专利名称：一种可产生包装大片段rna病毒样颗粒的双质粒表达系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可产生包装大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统，属于生 物技术领域。
背景技术：
RNA病毒如丙型肝炎病毒(H印atitis C virus, HCV)、人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coro瞎irus, SARS-CoV)、高致病禽流感病毒H5N1等是一类 可致人类严重疾病的病原体。病毒RNA检测对于感染的早期诊断，以及抗病毒治疗疗 效的动态观察，是一个必不可少的手段。从二十世纪九十年代初开始，人们逐渐采用 分子诊断方法(Molecular diagnostic assay)来检测病毒RNA，此类技术灵敏特异 使之成为许多病毒RNA的主要检测方式，甚至唯一的检测方式。目前最常用的检测方 法包括实时荧光定量PCR (real time reaverse transcription PCR, RT-PCR)、核酸 序列依赖性扩增NASBA、 branched chain DNA RT — PCR检测法和连接酶酶促链式反应 (LCR)、转录介导的扩增(TMA)。
使用分子诊断方法检测RNA病毒要得到可靠的结果，必须要有严格的质量控制措 施，很关键的一点就是要有特定RNA病毒的质控品。同时，要对病毒进行定量测定， 通常还须有RNA病毒标准品。目前RNA病毒扩增检测的质控品和标准品包括裸RNA片 段、病毒颗粒以及带盔甲的RNA (armored RNA)。裸露的RNA易于受到广泛存在的核糖 核酸酶(RNA nuclease, ribonuclease， RNase)的降解，而且，用裸露的RNA作为 标准品的另一个缺陷是其不能够对检测的全过程进行监测，因为样本中一般有RNase 的存在，直接将其加入样本会被降解，即使将其加入裂解液中，也会使标准品受到样 本中的RNase降解。用病毒颗粒作为标准品时，由于病毒颗粒有传染性，而且，其制 备运输困难，所以，尽管目前有人应用牛腹泻病毒(BVDV)作为检测HCV的内部标准 品，或者用HCV病毒颗粒作为检测HCV RNA的标准品代替冊O提供的HCV标准品，或 者用HIV病毒颗粒作为通用的病毒RNA标准品。但是，这些技术无法克服病毒颗粒传 染性、病毒颗粒制备运输困难等问题，也就是说病毒颗粒不是理想的标准品。鉴于上述二种标准品的缺陷，需要设计一种制备简单、定量容易、耐RNase的RNA检测标准 品。DuBois等发明的arraored RNA技术可以满足上述要求，制备耐RNase、无生物传 染性的RNA。 armored RNA是MS2噬菌体样病毒样颗粒，是MS2噬菌体的包膜蛋白与 RNA的复合物。DuBois等用单质粒表达系统表达病毒样颗粒，在构建质粒时，利用分 子克隆技术依次将MS2的成熟酶蛋白、包膜蛋白、包装位点以及病毒标准品序列克隆 到表达载体的下游，经过诱导表达，包膜蛋白组装成病毒样颗粒并将目的RNA包装于 包膜蛋白内。armored RNA制备运输方便、定量容易，并且可以以内部参照物的形式 监测检测的全过程。现如今，armored RNA已广泛用于RT-PCR和branched chain DNA 检测的质控品。但这种方法包装的RNA片段的长度只有500bp左右，当RNA片段长度 超过500bp时，包装效率显著降低。在检测RNA病毒时，尽管大多数RT-PCR试剂盒扩 增的片段不超过500bp，但如果上述耐RNase的病毒样颗粒能包装长片段的RNA，则其 在RNA病毒的临床检测的质量控制和标准化上具有更为广泛的应用价值。例如，采用 bDNA技术检测HIV，所使用的HIV RNA标准品要长至3kb左右。此时，用前述的方法 不可能得到一个内含如此长的外源RNA的可用作质控品和标准品的病毒样颗粒；此外， 就某个特定的病毒的检测而言，不同试剂厂家生产的RT-PCR试剂盒的扩增耙片段可能 是不同的，如果把不同厂家的目的片段构建到一条RNA链上，并且包装入包膜蛋白内， 形成病毒样颗粒，那么不同的实验室之间就可以对结果进行直接的比较；还有如果把 不同病毒要扩增的目的片段构建在一起，形成嵌合体，并包装入病毒样颗粒内，这种 病毒样颗粒就可以作为对同一个标本进行多个病毒的同时检测时可应用的多靶核酸标 准品和质控品，既节省了成本，也减化了操作程序。
