治疗乳腺癌的药物及其专用反义寡核苷酸的制作方法

专利名称：治疗乳腺癌的药物及其专用反义寡核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗乳腺癌的药物及其专用反义寡核苷酸。
技术背景POKEMON是一种新发现的致癌基因，它能够导致其它致癌基因发作，最终促 使肿瘤形成。POKEMON可以使癌细胞获得抗老化和死亡的能力，因此被称为癌症 的"总开关"。非常重要的一点是细胞内Pokemon的缺失不会对细胞的正常生长造成 影响，这就为设计低副作用的特异性抗癌药物提供了可能。Izant和Weintraub于1984年首次提出反义技术，所谓反义技术就是根据核酸间 结合碱基互补原理，用人工合成或生物合成的特定互补的反义核酸或它们的化学修 饰物与细胞内的核酸相互作用以抑制或封闭其表达。恶性肿瘤的发生与细胞内某些 癌基因的激活或某些抑癌基因的失活或缺失有关。反义核酸能特异地阻断癌基因激 活后的过度表达而不影响其他基因的正常功能，目前利用反义技术设计出与有害基 因、突变基因、非正常表达基因及其mRNA互补的反义核酸，以封闭这些基因或抑 制其表达。而反义核酸治疗肿瘤的研究主要在肿瘤细胞株、荷瘤动物和肿瘤患者三 个水平上进行应用。目前ISIS3521、 ISIS5132、 ISIS2503、 G3139、 GEM231等已进 入临床试验阶段。 发明内容本发明的目的是提供一种治疗乳腺癌的药物及其专用反以寡核苷酸。 本发明所提供的反义寡核苷酸是，抑制POKEMON基因表达的反义寡核苷酸， 其分子式为5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3，其中，x均指硫代磷酸酯键；y均指磷酸二酯键；A均指2'-脱氧腺苷；T均指2'-胸苷；C均指2'-脱氧胞苷；G均指2'-脱氧鸟苷。本发明所提供的治疗癌症的药物是含有上述反义寡核苷酸的药物。 所述药物以上述反义寡核苷酸为有效成分。 所述药物是治疗癌症，特别是治疗乳腺癌的药物。所述药物可通过经脉或皮下给药治疗；所述药物可通过局部给药治疗。 所述给药治疗可与放射疗法结合或与化学疗法结合治疗疾病。所述给药治疗的用药剂量范围是50-100nmol/L。本发明的反义寡核苷酸可有效降解MCF — 7细胞内POKEMON基因的mRNA， 降低其在mRNA和蛋白水平的表达，并使细胞生长阻断在G2/M周期，进而诱导肿 瘤细胞凋亡。本发明的以反义寡核苷酸为有效成分的药物是一种有效的治疗乳腺癌 的基因治疗药物。


图1为反义核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4对POKEMON-GFP融合蛋白 的抑制效果图2为在MCF-7细胞内反义核苷酸ANP4对Pokemon的mRNA的抑制效果 图3为在MCF-7细胞内反义核苷酸ANP4对Pokemon和P53蛋白水平的抑制效果图4A为反义核苷酸ANP0对MCF-7细胞生长的影响。 图4B为反义核苷酸ANP4对MCF-7细胞生长的影响。 图4C为反义核苷酸ANP0对HepG-2细胞生长的影响。 图4D为反义核苷酸ANP4对HepG-2细胞生长的影响。
具体实施方式
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 实施例l 、 POKEMON基因反义寡核苷酸的获得 1、 POKEMON基因反义寡核苷酸的设计利用工作站(www.bioinfo.rpi.edu.cn/applications/mfold)对POKEMON基因 (NM_015898)的mRNA的二级结构进行了预测。针对POKEMON基因的阅读框 架，结合其二级结构设计了含有18个核苷酸的反义寡核苷酸序列ANP1、 ANP2、 ANP3、ANP4,并以与人任何基因都不具有同源性的18个核苷酸序列ANP0作为对照。ANPO: 5，AxTxGxTxAyGyTyCyGyTyCyTyGyCyCxTxAxGx3，(式I );ANPh 5， CxCxAxCxGyCyCyGyCyCyGyGyCyCyAxTxCxTx3，(式II);ANP2: 5， CxGxCxTxGyAyCyGyAyAyGyTyCyGyAxTxCxTx3，(式III);ANP3: 5， GxGxCxCxCyGyGyCyCyCyAyTyAyGyAxAxGxTx3，(式IV);ANP4: 5， TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx3，(式V); 其中，式I至式V中，x均指硫代磷酸酯键；y均指3， 5磷酸二酯键；A均指2'-脱氧腺苷；T均指2'-胸苷；C均指2'-脱氧胞苷；G均指2'-脱氧鸟苷。