用于检测乳腺癌易感基因snp的引物、荧光探针及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测乳腺癌易感基因SNP的引物、荧光探针及应用。所提供引物及对应的荧光探针组，分别针对rs1219648、rs13281615、rs2046210、rs3803662、rs8051542、rs3817198和rs889312进行快速基因分型，应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用性，特别适用于中国地区乳腺癌高危人群的大规模筛查。
【专利说明】用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物、荧光探针及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体地指一种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物、 荧光探针及应用。
【背景技术】
[0002] 乳腺癌是全世界女性最常见的癌症之一，在中国女性癌症中发病率更是高居首 位。根据卫生部发布的数据来看，我国乳腺癌的发病率仍有上升趋势。而在美国等发达国 家，乳腺癌的发病率和死亡率却在不断下降，这不仅是因为诊断和治疗水平的提高，更重要 的是采取了早期筛查。乳腺癌的常见筛查包括自我检查、B超检查、X射线检查等。这些检 查方法都是建立在乳腺癌已经发生的基础上，如果能在乳腺癌还没发生之前进行筛查，找 出乳腺癌高危人群，可以极大程度的减少乳腺癌的发生和死亡，例如肿瘤标志物检测和乳 腺癌易感基因检测。
[0003] 大量科学研究表明，某些基因的基因状态与乳腺癌的发生密切相关，这些基因叫 做易感基因，例如BRCA基因，该基因变异的人群患乳腺癌的概率为87%，而正常人群患乳 腺癌的概率为12%。BRCA基因的变异能显著增加乳腺癌的患病概率，因此通过检测BRCA 基因的基因状态能够找出乳腺癌的高危人群，然后针对性的进行预防。好莱坞明星安吉丽 娜?朱莉检测到自己BRCA基因变异后，通过切除乳腺的方法将乳腺癌的患病概率由87%降 到5%。
[0004] BRCA基因在白人特别是犹太人中变异较多，而在中国人群中变异非常少，不适合 于在中国人群中进行乳腺癌高危人群的筛查。上海瑞金医院郑伟教授发现 ESR1基因以及 其他基因与中国女性乳腺癌患病概率显著相关，而且在中国人群中变异频率较高，更适合 在中国人群中做乳腺癌高危人群的筛查。
[0005] 检测易感基因的常见方法有限制性酶切法、多重PCR、测序、芯片检测和荧光定量 PCR。目前最简单的方法是PCR-RFLP，其主要原理是通过应用特异性限制性内切酶消化PCR 扩增产物,并根据消化位点是否消失来判断其变异存在与否。但该方法操作复杂，样本量多 时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性 结果，可靠性低。多重PCR方法尽管特异性有所提高，但是这种方法的原理仍然是基于普通 PCR的原理，低引物特异性以及低保真Taq酶等这些因素均可造成对结果的影响。DNA测序 法虽然是目前进行基因诊断的金标准，但步骤繁琐，过程复杂，试剂价格昂贵，容易出现样 本间的交叉污染而导致测序失败；另外测序仪的装备也超出了一般临床检验实验室的承受 范围。芯片检测更适合高通量基因检测，不适合几个基因的检测。而荧光定量PCR中的高 分辨率熔解曲线法是一种快速，简便，经济，实用的分型方法，但基因分型依赖于仪器温度 控制的精密性，假阳性高。荧光定量PCR中的Taqman探针的方法采用特异性的荧光标记的 探针，特异性强，灵敏度高且操作方便，快速。该方法同样被认为是SNP分型的金标准，在临 床应用的前景值得期待。其基本原理是：应用一对双荧光标记的Taqman探针，分别针对双 等位SNP的不同基因型，只有完全匹配的探针扩增出各自的基因型；用两种荧光染料FAM， HEX (VIC)分别标记这两种探针，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位点的基因型判 定。所以该方法中引物长度，探针长度，引物特异性，探针特异性对检测结果的特异性和敏 感性非常重要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物、荧光探针及应 用。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供的第一组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以 下简称第一组引物），所述引物为如下引物对：
[0008] (1)正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0009] 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0010] (2)由正向引物F-01或反向引物R-01的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0011] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含 rsl219648SNP 位点。
[0012] 本发明还提供了一组与第一组引物配合使用的荧光探针（以下简称第一组探 针），所述荧光探针包括如下两条：
[0013] 1-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示；
[0014] 1-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示；
[0015] 所述卜A探针及1-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 1-A探针的5'端报告基团与1-G探针的5'端报告基团不同。
[0016] 其中，5' 端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R〇X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的突光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限于上述基团。
[0017] 优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0018] 本发明还提供上述第一组引物和/或第一组探针在制备rsl219648SNP位点多态 性的检测试剂盒中的应用。
[0019] 本发明提供的第二组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下简称第二组引 物），所述引物为如下引物对：