MS2是正义单链RNA噬菌体，基因组含有3569个核苷酸，编码4种蛋白质分子-成熟酶蛋白、包膜蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白。包膜蛋白由180个化学结构一致的 亚基组成，每个亚基含有129个氨基酸残基，形成二十面体对称结构。在复制酶5'端 存在着一个由19个碱基(19mer)组成的茎环结构，是包膜蛋白二聚体与RNA相互作 用的部位，这种相互作用形成的复合物是噬菌体自我包装的信号，在复合物的基础上， 成熟酶蛋白与其它包膜蛋白分子结合并在自由能的驱动下形成相应的空间构象，完成 MS2噬菌体的组装。19mer的茎环结构(发夹结构)主要由一个碱基配对茎、一10位 突起的腺嘌呤和4个核苷酸形成的环等三部分组成。碱基序列为5 'ACAUGAGGAUUACCCAUGU3',以复制酶起始密码子为+1位。19mer中仅4个核苷酸的位 置对包膜蛋白的识别特别重要，在保证茎碱基配对情况下，-4、 -7和-IO位的腺嘌呤以及-5位的嘧啶与包膜蛋白相互作用[16]， 3个重要腺嘌呤(-4、 -7、 -10)以不同方 式与包膜蛋白二聚体结合。
R0WSELL等构建了四种RNA茎环结构的适配体，C-variant、 F5、 F6和F7，这些 适配体的二级结构与野生型的不同，其中，C-variant的-5位为胞喷啶，替换了野生 型的尿嘧啶，使C-variant适配体与衣壳蛋白的亲和力与野生型相比提高了 6倍，甚 至是50倍。C-variant适配体与野生型茎环结构之间的重要区别是C_5的N4与_6位 上的磷酸基团的氧原子形成了分子内氢键。
Pickett和Peabody设计了双质粒表达系统表达病毒样颗粒，其中一个质粒表达 包膜蛋白，而另一个质粒表达19mer的包装位点和其下游的3000bplacZ基因。结果发 现，表达的包膜蛋白可以包装含有19mer茎环结构的外源性RNA，但包装的外源性RNA 长度只有500bp，而不是预期的3000bp;另外包装所得噬菌体样颗粒内含有宿主核糖 体RNA(rRNA)。 Pickett和Peabody设计的双质粒表达系统没有包括成熟酶蛋白，但 成熟酶蛋白在病毒样颗粒中对保证被包装基因的完整性是重要的，没有成熟酶蛋白的 病毒样颗粒，其内包装的RNA易被RNase降解。所以Pickett和Peabody的病毒样颗 粒是有缺陷的病毒样颗粒，即缺乏成熟特性，对RNase敏感。在Pickett和Peabody 的另一个实验中，他们调整了包膜蛋白和外源RNA的比例，结果包装的RNA只有目的 RNA，而没有包装宿主RNA，这说明包膜蛋白和外源RNA的比例协调也是非常重要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质 粒表达系统。
为实现上述目的，本发明釆用以下技术方案
一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统，由质粒PET-MC和质粒 pACYC-X组成，其中pET-MC由pET-28(b)整合噬菌体MS2成熟酶蛋白和衣壳蛋白cDNA 构建而成，pACYC-X为PACYCDuet-1整合噬菌体MS2的19mer包装位点和目的RNA的 cDNA构建而成(组成)。
所述pACYC-X为pACYC-3V质粒。
所述pACYC-3V质粒表达包装位点和3种病毒的嵌合体序列. 所述3种病毒的嵌合体序列为SARS-Cov ( SARS-CoVl 、 SARS-CoV2 、 SARS-CoV3)、 一段HCV和二段H5N1 (M300和HA30Q)。
5双表达质粒pACYC-3V和PET-MC系统，存在于大肠杆菌菌株 pACYC-dnet-l-ET-28b中，该大肠杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微 生物中心(地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保 藏日期为2008年3月31日，建议的分类名为大肠埃希氏菌^c/^a^/^co//,保藏号 为CGMCC No.2425。
所述双表达质粒pACYC-3V和PET-MC系统，表达序列表SEQ ID No.l所述的 核苷酸序列。