反义寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4可以于POKEMON基因的mRNA 形成DNA/RNA杂化双链，其可以被RNaseH酶识别、降解。2 、固相合成POKEMON基因反义寡核苷酸根据上述反义寡核苷酸ANPO、 ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4分子式,以及对照 ANPO核苷酸序列，以a位带硫代磷酸酯键的dNTP作为原料,用标准的DNA自动合 成仪合成反义寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4和对照寡核苷酸ANPO。将上 述制备得到的反义寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4和对照寡核苷酸ANPO分 别经HPLC纯化，经紫外分光光度计定量，具体方法为用贝克曼库尔特 (Beckmancoulter)公司的DU800紫外分光光度计精确测定寡核苷酸的浓度，光径 10mm的比色杯中，单链寡核苷酸在260nm处的消光系数是20ng/ml/lOD.在光径 10mm的lOOpl微量比色杯，加入98|il纯净水，在260nm和280nm两个波长处的定 零，然后加入2pl寡核苷酸并混匀，在260nm和280nm两个波长处测溶液的光吸收,纯 的寡核苷酸的A260/A280的比值在1.8至2.0之间，此时在260nm所测的OD值就 是寡核苷酸的浓度0ig/^tl)。上述反义寡核苷酸购自上海生工生物工程技术服务有限 公司。用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测寡核苷酸的纯度，实验采用的条件是缓冲溶液 为Tris(三羟甲基氨基甲垸)--硼酸一EDTA,及凝胶浓度30%的变性聚丙酰胺凝胶，通 过分子筛效应电泳分离合成的寡核苷酸及其合成失败的序列，采用银染色法显色呈现 分离的图谱,该电泳分离方法可以分离仅有一个核苷酸差异的寡核苷酸序列,加上灵 敏的银染色法显色技术,能够有效地检测到合成失败的序列.结果显色图谱上仅有一 条显色条带，表明纯化后的反义寡核苷酸纯度均高于99%。实施例2、反义寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4对pEGFP-POKEMON 融合蛋白的抑制效果实验.1、 POKEMON与pEGFP的融合质粒的构建从人宫颈癌HeLa细胞(购自美国典型培养物保藏中心，ATCC number: CCL-2) 中克隆得到POKEMON的阅读框架片段，将其亚克隆到pEGFP-N2报告质粒中。具 体方法如下所述1)细胞培养人子宫癌(Hda)细胞(购自美国典型培养物保藏中心,ATCC)用含体积分数为 10%的胎牛血清，100u/ml青霉素和100u/ml链霉素及0.2 %NaHC03的DMEM培养 液，在37'C、体积分数为5%的(:02条件下常规培养。DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液非常适合于许多哺乳动物细 胞培养，是由无机盐组分、氨基酸组分、维生素组分等组成，其具体配方为每L培 养基中含有200.00 mg CaCl2， 0.10 mg Fe(N03)3.9H20， 400.00 mgKCl， 97.67 mgMgS04， 6400.00 mgNaCl， 3700.00 mg NaHC03， 125.00 mg NaH2P04-H20， 4500mg 葡萄糖，15.00mg酚红(Phenolred) ， llOmg丙酮酸钠(SodiumPyruvate) ， 84.00 mg L-精氨酸盐酸盐(L-Arginine-HCl) ， 63.00 mg L-胱氨酸二盐酸盐(L-Cystine 2HC1) ， 584.00 mgL-谷氨酰胺(L-Glutamine) ， 30.00 mg甘氨酸(Glycine) ， 42.00 mg L-半胱氨酸盐酸盐水合物(L-Histidine HC1-H20)， 105.00 L-异亮氨酸(L-Isoleucine) ， 105.00 mg L-亮氨酸(L-Leucine) ， 146.00 mg 赖氨酸盐酸盐(L-Lysine-HCl) ， 30.00 mgL-蛋氨酸(L-Methionine) ， 95.00 mgL-苏氨酸(L-Threonine) ， 16.00 