[0020] (1)正向引物F-02,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示；
[0021] 反向引物R-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0022] (2)由正向引物F-02或反向引物R-02的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0023] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含rsl32 81615 位点。
[0024] 本发明还提供了一组与第二组引物配合使用的荧光探针（以下简称第二组探 针），所述突光探针包括如下两条：
[0025] 2-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示；
[0026] 2-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；
[0027] 所述2-A探针及2-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 2~A探针的5'端报告基团与2-G探针的5'端报告基团不冋。
[0028] 其中，5' 端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基团。
[0029] 优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0030] 本发明还提供上述第二组引物和/或第二组探针在制备rsl3281615SNP位点多态 性的检测试剂盒中的应用。
[0031] 本发明提供的第三组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下简称第三组引 物），所述引物为如下引物对： >
[0032] (1)正向引物F-03,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示；
[0033] 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示；
[0034] (2)由正向引物F-03或反向引物R_〇3的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0035] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含 rs2046210SNP 位点。
[0036] 本发明还提供了一组与第三组引物配合使用的荧光探针（以下简称第三组探 针），所述荧光探针包括如下两条：
[0037] 3-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 11所示；
[0038] 3-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO· 12所示；
[0039] 所述3-A探针及3-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 3-A探针的5'端报告基团与3-G探针的5'端报告基团不同。
[0040] 其中，5,端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R〇X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限于上述基团。
[0041] 优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0042] 本发明还提供上述第三组引物和/或第三组探针在制备rs2046210SNP位点多态 性的检测试剂盒中的应用。
[0043] 本发明提供的第四组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下简称第四组引 物），所述引物为如下引物对：
[0044] (1)正向引物F-04,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 13所示；
[0045] 反向引物R-04,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 14所示；
[0046] (2)由正向引物F-04或反向引物R-〇4的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0047] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含 rs3803662SNP 位点。
[0048] 本发明还提供了一组与第四组引物配合使用的荧光探针（以下简称第四组探 针），所述荧光探针包括如下两条：
[0049] 4-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0· 15所示；
[0050] 4-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示；
[0051] 所述4-A探针及4-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 4- A探针的5,端报告基团与4-G探针的5'端报告基团不同。
[0052] 其中，5,端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基团。
[0053] 优选地,5'端标记的报告基团为FAM或VIC, 3'端标记的灾光淬灭基团为MGB。
[0054] 本发明还提供上述第四组引物和/或第四组探针在制备rs3803662SNP位点多态 性的检测试剂盒中的应用。
[0055] 本发明提供的第五组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下简称第五组引 物），所述引物为如下引物对： _
[0056] (1)正向引物F-05,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 17所示；
[0057] 反向引物R-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；
[0058] (2)由正向引物F-05或反向引物R-05的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0059] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含 rs8051542SNP 位点。