在本发明中，我们的双质粒系统应用的载体是质粒pET-28 (b)和pACYCDuet-l， 质粒pET-28 (b)和pACYCDuet-l都为低拷贝质粒，拷贝数分别为18-20和18-22。两 者复制子分别为ColEl和P15A，是复制子不同的相容性质粒，并且两者的抗性不同， 所以可以共存于同一个菌株内。两者的启动子同为T7，所以两者的转录效率应是相同 的。基于以上两个质粒的特点，成熟酶蛋白和包膜蛋白构建于pET-28 (b)，而19mer 的包装位点和目的RNA的cDNA构建于pACYCDuet-1，两质粒转化入同一菌株进行表达， 表达的包膜蛋白和RNA的比例应是协调的。另外pACYCDuet-l为双表达载体，有两组 多克隆位点和两个相同的启动子和终止子，所以我们可以把成熟酶蛋白和包膜蛋以及 19mer的包装位点和目的RNA的cDNA分别构建于pACYCDuet-1的两个多克隆位点，这 样表达的包膜蛋白和RNA的比例也应是协调的。
为了包装含有大片段RNA的病毒样颗粒，我们设计了应用双质粒系统来表达病毒 样颗粒，其中一个质粒表达成熟酶蛋白和包膜蛋白，另一个质粒表达包装位点和外源 RNA。这样表达的包膜蛋白只包装外源RNA，而不包装噬菌体的基因序列，所以理论上， 用这种方法包装的外源RNA片段应为3500bp左右。
为了证明双质粒表达系统的效果，我们成功构建了 PET-MC和PACYC-3V，前者表 达成熟酶蛋白和衣壳蛋白，后者表达包装位点和2250bp的3种病毒的嵌合体序列，包 装位点应用的是C-5变异体，并且包装位点的位置放置在目的RNA的中间，距上游 1200bp碱基处。经过诱导成功的表达了病毒样颗粒，表达的病毒样颗粒包装了全长的 2250bp。实验证明，该病毒样颗粒具有很好的稳定性。该含有双表达质粒pACYC-3V 和PET-MC的大肠杆菌菌株命名为pACYC-dnet-1-ET-28b，保藏于中国微生物菌种保藏 委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏日期为2008年3月31日，建议的分类名为大肠埃希氏菌^c力eric力i3 co7i，保藏号为CGMCC No. 2425。发明的优点是本发明构建的双质粒系统表达的病毒样颗粒内含长片段RNA。我 们把不同病毒要扩增的目的片段构建在一起，形成嵌合体，并包装入病毒样颗粒内， 这种病毒样颗粒就可以作为对同一个标本进行多个病毒的同时检测时可应用的多靶核 酸标准品和质控品，既节省了成本，也减化了操作程序。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依 照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内 容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为pET-28a(+)质粒图谱。 图2为PACYCDuet-l质粒图谱。 图3为病毒样颗粒透析后结果。 图4为验证VLP颗粒的结果。 图5为提取TA克隆，电泳结果。 图6为4。C放置的样本10 000/ML，荧光PCR结果。 图7为37。C放置的样本10 000/ML，荧光PCR结果。 图8为室温放置的样本10 000/ML，荧光PCR结果。
具体实施例方式
实施例中采用的质粒、菌种和试剂如下
质粒PET-28 (b)购于Novagen公司
质粒PACYCDuet—'购于Novagen公司
质粒pNCCL由Peabody惠赠。
pGEM-T Easy Vector Systems: 购于Promega公司
产品菌株BL21 (DE3)购于Tiangen公司
限制性内切酶、T4DNA连接酶购于NEB公司、RNA抽提试剂盒购于Qiagen
实施例1: pET-MC的构建
一.扩增MS2的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列
以pNCCL质粒为模板，PCR扩增MS2的成熟酶蛋白和衣壳蛋白序列81-1741。引物5' -CGGTGATCCTGGCTATCGCTGTAGGTAGCC-3' 81-101
5'-CCCA ， AGCTTATGGCCGGCGTCTATTAGTAG-3' 1721-1741
反应体系扩增4管各50u 1: 10*buffer 5ul ; Taq 0. 4ul; DNTP lul ; Primerl lul ; Primer2 lul ; Mgcl2 3ul ; NCCL lul; DEPC水 37.6 ul。
