一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用，该芽孢杆菌芽孢杆菌H4已于2014年9月1日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心((简称CGMCC)，保藏号为：CGMCC NO.9629。其分类命名为：芽孢杆菌，拉丁名：Bacillus sp.H4。本发明中的芽孢杆菌H4是一种常见的嗜碱芽孢杆菌，且该菌种能够在低细胞浓度下对钙离子进行转化。CGMCC NO962920140901
【专利说明】一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，尤其涉及一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 混凝土因其具有牢固结实、耐久性高、价格相对低廉等特点成为应用最广泛的建 筑材料。随着现代混凝土技术与我国经济的快速持续的发展，混凝土被广泛应用于港口、大 坝、公路、桥梁、市政等现代化工程建设中。然而，钢筋混凝土结构由于受到物理、化学和生 物等因素的综合作用，即使结构设计合理、施工正确，随着使用年限的增加，几乎所有混凝 土建筑都会不可避免地出现微裂缝，其耐久性也随之受到影响而降低。如果不及时采取有 效处理措施，裂缝可能会进一步扩大，使得水、氧气、二氧化碳及氯化物等有害物质更容易 进入，从而造成材料由内至外的逐步劣化，最终导致混凝土内部的钢筋结构的腐蚀，使得整 体结构往往未达到预期寿命而破坏，由此导致修补、维护等问题亦日益突出。
[0003] 混凝土修复的方法主要分为化学法、物理法和生物法三大类。传统的物理和化学 修复方法在一定程度上能有效修复微裂缝，但仍存在修复时间长、效果不佳、修复过程难以 调控等诸多问题。近年来，利用微生物的矿化活性对混凝土裂缝进行修复逐渐成为新的研 究热点。在碱性条件下，微生物细胞的细胞壁包含大量诸如羧基、羟基、磷酸根等官能团使 得表层呈现负电荷，对溶液中的金属阳离子表现出极强的静电亲和力，细胞及细胞外聚物 (EPS)充当晶体异相成核界面并螯合阳离子（如Ca 2+、Mg2+等），有效降低晶体成核临界表 层自由能，诱导晶体成核、生长及聚集。将抗逆性微生物休眠体（如芽孢），固定或包覆于 诸如硅藻土、粘土陶粒、硅胶及微胶囊等载体中并与营养物质一起掺入混凝土，一旦裂缝形 成，水和空气进入裂缝诱导芽孢萌发形成营养细胞，活跃的细胞代谢利用营养物质产生二 氧化碳并进一步形成碳酸根，碳酸根在细胞表面或胞外多聚物诱导作用下与钙离子形成碳 酸钙。微生物诱导的碳酸钙形成已被证明能有效愈合混凝土裂缝、降低混凝土渗透性，强化 混凝土强度，延缓钢筋锈蚀，提高混凝土的耐久性。相比传统混凝土修复技术而言，利用生 物本身具有的矿化性能实现对混凝土的修复无疑是一种环境友好型的修复技术。
[0004] 利用矿化微生物修复混凝土裂缝具有修复效果好、处理费用低、无二次污染等特 点，但该修复技术的关键之一是获得高效钙离子矿化细菌。现在国内外学者已经逐步开始 对微生物的混凝土裂缝修复活性进行研究和流程设计，但是迄今为止大多数研究所采用的 菌株都是直接从菌种保藏机构购买，未经过严格的测试和筛选，因而矿化活性不高，难以有 效应用于混凝土裂缝的修复。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种耐高碱性的高效钙离子矿化细菌的芽孢杆菌及其用途。
[0006] 本发明的芽孢杆菌H4已于2014年9月1日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理 中心（简称CGMCC)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究 所；保藏号为：CGMCC NO. 9629。其分类命名为：芽孢杆菌，拉丁名：Bacillus sp. H4
[0007] 所述钙离子矿化菌H4,其保藏登记号为CGMCC NO. 9629,其16S rRNA基因核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述钙离子矿化菌H4菌落特征如下：菌落边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察 该菌体的形态为杆状，形成芽孢，运动；革兰氏染色阳性。
[0009] 本发明的一个方面，钙离子矿化菌芽孢杆菌H4在促进钙离子沉积为碳酸钙的应 用。
[0010] 本发明的一个方面，钙离子矿化菌芽孢杆菌H4在修复混凝土裂缝中的应用。
[0011] 所述钙离子沉积在20-37°C、pH 9. 0-11. 0下进行。
[0012] 本发明中的芽孢杆菌H4是一种常见的嗜碱芽孢杆菌，且该菌种能够在低细胞浓 度下对钙离子进行转化。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为不同菌株钙矿化活性的比较示意图。
[0014] 具体实施方法
[0015]以下将结合附图对本发明所涉及菌株的获取过程及菌株特点进行详细描述。
[0016] 芽孢杆菌H4的分离、纯化及保存
[0017] 所述钙离子矿化菌经富集和筛选纯化分离获得，具体步骤如下：富集培养：将红 树林沉积物土样Ig加入到LN-海水-碳酸钠培养液中，于30°C、150rpm摇床上振荡培养7 天。
[0018] 分离培养：吸取200 μ L富集培养液加于LN-海水-碳酸钠固体培养基平板表面， 用无菌涂布棒涂布均匀，接着用该涂布棒继续涂布3个LN-海水-碳酸钠固体培养基平板， 于30°C恒温培养箱中倒置培养7天。
[0019] 挑菌纯化：用接种环挑LN-海水-碳酸钠固体培养基平板生长的菌落在新鲜的 LN-海水-碳酸钠固体培养基平板上划线纯化3次。
[0020] 保存：将纯化获得的菌体一份接种于LN-海水-碳酸钠固体斜面培养基中，4°C保 存；同时另一份于15%甘油中保存于_80°C。
[0021] 所述LN-海水-碳酸钠培养基配方如下表：
[0022]
【权利要求】
1. 一株高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌，其特征在于：分类为芽孢杆菌属（Bacillus)，能够 在强碱性条件下高效地促进钙离子形成碳酸钙，菌种保藏编号为CGMCC NO. 9629, 2014年9 月1日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏。
2. 根据权利要求1所述高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌，其特征在于，所述矿化菌株菌落特 征为，边缘整齐，光滑湿润；透射电镜下观察该菌体的形态为杆状，形成芽孢，运动；革兰氏 染色阳性。
3. 根据权利要求1-2任意权利要求所述的高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌的应用，其特征在 于，所述的矿化菌株H4促进钙离子沉积为碳酸钙，用于修复混凝土裂缝。
4. 根据权利要求3所述高效钙矿化嗜碱芽孢杆菌的应用，其特征在于，在细胞浓度 为5X107个/ml时也能充分转化钙离子为碳酸钙，矿化菌H4的矿化作用在20-37°C、pH 9. 0-11. 0下进行。
【文档编号】C12R1/07GK104403959SQ201410478149
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月18日 优先权日:2014年9月18日
【发明者】邢锋, 邓旭, 张金龙, 韩宁旭, 刘冰, 邬荣珊, 谭珺榕 申请人:深圳大学