[0060] 本发明还提供了一组与第五组引物配合使用的荧光探针（以下简称第五组探 针），所述荧光探针包括如下两条：
[0061] 5-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 19所示；
[0062] 5-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示；
[0063] 所述5-A探针及5-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有焚光泮灭基团，且 5- A探针的5'端报告基团与5-G探针的5'端报告基团不同。
[0064] 其中，5,端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限于上述基团。
[0065] 优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0066] 本发明还提供上述第五组引物和/或第五组探针在制备rs8051542SNP位点多态 性的检测试剂盒中的应用。
[0067] 本发明提供的第六组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下简称第六组引 物），所述引物为如下引物对：
[0068] (1)正向引物F-06,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 21所示；
[0069] 反向引物R-06,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 22所示；
[0070] (2)由正向引物F-06或反向引物R_〇6的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0071] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含 rs3817198SNP 位点。
[0072] 本发明还提供了一组与第六组引物配合使用的荧光探针（以下简称第六组探 针），所述荧光探针包括如下两条：
[0073] 6-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν〇· 23所不；
[0074] 6-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示；
[0075] 所述6-A探针及6-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 6- a探针的5,端报告基团与6-G探针的5'端报告基团不同。
[0076]其中，5,端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、J 〇E、VIC、R0X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基团。
[0077] 优选地，5,端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0078] 本发明还提供上述第六组引物和/或第六组探针在制备rs3817198SNP位点多态 性的检测试剂盒中的应用。
[0079] 本发明提供的第七组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物（以下简称第七组引 物），所述引物为如下引物对： _
[0080] (1)正向引物F-07,其核苷酸序列如SEQ ID N0. 25所示；
[0081] 反向引物R-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示；
[0082] (2)由正向引物F-07或反向引物R-〇7的核苷酸序列经增力P、缺失或替换单个核苷 酸得到的引物；
[0083] 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含 rs889312SNP 位点。
[0084] 本发明还提供了一组与第七组引物配合使用的荧光探针（以下简称第七组探 针），所述荧光探针包括如下两条：
[0085] 7-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 27所示；
[0086] 7-C探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 28所示；
[0087] 所述7-A探针及7-C探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有劳光萍灭基团，且 7- A探针的5'端报告基团与7-C探针的5'端报告基团不同。
[0088] 其中，5' 端标记的报告基团可选自：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、R〇X、Cy3、Cy5、 MAR、JUP、SAT、PLU或NEP，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB,且不限于上述基团。
[0089] 优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0090] 本发明还提供上述第七组引物和/或第七组探针在制备rs889312SNP位点多态性 的检测试剂盒中的应用。
[0091] 本发明提供的第八组用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物组（以下简称第八组引 物），所述引物组包括上述第一至第七组引物：
[0092] 1)正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0093] 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；
[0094] 2)正向引物F-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示；
[0095] 反向引物R-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0096] 3)正向引物F-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
[0097] 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 10所示；
[0098] 4)正向引物F-04,其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 13所示；