mgL-色氨酸(L-Tryptophan) ， 104.00 mg L-Tyrosine 2Na 2H20， 94.00 mg L國缬氨酸(L-Valine) ， 4.00mg D-泛酸钙(D-Ca pantothenate)， 4.00mg氯化胆碱(Choline Chloride) ， 4.00mg叶酸(Folic Acid) ， 7.20mg肌醇(i-Inositol)，4.00mg烟酰胺(Niacinamide)，4.00mg维生素B6(盐酸卩比多辛，Pyridoxine HC1)， 0.40mg维生素B2(核黄素，0.40)， 4.00mg盐酸硫胺(Thiamine HC1) ， pH 值7.2-7.4。2) 细胞总RNA的提取取出步骤l)培养得到的人子宫癌(Hela)细胞，吸去培养液(悬浮细胞需要离 心)，用适量PBS洗涤，加入lmlTRizol液，混匀，室温放置5min，吸出培养瓶内 的液体转移到1.5ml无Rase酶EP管内，每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，混匀， 室温放置2-3min。在12， 000g (2-8°C)离心15min。吸取水相于另一只1.5ml的EP 管内，加入等体积的异丙醇，室温放置lmin。在12， 000g (2-8°C)离心10min，此 时有RNA沉淀产生，弃去上清，加200-500ul70。/。乙醇洗涤后，在7500g(4"C)离 心5 min.吸掉乙醇，用小Tip吸干液体。沉淀自然干燥5-10分钟，DEPC处理水20-30ul 加入，用枪打匀，55-60。C水浴10分钟让总RNA完全溶解，测OD值得到人子宫癌 (Hela)细胞总RNA。3) RT-PCR克隆Pokemon以步骤2)得到的人子宫癌(Hela)细胞总RNA进行反转录，反应体系20ul， 包括Oligo(dt)l ul，人子宫癌(Hela)细胞总RNA 1 ug, DEPC水，置于7(TC5min， 然后置于冰上5min,加入DEPC水,5x缓冲液4 ul， 25mM MgCL24 ul，加入10mM dNTPl ul, RNA酶抑制剂20U和反转录酶1 ul,25。C5min,42T:60min，于70°C 15min终 止反应，得到cDNA。结束后以cDNA作为模版进行PCR。Pokemon基因上游引物5'陽CTTAAGCTTGCCACCATGGCCGGCGGCGTGG-3'， 下游引物5'-CATGATATCGGCGAGTCCGGCTGTGAAGTTAC-3'。 PCR反应体系物各10umol/L,5X缓冲溶液10ul， 2mM dNTP 5 ul,甜菜碱和 DMSO各5 ul， 1 ul cDNA， 2.5U/LPrimer star聚合酶1 ul，总体系50 ul。 PCR循环 条件98。C变性10s， 70。C复性10s， 72。C延伸lmin， 40个循环。把所得PCR产物在70v，进行琼脂糖电泳，30rnin后，胶置于紫外灯下照射， 小心把DNA片段切下转入到1.5mlEP管内，称重EP管，近似确定体积。假设胶的 密度为lg/ml，于是凝胶的体积可通过如下方法的得到如凝胶薄片质量为0.2g，则 体积为0.21111，然后加入等体积的NJ缓冲液，把混合物置于55-65'C水浴中lOmin.， 至胶完全溶解混合均匀。将胶溶解后转移到胶回收柱内，8000g离心lmin，用SPW 缓冲液重复洗涤2次，最后加入DNA洗脱液将PCR产物洗下，10， OOOg离心lmin。 DNA产量计算把抽提样品稀释20倍，在260nm和280nm下测OD值。DNA浓度 =八26。><5(^稀释倍数。4) POKEMON与pEGFP的融合质粒的构建将步骤3)得到的PCR产物用五coi V和/^'w/in双酶切与州'"^III和Smfl I双酶 切后的pEGFP-N2连接得到POKEMON与pEGFP的融合质粒；具体方法如下所示① 将步骤3)得到的PCR产物的酶切PCR产物的酶切为45 ul体系，回收DNA 0.5ug， 4.5 ul 10xbuffer K,0.15 ul HindIII (1.5U/ p1),0.15 ul EcoRV(15U/ n1)，15.2 ul H20， 37"C酶切3小时。② pEGFP-N2质粒酶切和产物纯化回收取12plpEGFP-N2质粒，6 jxllOxbuffer M， 6nlHindHI， 5(ilNaAc (3mMPH5.2) ， 150ul乙醇于-20。C10min， 10， OOOg离 心5min,弃上清，沉淀加入55plTE溶解。