究并没有取得阳性结果。Aguilar 等利用造血干细胞（HSCs)和间充质干细胞作为载体，将角质细胞生长因子（KGF)带入BLM 小鼠的肺脏，结果仅有转导的造血干细胞能减轻肺组织损伤，而MSC并没有改变博莱霉素 损伤的组织病理学变化，尽管减少了胶原I a ImRNA的表达。这项研究还表明，KGF转基因 HSCs减轻了 BLM诱导的肺损伤，同时导致肺泡II型上皮细胞增殖。因此，深入理解MSC的 生物学特性，认识疾病特定的免疫微环境对MSC疗效的影响，进而有效提高MSC的治疗效果 是治疗PF的关键。
[0005] 因此，本领域仍需要深入研究MSC的增殖、分化、调节等生物学特性，进而利用这 些特性，更好的发挥其特定疾病中的治疗价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供脐带间充质干细胞的新用途，即它在制备治疗肺间质纤维化 的药物制剂中的应用。
[0007] 进一步地，所述脐带间充质干细胞的培养上清由以下方法制备：将脐带间充质干 细胞种植于多孔板，加入无血清培养基培养48h，收集培养上清。
[0008] 进一步地，所述脐带间充质干细胞经IFN- Y预处理。
[0009] 进一步地，所述脐带间充质干细胞的培养上清由以下方法制备：将脐带间充质干 细胞种植于多孔板，加入重组IFN-γ作用24小时，PBS清洗3次，加入无血清培养基培养 48h，收集培养上清。
[0010] 进一步地，所述药物制剂是气管内给药喷雾剂。
[0011] 进一步地，所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而得：从脐带中分离提取间充 质干细胞，经过原代培养和传代培养后得到。
[0012] 进一步地，所述脐带间充质干细胞由以下方法制备而得：取胎儿娩出后结扎的脐 带，经冲洗、消毒，置于脐带保存液中，2~8°C恒温保存，用无菌组织剪将华通氏胶体剪切 成1~4mm 3的组织匀楽块，加入适量培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱培养，第14~ 18天，细胞克隆团的面积百分比到达70~80%时，消化收获，得到PO代细胞，之后进行消 化、传代，将需冻存的细胞放置于程序性降温仪中，按照标准冻存程序降至_80°C以下。
[0013] 进一步地，所述间充质干细胞的⑶90、⑶29、⑶73、⑶105、⑶44、⑶166表达均大于 95%，CD45、CD14、HLA-DR 表达均小于 2%。
[0014] 一种治疗肺间质纤维化的药物组合物，其包含前述的脐带间充质干细胞的培养上 清。
[0015] 本发明通过实验证明：用IFN-Y预处理脐带间充质干细胞表型能引起IP-10、 PGE2的mRNA表达水平升高，用IFN-γ预处理脐带间充质干细胞能引起培养上清中IP-10、 PGE2的表达水平明显升高。
[0016] 本发明通过实验证明：MSC所高分泌的IP-10具有对抗肺纤维化过程中成纤维细 胞的聚集作用，而PGE2可明显抑制IPF患者成纤维细胞的活化。
[0017] 由于博来霉素（BLM)会伤害肺部造成肺纤维化或严重的间质性肺病，已经成为当 今经典的动物肺纤维化模型的诱导剂。选用BLM作为诱导剂，经气管内给药诱导小鼠肺纤 维化，分析小鼠成活率和肺组织病理学评分，动态观察小鼠肺组织形态学变化，实验结果表 明，采用IFN-Y预处理的脐带间充质干细胞的培养上清治疗肺纤维化的小鼠，可明显提高 小鼠成活率，减轻BLM诱导的肺纤维化肺部病变，明显降低小鼠肺组织病理学评分。
[0018] 本发明的有益效果是：
[0019] 1本发明通过一系列实验证明了 IFN-Y预