循环参数94°C 3分钟；94°C 30秒，57°C 30秒，72°C 30秒，重复40个循环； 72 °C 2分钟；72 °C 10分钟。
电泳结果表明，扩增的片段长度为1700bp，符合预期。
二. MS2的成熟酶蛋白和衣壳蛋白片段的TA克隆
用常规方法回收电泳胶中的MS2成熟酶蛋白和衣壳蛋白片段，按照试剂盒说明书 将PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接，4"C连接过夜。取5pl连接产物，加入200pl 感受态细菌，轻轻混匀冰浴静置30分钟。将管放入预加温至42。C的循环水浴中，恰恰 放置90S,不要摇动.置于冰上2分钟。加入200ul 37'C预温的LB培养液，37"C振荡 (200rpm)培养1小时。将转化产物涂于含有1004g/ml氨苄青霉素的LB培养板(含 lmol/1 IPTG 4pl， 20mg/ml X-gal 40pl)上，37 。C倒置培养过夜。结果符合预期， 培养基可见蓝、白斑菌落。
三. 提取已转化的TA克隆质粒
挑转化后的7个白色单菌落，接种到含AMP抗生素的LB培养基中，培养基量为 4ml，于37'C、 300rpm/分振摇过夜。将振摇过夜的培养基以10， 000Xg的转速离心5 分钟，倒掉上清，将试管倒置于纸巾上尽量吸干培养液。按照TAKARA质粒提取说明书 操作，提取TA克隆质粒。电泳确定符合预期后，将MS2TA于一2(TC保存。
四. 构建PET-MC质粒
应用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切MS2TA克隆和载体PET-28 (b)， 37'C酶 切四小时。反应体系BSAO. 4ul， hindIII 2ul， BamHI2ul， buffer 5ul， MS2TA41.6ul。
按照NEB说明书操作以上述酶切产物构建PET-MS2质粒。连接体系为10*buffer lul ;连接接酶lul; PET-28 (b) 5ul; MS2 3ul。 4'C连接过夜。取5pl连接产物， 加入200^1感受态细菌，轻轻混匀冰浴静置30分钟。将管放入预加温至42'C的循环 水浴中，恰恰放置90秒，置于冰上2分钟。加入200ul37。C预温的LB培养液，37'C振 荡(200rpm)培养1小时。将转化产物涂于含有100化/ml kana霉素的LB培养板上， 37'C倒置培养过夜。结果平板可见细菌生长，符合预期。
五. 提取PET-MC质粒
8挑转化后的单菌落，接种到含kana抗生素的LB培养基中，培养基量为4ml，于 37°C、 300rpm/分振摇过夜。将振摇过夜的培养基以10， 000Xg的转速离心5分钟， 倒掉上清，将试管倒置于纸巾上尽量吸干培养液。按照TAKARA质粒提取说明书操作， 提取PET-MC质粒。将上述提取的质粒送三博远志生物技术公司测序，测序结果正确。
实施例2: pACYC-3V的构建
一.应用OVERLAP技术扩增六段嵌合段序列
六段序列包括三段SARS-Cov (SARS-CoVl、 SARS-CoV2、 SARS-CoV3)、 一段 HCV和二段H5N1 (M300和HA300)。 第一轮PCR首先扩增六段小序列。
SARS-CoVl的扩增模板pBSSR-V6，由协和医科大学基础所惠赠。扩增 SARS-CoV的15224 15618序列
引物S-SARS1: 5'TATCCAAAATGTGACAGAGCCATG3' LAP-SARS1: 5'ACGCTGAGGTGTGTAGGT GCAGGTAAGCGTAAAACTCATCCAC3'
SARS-CoV2的扩增模板pNCCL-SARS，由本室构建。扩增SARS-CoV18038 18340序列
引物A-SARS2: 5'TAACCAGTCGGTACAGCTACTAAG3，
SARS-CoV3的扩增模板pBSSR7-8由由协和医科大学基础所惠赠。扩增 SARS-CoV 328110 28692序列。
弓I物A-SARS35'ACTACGTGATGAGGAGCGAGAAGAG3'
HCV的扩增模板pNCCL-HCV质粒由本室构建。扩增HCV的18 310序列
HA300的扩增模板pNCCL-H5Nl质粒由本室构建。扩增H5N1的295 61 l序列。 弓l物A-HA300: 5'GAATCCGTCTTCCATCTTTCCCCCACAGTACCAAAAGATCTTC3' HA300LAP: 5'CTGATAGGGTGCTTGCGA GCCGGAATGGTCTTACATAGTGGAG3，