结束后再加入55 pl TE溶解液，8^1 10xbuffer T， 8 pl BSA， 6 pi Sma I ， 1 pl磷酸酶(CIAP) , 37。C酶切3小时酶切。 酶切结束后，加入等体积NJ缓冲液，8000g， lmin，再加入SPW液8000g，lmin重复 一次，最后加入DNA洗脱液，10， OOOg，lmin.最后得酶切纯化产物。③ 酶切纯化PCR产物和质粒pEGFP-N2的连接连接体系为40ul， 2 pi pEGFP-N2 (HindIII， Smal ) ， 34plPCR纯化产物(HindIII， EcoRV)，置于56。C水浴4min,冰上5min.再加入2 pl T4连接缓冲液，1 |il 50mM ATP, 0.5 pl T4连接酶，16。C连 结过夜。④ 感受态细胞的制备及连接产物的转化取过夜JM109菌液800 ul， 3000g离心 5min,弃上清，加入5(Hd新鲜LB培养基，用枪吹打均匀，然后加入2^1质粒液Upg/Hl)和2pl的CaCl2，冰上放置30min， 42。C水浴热休克60-120s，结束后， 放置于冰上2-3min，加入lmlLB液，然后再摇床上摇45min,结束后，在3000g离 心5min，除去部分上清液，剩余大约100 pl左右液体，加入12^1 AMP，滴加平板上进行涂布，正向平板放置30min,然后倒置平板7-8小时。⑤挑克隆并小提阳性克隆细胞在20个LB平板底部标上1， 2， 3， 4....20。取 20只中型离心管，每管加入1.5ML含有(60jng/mL)卡那霉素的LB培养基，用已 经灭菌的牙签分别挑取上述连接产物转化后长出的不同菌落在标有数字的平板上划 线(必须一一对应)，划线后的牙签放置于中型的离心管内(也必须是管号和平样 板上的数字一一对应)，划线后的培养皿37。C过夜或放置10小时，中型离心管摇床 上过夜(37°C)或者把摇床上培养过夜的液体转移到新的小离心管内，在3000g离 心6min，弃上清液体，沉淀提取质粒，用5awHI酶切鉴定，筛选连接正确的质粒。 将5amH I酶切鉴定正确的质粒进行测序结果表明，我们己经克隆得到POKEMON 阅读框架序列，并正确地装进pEGFP-N2质粒中,将测序表明正确的含有POKEMON片 段的重组质粒命名为pEGFP-N2-POKEMON。pEGFP-N2-POKEMON质粒经转染进入 细胞中，可表达Pokemon-GFP融合蛋白。2、反义寡核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4对POKEMON-GFP融合蛋白的 抑制效果以脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作为转染试剂,将反义寡核苷酸ANP1 、 ANP2、ANP3、ANP4和对照寡核苷酸ANPO(浓度均为40nmol/L)与融合质粒pEGFP--NrPOKEMON共转染猴肾成纤维COS-7细胞(购自美国典型培养物保藏中心ATCC number: CRL-1651) ， 24h检测荧光强度。具体方法如下所述1) pEGFP-N2-POKEMON质粒和反义核苷酸共转染取指数生长期的COS-7细胞，于37'C,包含有10%胎牛血清，青霉素100mg/ml 和链霉素100mg/ml的DMEM培养基，在5% C02的培养箱中培养。细胞转染前一 天，细胞用胰酶消化并用无抗生素的培养基悬浮，以每孔lxl()S个COS-7细胞的密 度铺入24孔板内继续培养24小时。培养24小时后，将实施例1制备的反义核苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4 和ANP0分别以终浓度均为40nmol/L加入50^1无双抗的优化培养基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司产品)中混匀静止5min得到浓度均为 40nmol/L的ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4和ANP0溶液,同时取2.5^1脂质体 Lipofectamine-2000加入另外一个含有48.5^1无双抗的优化培养基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司产品)中混匀静止5min，结束后将上述 配制的稀释后的脂质体分别与反义苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4或ANP0溶液 等体积混合，分别同时补加0.4吗的pEGFP-N2-POKEMON质粒，然后分别将混和 液按照10(^1 /孔的量加入到上述铺入COS-7细胞的24孔板内。