[0099] 反向引物R-04,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示；
[0100] 5)正向引物F-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO· 17所示；
[0101] 反向引物R-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示；
[0102] 6)正向引物F-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO· 21所示；
[0103] 反向引物R-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示；
[0104] 7)正向引物F-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO· 25所示；
[0105] 反向引物R-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
[0106] 本发明还提供了一组与上述第八组引物配合使用的荧光探针组（以下简称第八 组荧光探针），所述荧光探针组包括如下探针： _
[0107] 1) 1-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 3所示；
[0108] 1-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 4所示；
[0109] 2)2-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 7所示；
[0110] 2-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 8所示匕
[0111] 3) 3-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 11 f示；
[0112] 3-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 12所示上
[0113] 4)4-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· I5 示；
[0114] 4-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 16所示上
[0115] 5) 5-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 19 f示；
[0116] 5-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0· 20所示上
[0117] 6) 6-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν〇· 23所示；
[0118] 6-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID N0.24所示上
[0119] 7) 7-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν〇· 27所示；
[0120] 7-C探针，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0. 28所示； 一
[0121] 所述1-Α探针及1-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 1- A探针的5,端报告基团与1-G探针的5'端报告基团不同；一
[0122] 所述2-A探针及2-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 2- A探针的5,端报告基团与2-G探针的5'端报告基团不同；
[0123] 所述3-A探针及3-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有突光泮灭基团，且 3- A探针的5,端报告基团与3-G探针的5'端报告基团不同；
[0124] 所述4-A探针及4-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有劳光泮灭基团，且 4- A探针的5,端报告基团与4-G探针的5'端报告基团不同；
[0125] 所述5-A探针及5-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标i己有·劳光泮灭基团，且 5- A探针的5,端报告基团与5-G探针的5'端报告基团不同；一
[0126] 所述6-A探针及6-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且 6- A探针的5,端报告基团与6-G探针的5'端报告基团不同；
[0127] 所述7-A探针及7-C探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有劳光泮灭基团，且 7- A撕的5,端报告細与74探雜5'端报告基团不同。 「01281苴中，5,端标记的报告基团可选自： ^ ^ p，且不限于上述基团；3'端标记的荧光淬灭基团可选自：TAMRA、 Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL、MGB，且不限于上述基团。
[0129] 优选地，5'端标记的报告基团为FAM或VIC，3'端标记的荧光淬灭基团为MGB。
[0130] 本发明还提供了一种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的荧光定量PCR试剂盒，包括 Taq酶、dNTPs、Mgcl2、10XPCR buffer、R0X参比荧光、超纯水及及第八组引物、第八组荧光 探针。需要说明的是，关于上述各个试剂、引物、荧光探针的用量，以及PCR的时间、温度参 数设置均为常用技术手段，是本领域技术人员可以根据实际情况来调整的，不用以限制本 发明。PCR buffer为市售产品。
[0131] 此外，本发明虽然只提供了包括第一组至第七组引物及对应荧光探针联用的组 合，但是第一组至第七组引物中任意几种的组合及应用，或与对应荧光探针的联用也应该 视为本发明的保护范围。
[0132] 本发明还提供了一种检测乳腺癌易感基因 SNP多态性的方法，该方法是利用第八 组引物、第八组荧光探针，针对人基因组DNA进行荧光定量PCR反应，根据反应过程产生的 荧光信号区分相应SNP位点的多态性。
[0133] 上述引物、荧光探针可以应用于华法林个体化用药的相关检测中。