M300的扩增模板pNCCL-H5Nl质粒由本室构建。扩增H5N1的17 373序列。 M300-S， 5' TTGGCCGG丄CC GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG3'M+SLAP15\
第二轮PCR扩增SARS-CoVl十SARS-CoV2 and HCV + HA300 SARS-C0VI+ SARS-CoV2的扩增模板为上述的小片段SARS-CoVl和 SARS-CoV2的胶回收产物。
引物S國SARS1: 5'TATCCAAAATGTGACAGAGCCATG3'
LAP-S ARS2+: 5' ATC AGAC ATTTTAATTTGT TAACC AGTCGGTAC AGCTACTAAG3'
HCV + HA300的扩增模板为上述的小片段HCV禾B HA300的胶回收产物。 弓I物FIVELAP2: 5' CGCTCCTCATCACGTAGT ACATGAGGATCACCCATGTGGC 3' OverlapA， 5 'CCTTAAT 4 TAA CCCACAGTACCAAAAGATCTTCTTG' 第三轮？011扩增8八1^-(30￥1+ SARS-CoV2+ SARS-CoV3
SARS-CoVl+ SARS-CoV2+ SARS-CoV3的扩增应用模板为SARS-CoVK SARS-CoV2和SARS-CoV3的胶回收产物。 弓l物M+SLAP2:
FIVELAP1: 5 ， CATGGGTGATCCTCATGT ACTACGTGATGAGGAGCGAGAAGAG3' 第四轮PCR扩增S ARS-CoV 1 + S ARS-CoV2+S ARS-CoV3 +HC V+H A3 00 SARS-CoVl+ SARS-CoV2+SARS-CoV3+HCV+HA300的扩增应用模板为上述的
SARS-CoVl+SARS-CoV2+SARS-CoV3和HCV+HA300的胶回收产物。
引物M+SLAP2，
OverlapA， 5 'CCTTAAT I TAA CCCACAGTACCAAAAGATCTTCTTG'
第五轮PCR扩增M300+SARS-CoVl + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV + HA300
M300+SARS-CoVl + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV + HA300的扩增应用模
板为上述的SARS-CoVl + SARS-CoV2 + SARS-CoV3 + HCV + HA300和M300的胶回
收产物。
引物M300-S， 5' TTGGCCGG丄CC GAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACG3， OverlapA， 5 'CCTTAAT I TAA CCCACAGTACCAAAAGATCTTCTTG'
二.六段嵌合体序列的TA克隆
用常规方法回收电泳胶中的六段嵌合体片段，按照试剂盒说明书将PCR产物与
10pGEM-T Easy Vector连接，4。C连接过夜。取5^il连接产物，加入200^1感受态细菌， 轻轻混匀冰浴静置30分钟。将管放入预加温至42'C的循环水浴中，恰恰放置90S,不要 摇动，置于冰上2分钟。加入200ul 37。C预温的LB培养液，37。C振荡(200rpm)培 养l小时。将转化产物涂于含有100^g/ml氨苄青霉素的LB培养板(含lmo1/1 IPTG4pl， 20mg/ml X-gal 40M1)上，37 。C倒置培养过夜。结果符合预期，培养基可见蓝、白 斑菌落。
三. 提取已转化的TA克隆质粒
挑转化后的白色单菌落，接种到含AMP抗生素的LB培养基中，培养基量为4ml， 于37°C、 300rpm/分振摇过夜。将振摇过夜的培养基以10， OOOXg的转速离心5分钟， 倒掉上清，将试管倒置于纸巾上尽量吸干培养液。按照TAKARA质粒提取说明书操作， 提取TA克隆质粒。电泳确定符合预期后，将3VTA于一2(TC保存。
四. 构建pACYC-3V质粒