以ANP0与pEGFP-NrPOKEMON质粒共转染细胞做对照组，检测上述实验组和对照组培养24h 后的荧光强度。上述步骤l)的处理的实验结果如图l所示，结果表明，在C0S-7细胞内，共转 染pEGFP-N2-POKEMON和ANP0、 ANP1、 ANP2、 ANP3或ANP4反义核苷酸。通过 荧光显微镜观察，发现四种的反义核苷酸对Pokemon的抑制存在显著差异。从图l中 可看到ANP2 (图1中C)和ANP4 (图1中E)荧光强度弱于ANP1 (图1中B)和ANP3 (图1中D)的荧光强度，这说明ANP2和ANP4抑制效率比ANP1和ANP3的抑制效率 高。使用Image-proplusv5.02对荧光强度进行分析计算，ANP2和ANP4对pEGFP-N2-POKEMON表达的POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效率分别是74n/。和78n/。，同样说 明，ANP2和ANP4对POKEMON-GFP融合蛋白的抑制效率比ANP1和ANP3的抑制效 率高，并且ANP4抑制效率最高，将抑制效率最高的ANP4被确定为内源效应的研究 序列。其中，图l中A为对照(ANP0)与pEGFP-NrPOKEMON质粒共转染结果，B为 ANP1与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染结果，C为ANP2与pEGFP-N2-POKEMON 质粒共转染结果，D为ANP3与pEGFP-N2-POKEMON质粒共转染结果，E为ANP4与 pEGFP-NrPOKEMON质粒共转染结果。实施例3、反义寡核苷酸对POKEMON基因表达mRNA的影响以Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作为转染试剂，将反义寡核苷酸ANP4 (浓度 为100nmol/L)转染到MCF-7细胞(购自美国典型培养物保藏中心,ATCC number: HTB-22)中，具体方法如下所述取指数生长期的MCF-7，分别用包含有质量百分含量为10%胎牛血清，青霉素 100mg/ml和链霉素100mg/ml的DMEM培养基，于37"C， 5% <:02的培养箱中培养。细 胞转染前一天，细胞用胰酶消化并用无抗生素的DMEM培养基悬浮，以每孔lx105 个/细胞密度铺入24孔板内继续培养24小时。培养24小时后，将5jLil浓度为2pmol/L的反义核苷酸ANPl、 ANP2、 ANP3、 ANP4 或ANP0分别加入45^L无双抗的优化培养基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO/BRL公司产品)中混匀静止5min得到反义核苷酸ANPl、 ANP2、 ANP3、 ANP4或ANP0溶液，同时取2.5ixlLipofectamine-2000加入另外一个含有48.5pl无双抗 的优化培养基(Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, GIBCO / BRL公司产品)中混 匀静止5min得到脂质体溶液，结束后把脂质体溶液分别与反义苷酸ANP1、 ANP2、 ANP3、 ANP4或ANP0溶液等体积混合，然后分别将混和液按照100pl/孔的量加入到 上述铺入MCF-7细胞的24孔板内，继续培养24h或48h，以上述转染ANP0反义核苷酸的细胞做对照组。转染48小时后，分别用RT-PCR检测转染细胞中的POKEMON基因mRNA含量， 具体方法如下所述(1)取出转染后的MCF-7细胞，吸去培养液，用适量PBS洗涤，加入lmlTRizol 液，混匀，室温放置5min，吸出培养瓶内的液体转移到1.5ml无Rase酶EP管内。每管 加入0.21111氯仿，剧烈震荡15s，混匀，室温放置2-3min。在12， OOOg (2画8。C)离心 15min。吸取水相于另一只1.5ml的EP管内，加入等体积的异丙醇，室温放置lmin。 在12， OOOg (2-8°C )离心10min，此时有RNA沉淀产生。弃去上清，加200-500ul 70% 乙醇洗涤后，在7500g(4")离心5min.吸掉乙醇，用小Tip吸干液体。沉淀自然干燥 5-10分钟，DEPC处理水20-30ul加入，用移液枪打匀，55-6(TC水浴10分钟让总RNA 完全溶解，测OD值计算总RNA浓度。