[0134] 本发明能快速精确进行乳腺癌易感基因 SNP位点基因分型，通过提取人的唾 液或外周血白细胞基因组DNA，采用Taqman探针的方法，可在一次检测中测定受试者的 rsl219648、rsl3281615、rs2046210、rs3803662、rs8051542、rs3817198 和 rs889312 七个 SNP位点的基因型。TaqMan探针技术的原理主要是，在TaqMan探针法的PCR反应体系中， 包括一对PCR引物和一对探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。 探针的5'端标记有报告基因，3'端标记有荧光淬灭基团，当探针完整的时候，报告基因所发 射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号，随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程 中遇到与模板结合的探针，其3'_5'外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基 团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。用两种不同荧光染料（如FAM，HEX、VIC)分别标 记这一对探针，针对双等位SNP的不同基因型，就可以在一次PCR反应中完成对单个SNP位 点的基因型判定。在该方法中引物长度，探针长度，引物特异性，探针特异性对检测结果的 特异性和敏感性非常重要，所以需要合理的设计引物及多次科学验证才能得到较好的引物 及探针。
[0135] 本发明的有益效果：提供了一种快捷的乳腺癌易感基因 SNP的分型试剂及应用， 本发明设计了特异性引物和探针，并优化了反应体系和反应组分浓度，能够准确地对目的 基因进行基因分型。应用本发明获得的检测结果精确可靠，且成本较低，具有较好的实用 性。特别适用于中国地区乳腺癌高危人群的大规模筛查。
【专利附图】
【附图说明】
[0136] 图1为本发明实施例中SNP分型结果rsl219648AA基因型的PCR荧光分析图；
[0137] 图2为本发明实施例中SNP分型结果rsl219648AG基因型的PCR荧光分析图；
[0138] 图3为本发明实施例中SNP分型结果rsl219648GG基因型的PCR荧光分析图；
[0139] 图4为本发明实施例中SNP分型结果rsl3281615AA基因型的PCR荧光分析图；
[0140] 图5为本发明实施例中SNP分型结果rsl3281615AG基因型的PCR荧光分析图；
[0141] 图6为本发明实施例中SNP分型结果rsl3281615GG基因型的PCR荧光分析图；
[0142] 图7为本发明实施例中SNP分型结果rs2〇46210AA基因型的PCR荧光分析图；
[0143] 图8为本发明实施例中SNP分型结果rs2〇46210AG基因型的PCR荧光分析图；
[0144] 图9为本发明实施例中SNP分型结果rs2〇46210GG基因型的PCR荧光分析图；
[0145] 图10为本发明实施例中SNP分型结果rs38〇3662AA基因型的PCR荧光分析图；
[0146] 图11为本发明实施例中SNP分型结果rs38〇3662AG基因型的PCR荧光分析图；
[0147] 图12为本发明实施例中SNP分型结果rs38〇3662GG基因型的PCR荧光分析图；
[0148] 图13为本发明实施例中SNP分型结果rs8〇5l 542AA基因型的PCR荧光分析图；
[0149] 图14为本发明实施例中SNP分型结果rs8〇5l 542AG基因型的PCR荧光分析图；
[0150] 图15为本发明实施例中SNP分型结果rs8〇5l 542GG基因型的PCR荧光分析图；
[0151] 图16为本发明实施例中SNP分型结果rs38m98AA基因型的PCR荧光分析图；
[0152] 图17为本发明实施例中SNP分型结果rs38m98AG基因型的PCR荧光分析图；
[0153] 图18为本发明实施例中SNP分型结果rs8893l2AA基因型的PCR荧光分析图；
[0154] 图19为本发明实施例中SNP分型结果rs8893l2AC基因型的PCR荧光分析图；
[0155] 图20为本发明实施例中SNP分型结果rs8893l2CC基因型的PCR荧光分析图；
[0156] 图21为本发明实施例中测序结果的类型图。
【具体实施方式】
[0157] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0158] 实施例
[0159] 1、准备如下分别针对 rsl219648、rsl328l6l5、rs 2〇46210、rs3803662、rs8051542、 rs3817198和rs889312 SNP位点的引物和荧光探针：
[0160] 引物组：
[0161] 1)正向引物 F-01 :5 ' -GGAGTMATTACACATTCAG-3 '
[0162] 反向引物 R-01 :5 ' -TGTGGTAGCTGACTTCTATT-3 '
[0163] 2)正向引物 F-02 :5 ' -TGGMCTAAGTAGTCACAA-3，
[0164] 反向引物 R-02 :5 ' -TATMCATCAGCAGCATTC-3 '
[0165] 3)正向引物 F-03 :5 ' -CACCTCCACCTCCTAAAG-3 '
[0166] 反向引物 R-03 :5 ' -GGCMCAGMCMGACTC-3 '
[0167] 4)正向引物 F-04 :5 ' -TGTCATCCAAAGCACCMCTAT-3 '
[0168] 反向引物 R-04 :5 ' -CAGCAGGAGGGGCCCCTGGTGT-3，
[0169] 5)正向引物 F-05 :5 ' -MCATTGTCATTCCCAGT-3 '
[0170] 反向引物 R-05 :5 ' -CCTMTCGTGCTCTCATT-3 '
[0171] 6)正向引物 F-06 :5 ' -MGGGTCGCTGGCTACAAAG-3 '
[0172] 反向引物 R-06 :5 ' -CATGGCAGTGTTTCACAGGGT-3 '
[0173] 7)正向引物 F-07 :5 ' -TTATAAGAACACCAGTCATG-3 '
[0174] 反向引物 R-07 :5 ' -TTCCTAACACTCAGTACC-3 '
[0175] 探针组：
[0176] 1) 1-A 探针：FAM-ACTTGACACACACTCTTCAAGGA-MGB
[0177] 1-G 探针：VIC-ACTTGACACACeCTCTTCAAGGA-MGB
[0178] 2) 2-A 探针：FAM-TTCTGCCTMGGMTTCACTTCTG-MGB
[0179] 2-G 探针：VIC-TTCTGCCTAAGGQATTCACTTCTG-MGB
[0180] 3) 3-A 探针：FAM-ACAGGCGTGAACCACTGC-MGB