应用限制性内切酶FSEI和PACI双酶切3VTA克隆和载体PACYCDuet-1 ， 37'C酶切 过夜。反应体系BSA0.4ul， FSEI2ul， PACI 2ul， buffer 5ul， 3VTA (PACYCDuet-l) 41. 6ul。
按照NEB说明书操作以上述酶切产物构建pACYC-3V质粒。连接体系为10*buffer lul ;连接接酶lul; PACYCDuet-1 5ul; 3V 3ul。 4'C连接过夜。取5jxl连接产物， 加入200^1感受态细菌，轻轻混匀冰浴静置30分钟。将管放入预加温至42。C的循环 水浴中，恰恰放置90秒，置于冰上2分钟。加入200ul37'C预温的LB培养液，37。C振 荡(200rpm)培养1小时。将转化产物涂于含有lOOPg/ml氯霉素的LB培养板上，37 'C倒置培养过夜。结果平板可见细菌生长，符合预期。
五. 提取pACYC-3V质粒
挑转化后的单菌落，接种到含氯霉素抗生素的LB培养基中，培养基量为4ml，于 37°C、 300rpm/分振摇过夜。将振摇过夜的培养基以10， OOOXg的转速离心5分钟， 倒掉上清，将试管倒置于纸巾上尽量吸干培养液。按照TAKARA质粒提取说明书操作， 提取pACYC-3V质粒。将上述提取的质粒送三博远志生物技术公司测序，测序结果正确。
实施例3:双表达质粒pACYC-3V和PET-MC转化入大肠杆菌BL21
一.共转染
双质粒等体积混合共lOul， lOul质粒加入到装有200ul感受态细胞的管中，轻轻旋转几次混匀内容物，放冰中30分钟。将管放入预加温至42t:的循环水浴中，放置90S， 不要摇动。快速将管移到冰浴中，使细胞冷却2分钟。加入无抗性的LB培养基200ul。 在37'C振荡培养1小时。然后涂板于含氯霉素和KANA霉素的平板中。将平板置于室 温至液体吸收。倒置平皿，于37'C培养16小时。结果，培养基可见菌落生长，符合预 期结果。
二. 提取质粒
挑转化后的单菌落，接种到含氯霉素和KANA霉素的LB培养基中，培养基量为 10ml，于37'C、 300rpm/分振摇过夜。将振摇过夜的培养基以10, OOOXg的转速离心 5分钟，倒掉上清，将试管倒置于纸巾上尽量吸干培养液。加入250ul细胞重悬液， 剧烈振荡，使细胞完全悬浮。加入250ul细胞裂解液，颠倒混匀4次，室温孵育大约 5分钟。加入10ul碱性蛋白酶，颠倒混匀4次，室温孵育大约5分钟。加入350ul 中和液，立即颠倒混匀4次。以12， OOOXg的转速离心15分钟。以12， OOOXg的转 速离心15分钟。将液体移入提取柱中，避免混入白色的沉淀物。在室温下，以最大转 速离心1分钟，从收集管中取出提取柱，倒掉滤出液。将提取柱重新插入收集管中。 加入700ul洗柱液(事先己用95%ethonal溶解)到柱中。在室温下，以最大转速离心 1分钟，从收集管中取出提取柱，倒掉滤出液。将提取柱重新插入收集管中。再次加 入700ul洗柱液，重复以上洗步骤。在室温下，以最大转速离心2分钟。将提取柱移 入到一个新的，无菌的1.5ml离心管中，小心不带入洗柱液。加入50ul无内切酶的水 于柱中，洗脱质粒，在室温下，以最大转速离心1分钟。DNA洗脱后，取出提取柱。 放入一2(TC保存。电泳结果显示，符合预期。
三. 已转化质粒的诱导和表达；超声碎菌提取病毒样颗粒
取1个单菌落接种到含氯霉素和KANA抗生素的LB液体培养基中，培养基量为4ml， 于37。C、 300rpm/分振摇过夜。取过夜培养的菌液40UL于10ML的液体培养基中，振 摇培养2小时40分钟，测OD值为0. 6时加入IPTG至终浓度为lmmol/ml 。37。C 、300rpm/ 分振摇培养16小时。取3ml菌液于4'C， 14000rpm，离心2分钟。用PBS液洗涤3次， 然后加入超声处理液250UL悬浮。应用超声进行碎菌。4'C， 14000rpm，离心10分钟。 分别取上清20UL分别加入DNase和RNase5UL,放入37°C1小时。电泳结果显示，符合 预期结果。
四. 对双质粒表达病毒样颗粒进行超离和透析
将表达产物悬液称重量，按1 g表达产物加0. 6g Cscl2的比例，将Cscl2加入到悬
12液中，应用TI90离心转头2rC56300rmp离心20个小时.超离后，从液面开始慢慢将液 体吸出，lml装1管，然后时行电泳.将有条带的管混合，用超声处理液透析过夜。双质 粒表达病毒样颗粒超离后结果，集中中在2， 3， 4管。见图3。 五.验证VLP颗粒，RT-PCR.