(2)半定量RT-PCR:反应体系20pl，包括Oligo(dT)l 上述提取的转染后的 MCF-7细胞总RNA 1 |ig,补加DEPC水至5pl，置于7(TC5min.置于冰上5min,然后，加 入DEPC水4.5p1, 5x转录缓冲液4pl， 25mMMgCl24 pl，加入10mM dNTPl RNA酶 抑制剂(40U4U) 0.5jxl和反转录酶l |xl， 25。C5min,42。C60min,于70。C15min终止反应，得 至lJcDNA。以上述得到的cDNA作为模版，以半定量Pokemon基因上游引物 5'-TGCAAGGTCCGCTTCACCAG-3'，下游引物5'-GGCTGTGAAGTTACCGTCG GTG-3'，内参GAPDH的上游引物5'-CAACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'，下游 引物5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGG-3为弓|物进行PCR扩增。PCR扩增体系为Pokemon和GAPDH的上、10 nmol/L下游引物各为2pl， 5XPrimer star缓冲溶液5ul， 2mMdNTP2n1,， 1 |ilcDNA， 2.5U/LPrimer star聚合酶0.5 ul，水7.5pl， 总体积20ul。半定量Pokemon的PCR循环条件98。C变性10s， 60。C复性10s， 72。C延伸40s， 24 个循环，GAPDH的PCR循环条件98。C变性10s, 60。C复性10s， 72。C延伸30s， 22个 循环。PCR产物跑l。/。的琼脂糖胶，经溴化吡咬(Ethidium Bromide)染色。拍照后， 图片可用Quantity One软件分析。结果如图2所示，结果表明转染反义寡核苷酸ANP4的细胞中POKEMON基因 mRNA含量为未转染细胞中的40X。结果表明反义寡核苷酸ANP4对POKEMON基因 mRNA具有明显的降解作用。其中，图2中A中的0代表ANP0， 1代表ANP1， 2代表 ANP2， 3代表ANP3， 4代表ANP4;图2中B中+代表正常MCF-7细胞， 一代表ANPO。实施例4、反义寡核苷酸对POKEMON蛋白表达水平的影响 按照实施例3的方法以脂质体Lipofectamine2000 (Invitrogen)作为转染试剂，将 反义寡核苷酸ANP4 (浓度为100nmol/L)转染到MCF-7细胞(购自美国典型培养物 保藏中心，ATCC保藏编号HTB-22)中，转染48小时后用Westem-blot检测 POKEMO蛋白表达水平，具体方法为如下所述取6孔板内反义核苷酸ANP4转染48h的MCF-7细胞，用胰酶室温消化3-5min， 用PBS洗涤于2000rpm,离心5min,弃上清，视沉淀的量加入合适体积(约30-50 ^) TNE (10mmol/L， 150mMNaCl， 0.5%NP-40, lmM)裂解液置于冰上裂解30min。 裂解液在10(TC水浴煮10min，上等量蛋白跑10%聚丙烯酰胺电泳，100v， 3h。电泳 结束后，通过半干转膜仪，在10v， 25min，将蛋白转移到膜上。转膜结束后，加入 丽春红S染色，确定转膜的效果。用自来水洗去丽春红，将转膜分为两组，每组三个 凝胶孔，分别加入抗Pokemon抗体(多抗，购自Sigma公司，1: 4000稀释)或者抗P53 抗体(单抗，购自Santa Cruz公司，h 500稀释)。分别用一抗室温孵育lh或4。C过夜， 一抗孵育结束后，用TBST洗涤3次，每次5min,然后，孵育过Pokemon抗体的膜放入 加辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗(1: 2000稀释)的TBST中，孵育过P53抗体的 膜放入加山羊抗小鼠二抗(1: 2500稀释)的TBST中，分别室温孵育2h,孵育结束后 同样用用TBST洗涤3次，每次5min。然后用Super Signal WestPico Chemiluminesent底 物试剂盒的试剂显影，并在暗室中用x光片感光5min。结果如图3所示，结果表明，转染反义寡核苷酸ANP4的细胞中POKEMON蛋 白表达水平较未转染细胞中具有明显降低，表明反义寡核苷酸ANP4对POKEMON基 因蛋白表达具有明显的抑制作用。由于ANP4对POKEMONP表达具有明显的抑制作 用，解除了POKEMONP对P53表达的抑制作用,导致POKEMON下游基因P53表达增 高,P53在蛋白水平升高。