专利名称：来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种按植物密码子偏爱合成的来源于嗜碱菌(Alkaliphilusmetalliredigens)的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因及应用，特别具体涉及该5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的原核表达、纯化及其在转基因作物培育中的应用。
背景技术：
草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，广泛用于果园、胶园、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后处理，以及出苗后定向处理。1974年在美国注册登记以来，至今已在世界100多个国家注册，成为世界上使用面积最大的除草剂品种之一。但是该除草剂同样是一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用。为了在农业生产中使用草甘膦，必须培育出具有草甘膦抗性或者降解性的农作物。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine, glyphosate)毒性作用机理是竞争性抑制莽草酸途径中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性。该合成酶是植物和微生物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成过程中的一个关键酶，该酶由aroA基因编码。目前种植抗除草剂转基因作物的国家越来越多，面积也迅速增加，种植面积不断扩大，占全球种植转基因作物的78%以上。根据2002年资料表明，耐草甘膦大豆依旧是美国、阿根廷、加拿大、墨西哥、罗马尼亚、乌拉圭和南非等七国的主要商品化转基因农作物。耐草甘膦除草剂大豆在全球范围内种植3650万公顷，占全球总转基因农作物种植面积的62%。然而现在应用于生产的抗草甘膦基因仅有两个，且都受到专利的保护，因此发掘新型的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷 酸合成酶基因对于培育具有自主知识产权的抗草甘膦转基因作物将是非常有必要的。最近，来自于极端微生物体内的好多酶都已成为研究的热点，主要是因为微生物生长在极端环境中从而使这些酶可能具有潜在的特殊的生物功能。嗜碱菌(Alkaliphilusmetalliredigens)是一种革兰氏阴性菌,该菌能够在ρΗ=8· 0-11. O的碱性环境中生存。其全基因组测序已于2009年完成(NCBI Reference Sequence:NC_009633.1)在过去的几年时间里，很多来自该碱性微生物中的酶被分离出来并进行研究了。然而来自该菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶还从未研究过，也未见对该酶功能的研究报告。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种来源于嗜碱菌(Alkaliphilusmetalliredigens)的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因及其应用。所述的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO I所示，它是根据植物密码偏爱通过化学合成方法得到的。即采用大量重叠的引物通过两步 PCR 进行全基因的合成(PTDS) (Nucleic Acids Research，2004，32 :e98)。具体合成方法包括以下步骤引物设计设计长度大概为60bp左右的覆盖整个5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列44个，其中每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。PCR扩增利用PCR进行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶扩增。其中，在100 μ I反应体系中，Ρ2 Ρ43共42个引物的添加量为2ng，两个外侧引物Pl和P44的添加量为30ng，扩增条件为94°C预热 lmin，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶为 KODFXtaq酶(Toyobo公司，日本)，共25个循环。转化PCR结束后，用1%琼脂糖胶回收片段，取10 μ I直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4°C连接过夜，在DH5a感受态中高效转化，获得长度为1293bp的SEQ IDNol序列的阳性克隆，即为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，经序列测定，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。将上述获得的阳性克隆直接与原核表达载体pYM 4087 (Curr Microbiol,2011,62 :833-839)相连，4°C连接2小时。然后将该载体转化感受态大肠杆菌TOP 10(Invitrogen)0将菌液涂布于含有50 μ g/mL氨节青霉素的固体LB培养基(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7. 5) 37°C过夜培养。次日，挑取3-5个菌落，接种于50ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH=7. 5)中，37°C摇床直到菌液的浓度达到OD6tltl为1. O时停止培养。培养液在5，OOOg重力加速度下离心5min，无菌水清洗I次。所得的细胞沉淀用ImL磷酸裂解缓冲液重悬，然后将其转移到微量离心管中。使用超声波仪裂解菌液30min，以12，OOOg离心30min。用凝胶-蛋白纯化试剂盒HisTrap HP (Amersham Biosciences公司)对其进行蛋白表达纯化。然后对其进行酶动力学特性分析。采用蘸花法(Nature Protocol, 2006, (2) :641-646)将上述获得的5_烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因转入拟南芥，进行草甘膦萌发根长和草甘膦喷洒处理试验，结果表明本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因不仅具有较高的草甘膦抗性，而且还保持着与PEP较强的亲和性，因而说明该基因可应用于转化拟南芥中，这些特征为用于转基因作物的培育提供可能。本发明通过对所合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的动力学参数以及在植物中草甘膦抗性的研究，发现该酶可用于培育高耐受草甘膦的转基因作物。
图1为本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的SDS-PAGE电泳图，其中I为蛋白分子量MARKER，2为用HisTrap HP试剂盒纯化的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白，3代表在大肠杆菌BL21 (DE3)过量表达的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶蛋白。 图2为转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的拟南芥在含有不同浓度草甘膦(从左到右草甘膦浓度依次为0，200，500和1000 μ M)平板上的萌发实验，其中，Ami, Am3, Am4分别代表转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因的不同的拟南芥株系；CK代表对照。
图3为转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的拟南芥用15mM草甘膦喷洒处理7天后观察到的情况(Aml，Am3，Am4分别代表转本发明的5-烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶的不同的拟南芥株系；CK代表对照)。
具体实施例方式以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。实施例1按植物密码子偏爱化学合成的来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因根据来源于嗜喊菌(Alkaliphilusmetalliredigens)的 aroA 序列(NCBI Reference Sequence:NC_009633.1)米取连续延伸 PCR (Nucleic AcidsResearch, 2004，32，e98)按照植物密码子偏爱合成的5_烯醇丙酮莽草酸_3_磷酸合成酶基因，设计44对引物用于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的人工合成。所设计的引物如下
权利要求
1.一种按照植物密码子偏爱合成的来源于嗜碱菌Alkaliphilus metalliredigens的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。
2.根据权利要求1所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在大肠杆菌表达中的应用。
4.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在拟南芥转化中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，采用蘸花法将所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因转入拟南芥中。
6.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在转基因作物培育中的应用。
7.权利要求1或2所述的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因在高耐受草甘膦转基因作物培育中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种来源于嗜碱菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全长1278bp，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。经酶动力学特性分析和功能试验验证，本发明合成的该5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因具有较高的草甘膦耐受性，可用于转基因作物的培育中。
文档编号C12N15/82GK103060346SQ20121059234
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月31日 优先权日2012年12月31日
发明者田永生, 许晶, 彭日荷, 金晓芬, 韩洪娟, 韩静, 王波, 王丽娟 申请人:上海市农业科学院