[0181] 3-G 探针：VIC-ACAGGCGTGAeCCACTGC-MGB
[0182] 4) 4-A 探针：FAM-TATAGCTGTCACTTAGCGAAGAA-MGB
[0183] 4-G 探针：VIC-TATAGCTGTC￡CTTAGCGAAGAA-MGB
[0184] 5) 5-A 探针：FAM-GTTATTAGAGGAAGCAGCACTAT-MGB
[0185] 5-G 探针：VIC-GTTATTAGAGGA￡GCAGCACTAT-MGB
[0186] 6) 6-A 探针：FAM-TCAAACTCTCAGCTCATTTCACT-MGB
[0187] 6-G 探针：VIC-TCAAACTCTCgGCTCATTTCACT-MGB
[0188] 7) 7-A 探针：FAM-TGACCTCATTTTACCTTAATTACCT-MGB
[0189] 7-C 探针：VIC-TGACCTCATTTTSCCTTAATTACCT-MGB
[0190] 将上述7组引物分别与对应的探针制备成混合液，混合液中引物浓度为18 μ mol/ L，荧光探针浓度为5μηιο?Α。
[0191] 2、准备PCR扩增体系：
[0192] 预备100个受检查人的DNA样本，并对每个DNA分别加入7组引物和探针的混合 液做7个PCR反应，来分别对每个SNP进行分型，所需试剂包括Taqman Genotyping Master Mix 5ul、ddH20 3. 5μ1、荧光探针和引物混合液0. 5μ1，其余为20ng/ul的受检查人DNA 样本1 μ 1,总体积10 μ 1。
[0193] 3、PCR扩增程序：
[0194] PCR 反应第一步：60°C、30s ;
[0195] PCR 反应第二步：95°C、10min ;
[0196] PCR 反应第三步：92°C、15s ;
[0197] PCR 反应第四步：60°C、90s ;
[0198] PCR反应第五步：循环第三步、第四步50次，然后60°C、30s。采用ABI St印one荧 光定量PCR仪（Applied Biosystems，美国应用生物技术有限公司）。
[0199] 4、实验结果：
[0200] PCR反应结束后，应用 Stepone software V2. 1 (Applied Biosystems，美国应用生 物技术有限公司）进行分析，将得到的100例结果进行分类，其结果类型如图1?20所示， 依据本发明的探针共分辨出20种基因型：SNP rsl219648三种基因型；SNP rsl3281615三 种基因型；SNP rs2〇46210三种基因型；SNP rs38〇3662三种基因型；SNP rs8051542三种基 因型；SNP rs38m98二种基因型（由于SNP rs38l7l98 C/C基因型占0.80%,出现几率很 低，未检测到样本）；SNP rs889312三种基因型。
[0201] 5、试剂盒的准确性分析
[0202]为验证试剂盒检测的准确性，对100例样本进行测序验证。
[0203] SNP rsl219648 A/A基因型有38例，A/G基因型有47例，G/G基因型为15例； [0204] SNP rsl328l615 G/G基因型为32例，A/G基因型有49例，A/A基因型有19例； [0205] SNP rs2046210 G/G基因型42例，A/G基因型46例，A/A基因型12例；
[0206] SNP rs3803662 A/A基因型为47例，A/G基因型有43例，G/G基因型有10例；
[0207] SNP rs8051542 A/A基因型有67例，A/G基因型有30例，G/G基因型3例；
[0208] SNP rs3817198 A/A 基因型 83 例，A/G 基因型 17 例；
[0209] SNP rs889312 C/C基因型25例，A/C基因型50例，A/A基因型25例。试剂盒检 测的准确性达到了 100%。测序结果的类型如图21所示。
【权利要求】
1. 一种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物、荧光探针及应用乳腺癌易感基因 SNP的 引物，所述引物为如下引物对： (1) 正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； (2) 由正向引物F-01或反向引物R-01的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得 到的引物； 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含rsl219648SNP 位点。
2. -种与权利要求1所述用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物配合使用的荧光探针， 所述荧光探针包括如下两条： 1-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； 1-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示； 所述1-A探针及1-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且1-A 探针的5'端报告基团与1-G探针的5'端报告基团不同。
3. 权利要求1所述引物和/或权利要求2所述荧光探针在制备rsl219648SNP位点多 态性的检测试剂盒中的应用。
4. 一种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物，所述引物为如下引物对： ⑴正向引物F-03，其核苷酸序列如SEQIDN0.9所示； 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示； (2)由正向引物F-03或反向引物R-03的核苷酸序列经增加、缺失或替换单个核苷酸得 到的引物； 上述引物以人基因组DNA或DNA片段为模板扩增所得DNA片段均包含rs2046210SNP 位点。
5. -种与权利要求4所述用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物配合使用的荧光探针， 所述荧光探针包括如下两条： 3-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示； 3-G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示； 所述3-A探针及3-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且3-A 探针的5'端报告基团与3-G探针的5'端报告基团不同。
6. 权利要求4所述引物和/或权利要求5所述荧光探针在制备rs2046210SNP位点多 态性的检测试剂盒中的应用。