其中，图3中A为在MCF-7细胞内反义核苷酸ANP4对 Pokemon蛋白水平的抑制效果；图3中B为在MCF-7细胞内反义核苷酸ANP4对P53蛋 白水平的增高效果。图3中A和B中"一"均为ANP0; ANP4均代表反义核苷酸ANP4。实施例4、流式细胞仪检测反义寡核苷酸ANP4对人乳腺癌细胞MCF-7和肝癌 HepG-2细胞(购自美国典型培养物保藏中心,ATCC number: HB 8065)的作用以Lipofectamine 2000 (Invi加gen)作为转染试剂，将反义寡核苷酸ANP4 (浓 度为100nmol/l)或ANP0(浓度为100nmo1/1)分别转染到MCF-7细胞或肝癌HepG-2 细胞中，转染48小时后，用流式细胞PI单染的方法检测MCF-7细胞周期的变化， 具体方法如下所述取24孔板内反义核苷酸ANP4转染48h的MCF-7细胞或肝癌HepG-2细胞(实验组)和ANPO转染48h的MCF-7细胞或肝癌HepG-2细胞(对照组)，于PBS中 洗2次，然后500 ul加入70%乙醇并混匀，于4度下固定2h。检测时标本lOOOr/min 离心5min,弃上清液，400 ul PBS重悬5min。以300目筛网过滤细胞悬液以除去成团 的细胞群，再于1000r/min下离心5分钟，弃上清液。加入PI染液200 ul/管，4度 下避光30分钟。把液体转移到流式管内并加400ulPBS。利用流式细胞仪测定细胞 内DNA分布情况，单光束，激发波长为488nm。结果如图4所示，在100nmol/L ANP4分别转染MCF-7和HepG-2细胞,通过流 式细胞仪检测由图可发现(图4B和图4D) ， MCF-7和HepG-2细胞的G2/M期DNA 百分比分别增加2.6%和10%，同时G。/G!期DNA含量也分别增加1.92%和4.21%。 我们结果显示药物作用Pokemon基因后，导致细胞发生细胞周期阻滞，特别是在 G2/M期。而目前广泛认为，细胞在从G2/M期阻滞退出的过程中或之后,部分细胞发 生凋亡,部分未凋亡的细胞则直接进入"分裂期死亡(mitotic death)"，而对照组没有达 到该效果，说明以ANP4为有效成分的药物可以有效治疗乳腺癌和肝癌，特别是对 乳腺癌具有非常好的疗效。图4为用流式细胞仪检测ANP4对MCF-7和HepG-2(购 自美国典型培养物保藏中心，ATCC number: HB 8065)细胞生长的影响图，用流式细 胞仪检测细胞的荧光，横轴代表荧光强度，纵轴代表细胞数量。其中，图4A和图 4B代表AMCF-7细胞，图4C和图4D组代表HepG-2细胞，图4A和图4C细胞用 10Onmol/L寡核苷酸ANPO处理，作为对照组，图4B和图4D细胞用10Onmol/L寡核 苷酸ANP4处理，作为实验组。
权利要求
1、一种抑制POKEMON基因表达的反义寡核苷酸，其分子式为5’TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3’其中，x均指硫代磷酸酯核苷间键；y均指磷酸二酯核苷间键；A均指2’-脱氧腺苷；T均指胸苷；C均指2’-脱氧胞苷；G均指2’-脱氧鸟苷。
2、 含有权利要求1所述的反义寡核苷酸的药物。
3、 根据权利要求2所述的药物，其特征在于所述药物为以权利要求l所述的反义寡核苷酸为有效成分的治疗癌症的药物。
4、 根据权利要求3所述的药物，其特征在于所述癌症为乳腺癌。
5、 根据权利要求4所述的药物，其特征在于所述药物通过经脉或皮下给药治疗。
6、 根据权利要求5所述的药物，其特征在于所述药物通过局部给药治疗。
7、 根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述给药治疗与放射疗法结合。
8、 根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述给药治疗与化学疗法结合。
全文摘要
本发明公开了一种治疗乳腺症的药物及其专用反以寡核苷酸。该其反以寡核苷酸的分子式为5′TxTxCxAxGyGyTyCyGyTyAyGyTyTyGxTxGxGx 3′，其中，x均指硫代磷酸酯核苷间键；y均指磷酸二酯核苷间键；A均指2′-脱氧腺苷；T均指胸苷；C均指2′-脱氧胞苷；G均指2′-脱氧鸟苷。该治疗乳腺症的药物是以所述反以寡核苷酸为有效成分的药物。本发明的以上述反义寡核苷酸为有效成分的药物可有效治疗人乳腺癌。
文档编号C12N15/11GK101275134SQ20081008905
公开日2008年10月1日 申请日期2008年4月15日 优先权日2007年4月20日
发明者楠 张, 蒋宇扬, 谢振华 申请人:清华大学深圳研究生院