1. 实验设计上游引物M300RT-S:5， GGATTTGTATTCACGCTCACC3''
下游引物Overlap-A-2: 5， TCCCTGGTATGGACATGCTGAGCTC3，； Overl邻-A-1 5， TGTTGGGTATGCATCGTTCTTTTTG3'
2. 逆转录首先95。C5分钟裂解病毒样颗粒，释放RNA，应用引物Overlap-A-l 进行逆转录。逆转录体系MM-LV-Buffer 5ul， MM-LV lul， dNTP lul， 3V-SIXRNA 5ul， Overlap-A-l 1 ul， DEPC水 13ul，总i十25ul， 42。C水浴一小时。
3. PCR扩增
上游引物M300RT-S:5， GGATTTGTATTCACGCTCACC3，， 下游引物Overl邻-A-2: 5， TCCCTGGTATGGACATGCTGAGCTC3， 循环参数94°C 3min; 94°C 30s， 53-63°C 30s， 72°C lmin (35个循环)；72°C 10min。结果见图4。结果分析l为阴性对照，2、 3为病毒样颗粒未裂解，3， 4为病 毒样颗粒裂解但未RT。 6、 7、 8、 9、 IO为为病毒样颗粒裂解并RT-PCR后。
4. 将PCR产物克隆到pGEM-T easy载体上
按说明书操作将PCR产物与pGEM-T Vector连接。4° C连接过夜。取5jxl连接产 物，加入10(VLtoplO感受态细菌，轻轻混匀冰浴静置30分钟。将管放入预加温至42 'C的循环水浴中，恰恰放置90S，不要摇动.置于冰上2分钟。加入200ul37。 C预温的 LB培养液，37° C振荡(200rpra)培养1小时。将转化产物涂于含有100化/ml氨苄青 霉素的LB培养板(含lmol/1 IPTG 4^1， 20mg/ml X-gal 上，37° C倒置培养
过夜。结果见到蓝白斑生长。
5. 提取TA克隆，电泳结果见图5，符合预期结果。将上述质粒4， 5送三博公司 测序。测序结果(SEQ ID No. 1):
GAGGCTTCATGATTGGACCAAGAACTTTTGGGGATGATCTGAATAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGC
菌种保藏信息本发明实施例3构建的含有双表达质粒pACYC-3V和PET-MC的大 肠杆菌菌株命名为pACYC-dnet-1-ET-28b,保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微 生物中心(地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保 藏日期为2008年3月31日，建议的分类名为大肠埃希氏菌^sc力en'c力^ coh'，保藏 号为CGMCC No. 2425。实施例4:病毒样颗粒稳定性实验
试剂上海科华丙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒
仪器lightcycle
样本用20%新生牛血清将病毒样颗粒稀释至含量约10 000/ML、 100 000/MU 1 000 000/ML，每个浓度的制备量为10ml。按0. 1%的终浓度加入硫柳汞。然后进行分装，每 管分装量为100ul。
不同含量样本稳定性检测放置条件_
放置条件_放置时间_
37°C，相对湿度60 80% 3天
2周 4周
_^_
室温(20 25°C，相对湿度20 25%) 3天
2周 4周
_^_
2 8°C 3天
2周 4周
_^_
70°C (对照) 长期保存
按上表放置，每种条件下放置3支，在规定的时间点将其放置在 7(TC，实验结 束后一同上机检测。以 7(TC冻存样本做对照。 PCR结果见图6-图8，结果稳定。序歹lj表
<110>卫生部北京医院
〈120〉 一种可产生包装大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统
〈130〉
〈160〉 1
<170〉 Patentln version 3.3
〈210> 1
<211> 2145
<212> 画
〈213〉 人工合成
〈400〉 1
cccccacagt3cc3a^g3tcttcttggttggtattattgtagctcctctttattgttgg60
gtatgcactgttctttttgataagccataccacatttctga犯aaggaggacttcccatt120
gtatggacatgctgagctcacccctgatgaggcttcatgattggacc犯gaacttttggg180
g3tg已tctgsattttctcaaaatggtttattctgctcagtQggtgtttcagttcttcata240
gtcgttg3aatcccctgggtaacag3ggtcattggctggsttggccttctccactatgta細
agaccattccgccatgctttacatgcttaggataatggcctctcttgttc360