7. -种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物组，所述引物组包括如下引物对： 1) 正向引物F-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 反向引物R-01，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示； 2) 正向引物F-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示； 反向引物R-02,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示； 3) 正向引物F-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示； 反向引物R-03,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示； 4) 正向引物F-04,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 13所示； 反向引物R-04,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示； 5) 正向引物F-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示； 反向引物R-05,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 18所示； 6) 正向引物F-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 21所示； 反向引物R-06,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 22所示； 7) 正向引物F-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 25所示； 反向引物R-07,其核苷酸序列如SEQ ID NO. 26所示。
8. -种与权利要求7所述用于检测乳腺癌易感基因 SNP的引物配合使用的荧光探针 组，所述突光探针组包括如下探针： 1) 1-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示； 1- G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示； 2) 2-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示； 2- G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示； 3) 3-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 11所示； 3- G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示； 4) 4-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 15所示； 4- G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示； 5) 5-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示； 5- G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示； 6) 6-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 23所示； 6- G探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 24所示； 7) 7-A探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 27所示； 7- C探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 28所示； 所述1-A探针及1-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且1-A 探针的5'端报告基团与1-G探针的5'端报告基团不同； 所述2-A探针及2-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且2-A 探针的5'端报告基团与2-G探针的5'端报告基团不同； 所述3-A探针及3-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且3-A 探针的5'端报告基团与3-G探针的5'端报告基团不同； 所述4-A探针及4-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且4-A 探针的5'端报告基团与4-G探针的5'端报告基团不同； 所述5-A探针及5-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且5-A 探针的5'端报告基团与5-G探针的5'端报告基团不同； 所述6-A探针及6-G探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且6-A 探针的5'端报告基团与6-G探针的5'端报告基团不同； 所述7-A探针及7-C探针的5'端标记有报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，且7-A 探针的5'端报告基团与7-C探针的5'端报告基团不同。
9. 一种用于检测乳腺癌易感基因 SNP的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：包括Taq 酶、dNTPs、Mgcl2、10XPCR buffer、ROX参比荧光、超纯水及权利要求7所述的引物组、权利 要求8所述的荧光探针组。
10. -种检测乳腺癌易感基因 SNP多态性的方法，其特征在于：该方法包括利用权利要 求7所述的引物组、权利要求8所述的荧光探针组针对人基因组DNA进行荧光定量PCR反 应，根据反应过程产生的荧光信号区分相应SNP位点的多态性。
【文档编号】C12Q1/68GK104232774SQ201410478348
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】徐谋胜, 黄淑君, 袁雅燕, 余亚军, 曹旸 申请人:湖北维达健基因技术有限公司