ttgctcgcaaacataacacttgctgtaacttatcgcaccgtttctacaggttagctaacg420
agtgtgcgcaagtatt已已gtg柳tggtcatgtgtggcggctcactatatgttaaaccag480
gtggaacatcatccggtgatgctacaactgcttacgctaatagtgtcgttaacatttgtc540
gagctgttacagccaatgtsaatgcgcttctttcaactgeitggtaat犯gatagctgaca600
agtatgtccgcaat c t acaacacaggctctatgagtgtct3gggstgUg660
atcatgaattcgtggatgaattttacgcttacctgcacct3C3cacctcagcgttgatat720
犯已gttc犯gactgsaggattatgtgttgacataccaggcalacc已a已gga_c3tg￡iccta780
ccgtagactc￡LtCtCt8tg￡Ltgggtttcaa已atgaatt已ccsagtc犯tggttaccctaa840
tatgtttatcacccgcgaagaagctattcgtcacgttcgtgcgtggattggctttgatgt900<formula>formula see original document page 17</formula>
权利要求
1. 一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统，其特征在于由质粒PET-MC和质粒pACYC-X组成，其中pET-MC由pET-28(b)整合噬菌体MS2成熟酶蛋白和衣壳蛋白cDNA构建而成，pACYC-X由PACYCDuet-1整合噬菌体MS2的19mer包装位点和目的RNA的cDNA组成。
2. 根据权利要求1所述的一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达 系统，其特征在于所述pACYC-X为pACYC-3V质粒。
3. 根据权利要求2所述的一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达 系统，其特征在于所述pACYC-3V质粒表达包装位点和3种病毒的嵌合体序列。
4. 根据权利要求3所述的一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达 系统，其特征在于所述3种病毒的嵌合体序列为SARS-Cov(SARS-CoVl、SARS-CoV2、 SARS-CoV3)、 一段HCV和二段H5N1 (M300和HA300)。
5. 双表达质粒pACYC-3V和PET-MC系统，其特征在于存在于大肠杆菌菌株 pACYC-dnet-l-ET-28b中，该大肠杆菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微 生物中心(地址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保 藏日期为2008年3月31日，建议的分类名为大肠埃希氏菌^c/zen'cWa co仏保藏号 为CGMCCNo,2425。
6. 根据权利要求5所述的双表达质粒pACYC-3V和PET-MC系统，其特征在于 表达序列表SEQ IDNo.l所述的核苷酸序列。
7. 大肠杆菌菌株pACYC-dnet-l-ET-28b，其特征在于含有双表达质粒 pACYC-3V和PET-MC系统，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(地 址北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏日期为2008 年3月31日，建议的分类名为大肠埃希氏菌五w/^n'c/n'a co//，保藏号为CGMCC No.2425。
全文摘要
本发明涉及一种可产生包装大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统，属于生物技术领域。一种可表达含大片段RNA病毒样颗粒的双质粒表达系统，由质粒PET-MC和质粒pACYC-X组成，其中pET-MC由pET-28(b)整合噬菌体MS2成熟酶蛋白和衣壳蛋白cDNA构建而成，pACYC-X为PACYCDuet-1整合噬菌体MS2的19mer包装位点和目的RNA的cDNA构建而成。发明的优点是本发明构建的双质粒系统表达的病毒样颗粒内含长片段RNA。我们把不同病毒要扩增的目的片段构建在一起，形成嵌合体，并包装入病毒样颗粒内，这种病毒样颗粒就可以作为对同一个标本进行多个病毒的同时检测时可应用的多靶核酸标准品和质控品，既节省了成本，也减化了操作程序。
文档编号C12N15/62GK101503700SQ20081008969
公开日2009年8月12日 申请日期2008年4月14日 优先权日2007年11月30日
发明者瑞 张, 李金明, 杨昌梅, 王露楠, 巍 邓, 魏玉香, 魏葆珺 申请人:卫生部北京医院